Lichtblatt-basierte Fluoreszenzmikroskopie lebender oder fixiert und gefärbt Tribolium castaneum Embry

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Entwicklung von Tribolium castaneum-Embryonen nicht-invasiv über sehr lange Zeiträume zu beobachten. Die lichtblattbasierte Fluoreszenzmikroskopie hilft bei der Beantwortung von Fragen zur Morphogenese im aufstrebenden Insektenmodellorganismus Tribolium castaneum und befasst sich mit Zellmigrations- und Proliferationsmustern vom frühen Blastoderm bis zum Beginn der Muskelbewegung. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass die kritischen Faktoren wie Photobleiche und Phototoxizität auf ein Minimum reduziert werden, selbst wenn die Embryonen mehrere Tage lang beobachtet werden.

Um einen Embryo mit einer Agarosesäule in die Probenkammer zu setzen, füllen Sie zunächst eine ein Millimeter große Spritze mit destilliertem Wasser und befestigen Sie die Spritze mit einem kleinen Gummischlauch an einer Glaskapillare. Füllen Sie die Kapillare zur Hälfte mit destilliertem Wasser, übertragen Sie dann mit einem Pinsel einen Embryo auf die Innenseite der Glaskapillaröffnung und stecken Sie die Kapillare in die flüssige Agarose, ziehen Sie langsam einige Mikroliter der Agarose zusammen mit dem Embryo in die Kapillare. Wenn der Embryo an Ort und Stelle ist, sollten sich einige Mikroliter Agarose sowohl über als auch unter dem Embryo befinden.

Wenn die Agarose erstarrt ist, kürzen Sie die Kapillare auf eine Länge von etwa fünf Millimetern. Das verbleibende Fragment sollte vollständig mit Agarose gefüllt sein und der Embryo sollte sich im zweiten Quartil befinden. Führen Sie dann den Stahlzylinder mit dem Stift in die Probenkammer ein und kleben Sie das Kapillarfragment auf den Stift. Die Agarosesäule sollte einige Millimeter aus dem Bereich des Kapillarfragments herausragen, in dem sich der Embryo befindet.

Um den Embryo mit einer Agarose-Halbkugel in die Probenkammer zu setzen, ziehen Sie zunächst 200 Mikroliter flüssige Agarose in eine 1-Millimeter-Spritze und füllen Sie mit der Spritze das Stahlrohr mit der Probenkammer von der Oberseite des Rohrs mit Agarose, bis sich an der unteren Öffnung eine Halbkugel bildet. Wenn die Agarose erstarrt ist, nehmen Sie einen Embryo mit der Spitze eines Pinsels auf und ordnen Sie den Embryo so an, dass das vordere Ende zugänglich wird. Tauchen Sie die Agarose-Halbkugel in flüssige Agarose, um die Halbkugel mit einem dünnen Film zu bedecken, und platzieren Sie den Embryo mit dem vorderen Ende aufrecht auf dem Pol der Agarose-Halbkugel.

Drehen Sie das Stahlrohr und verwenden Sie die Bürste, um die Position des Embryos bei Bedarf zu korrigieren. Idealerweise sollte weniger als die Hälfte der Embryooberfläche mit Agarose bedeckt sein und die Flanken sollten so steil wie möglich sein. Zu viel Agarose auf der Oberfläche des Embryos führt zu einer mechanischen Verengung und einem verminderten Gas- und Ionenaustausch, was sich dramatisch auf die Überlebensrate des Embryos auswirkt.

Führen Sie dann das Stahlrohr langsam in die Probenkammer ein. Um den Embryo mit einem Spinnwebenhalter in die Probenkammer zu montieren, wählen Sie zunächst einen Embryo mit dem Pinsel aus und legen Sie den Pinsel beiseite. Decken Sie dann das Langloch des Spinnwebenhalters mit fünf bis acht Mikrolitern flüssiger Agarose ab und entfernen Sie dann den größten Teil der Agarose, bis nur noch ein dünner Agarosefilm übrig bleibt.

Setzen Sie den Embryo auf den Agarosefilm und passen Sie seine Position vorsichtig an, indem Sie den Embryo in die x-Achsenmitte des Langlochs bewegen und seine längliche vordere hintere Achse mit der länglichen Achse des Langlochs ausrichten. Achten Sie darauf, den Embryo innerhalb von 10-15 Sekunden nach dem Auftragen auf den Agarosefilm zu legen, d.h. solange die Agarose noch flüssig ist, sonst haftet sie nicht richtig. Setzen Sie dann den Spinnwebenhalter langsam in die Probenkammer ein und positionieren Sie den Halter so, dass er das Anregungs- und Emissionslicht nicht stört.

Für Live-Imaging-Assays konfigurieren Sie zuerst den Zeitraffer und positionieren dann im Transmissionslichtmodus den Embryo entlang der X- und Y-Achse