Lichtblatt-basierte Fluoreszenzmikroskopie lebender oder fixiert und gefärbt

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Entwicklung von Tribolium castaneum-Embryonen über sehr lange Zeiträume hinweg nichtinvasiv zu beobachten. Die Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie trägt dazu bei, fragestellungen zur Morphogenese im aufstrebenden Insekten-Modellorganismus Tribolium castaneum zu beantworten, wobei Zellwanderungs- und Proliferationsmuster von der frühen Keimblase bis zum Beginn der Muskelbewegung untersucht werden. Der entscheidende Vorteil dieser Methode liegt darin, dass kritische Faktoren wie Photobleichen und Phototoxizität auf ein Minimum beschränkt bleiben, selbst wenn die Embryonen über mehrere Tage hinweg beobachtet werden.

Um ein Embryo mithilfe einer Agarose-Säule in die Probenkammer einzubringen, füllen Sie zunächst eine Ein-Millimeter-Spritze mit destilliertem Wasser und verbinden Sie die Spritze mittels eines kleinen Gummischlauchs mit einer Glas-Kapillare. Füllen Sie die Kapillare zur Hälfte mit destilliertem Wasser, übertragen Sie dann mit einem Pinsel einen Embryo an die innere Öffnung der Glas-Kapillare und stecken Sie die Kapillare langsam in die flüssige Agarose, wobei einige Mikroliter der Agarose zusammen mit dem Embryo in die Kapillare gezogen werden. Sobald der Embryo an Ort und Stelle ist, sollten sich jeweils einige Mikroliter Agarose oberhalb und unterhalb des Embryos befinden.

Wenn sich das Agarose verfestigt hat, verkürzen Sie die Kapillare auf eine Länge von etwa fünf Millimetern. Der verbleibende Fragmentteil sollte vollständig mit Agarose gefüllt sein, und das Embryo sollte sich im zweiten Quartal befinden. Setzen Sie dann den Stahlzylinder mit dem Stift in die Probenkammer ein und befestigen Sie das Kapillarfragment auf der Spitze des Stifts, sodass die Agarosesäule einige Millimeter aus dem Bereich des Kapillarfragments, der das Embryo enthält, herausragt.

Um das Embryo mithilfe einer Agarose-Halbkugel in die Probenkammer einzubetten, ziehen Sie zunächst 200 Mikroliter flüssiges Agarose in eine Ein-Milliliter-Spritze und füllen damit das Stahlrohr der Probenkammer von oben mit Agarose, bis sich an der unteren Öffnung eine Halbkugel bildet. Sobald das Agarose erstarrt ist, nehmen Sie ein Embryo mit der Spitze eines Pinsels auf und positionieren es so um, dass das vordere Ende zugänglich wird. Tauchen Sie die Agarose-Halbkugel in flüssiges Agarose, um sie mit einem dünnen Film zu überziehen, und platzieren Sie das Embryo mit seinem vorderen Ende senkrecht auf dem Pol der Agarose-Halbkugel.

Drehen Sie das Stahlrohr und korrigieren Sie bei Bedarf die Position des Embryos mit der Bürste. Ideal sollte weniger als die Hälfte der Embryooberfläche mit Agarose bedeckt sein, und die Flanken sollten so steil wie möglich sein. Zu viel Agarose auf der Oberfläche des Embryos führt zu einer mechanischen Einschnürung und einer verminderten Gasaustausch- und Ionenwechselrate, was sich dramatisch auf die Überlebensrate des Embryos auswirkt.

Danach langsam die Stahlröhre in die Probenkammer einführen. Um das Embryo mit einem Cobweb-Halter in der Probenkammer zu befestigen, zuerst mit dem Pinsel ein Embryo auswählen und den Pinsel beiseitelegen. Anschließend die geschlitzte Öffnung des Cobweb-Halters mit fünf bis acht Mikrolitern flüssigem Agarose bedecken, dann den größten Teil des Agarose entfernen, bis nur noch ein dünner Agarosefilm verbleibt.

Platzieren Sie das Embryo auf den Agarosefilm und justieren Sie seine Position sorgfältig, indem Sie das Embryo entlang der x-Achse in die Mitte der Schlitzöffnung verschieben und seine verlängerte anteriore-posteriore Achse mit der langgestreckten Achse der Schlitzöffnung ausrichten. Achten Sie darauf, das Embryo innerhalb von 10–15 Sekunden nach dem Auftragen auf den Agarosefilm zu platzieren, solange der Agarose noch flüssig ist, da es andernfalls nicht richtig haften wird. Setzen Sie danach den Cobweb-Halter langsam in die Probenkammer ein und positionieren Sie ihn so, dass er die Anregungs- und Emissionslichtstrahlen nicht beeinträchtigt.

Stellen Sie für Live-Bildgebungsanalysen zunächst die Zeitraffer-Aufnahme ein und positionieren Sie dann im Durchlichtmodus das Embryo entlang der X- und Y-Achse in die Bildmitte, ohne das Embryo dem Laser auszusetzen. Drehen Sie das Embryo in 90-Grad-Schritten um 360 Grad, um das Gewebe auf eventuelle Schäden, die während des Einbettungsprozesses entstanden sein könnten, zu überprüfen. Definieren Sie im Fluoreszenzmodus den Z-Stack für jede Richtung, indem Sie vor und hinter dem Embryo einen räumlichen Puffer von 25 bis 50 Mikrometer hinzufügen, und legen Sie den Z-Abstand fest.

Stellen Sie für Langzeit-Aufnahmen sicher, dass die Probenkammer mit ausreichend Imaging-Puffer gefüllt ist und verschließen Sie die Öffnung der Probenkammer. Starten Sie anschließend den Imaging-Prozess und überwachen Sie die korrekte Aufnahme in allen Richtungen und Kanälen für alle Embryonen. Entfernen Sie am Ende der Aufnahmephase den Probenträger aus der Probenkammer und überführen Sie den Embryo auf einen Objektträger.

Wenn eine Agarose-Säule verwendet wurde, die Embryonen mit einer scharfen Klinge aus der umgebenden Agarose herausschneiden. Wenn eine Agarose-Halbkugel verwendet wurde, die Halbkugel mit der flachen Seite auf den Objektträger übertragen. Bei der Spinnwebenhalter-Methode den Embryo mit einem Pinsel vorsichtig von dem Agarose-Film ablösen.

Anschließend das mit Embryonen beladene Objektträger in einer kleinen Glaswanne unter standardisierten Bedingungen in einer gesättigten Feuchtigkeitsatmosphäre inkubieren, bis die Larven schlüpfen. Um die Daten des beobachteten Embryos zu verarbeiten, öffnen Sie die gewünschten Dateien in der geeigneten Software zur Bildanalyse und drehen die Z-Stapel gegebenenfalls, sodass die anteriore-posteriore Achse des Embryos mit der Y-Achse ausgerichtet ist. Schneiden Sie die Z-Stapel entlang der X- und Y-Achse so zurecht, dass nur ein minimales Hintergrundsignal verbleibt, und berechnen Sie anschließend die Z-Maximalprojektion für jeden Z-Stapel.

Je nach transgener Linie und bildgebender Methode nehmen Sie dann die entsprechenden dynamischen Intensitätsanpassungen der Zeitstapel vor, um notwendigenfalls Photobleichen oder Schwankungen der Expression auszugleichen. Unter Verwendung einer transgenen Linie, die ein Histon-2B-M-Emerald-Fusionsprotein unter Kontrolle des Alpha-Tubulin-1-Promotors exprimiert, wurden 66 Stunden Entwicklung des Embryos bei Raumtemperatur – von der Keimbahnretraktion bis zur dorsalen Schließung – aufgezeichnet. Diese Enhancer-Trap-Linie kann verwendet werden, um neuronale Zellverbände in den Kopfanhängen sowie die Dynamik der Cirrosa-Migration während der dorsalen Schließung sichtbar zu machen.

Die Abbildung einer ähnlichen transgenen Linie, die dasselbe Transgen, jedoch an einer anderen genomischen Position trägt, zeigt in optischen Schnitten den Übergang von der Gastrulation zur Keimbandverlängerung und die innere Zellanordnung des entstehenden Keimbandes. Mithilfe der Glia-Blue-transgenen Linie ermöglicht die Aufnahme von Z-Stapeln in mehreren Richtungen durch Probendrehung die Beobachtung der Neuorganisation der Gliazellen entlang und um die ventrale Nervenstrang sowie deren Proliferationsdynamik an der dorsalen Seite der Kopflappen im selben Embryo. Auch kleine fluoreszierende Farbstoffe können zur spezifischen Markierung intrazellulärer Strukturen verwendet werden, um bestimmte embryonale Merkmale hervorzuheben, wie beispielsweise den Cirrus-Gar, die posterioren ventralen Cirrus-Zellen oder die aus drei Schichten bestehende Serosa-Amnion-Keimband-Gewebe-Struktur, die während des Schließens des Serosa-Fensters entsteht.

Die Färbung mit zwei fluoreszierenden Farbstoffen ermöglicht die zusätzliche Visualisierung von zwei intrazellulären Strukturen im selben Embryo. Beispielsweise des Aktin-Zytoskeletts und der nuklearen Hülle. Nach Beendigung der Aufnahme ist es wichtig, die Embryonen zur Qualitätskontrolle des Experiments zurückzugewinnen und zu gesunden, fruchtbaren Erwachsenen heranzuziehen.

Dieses Verfahren kann mit anderen Techniken wie dem elterlichen RNA-Unterschied kombiniert werden, um die Phänotypen nach einer Herunterregulation zu analysieren.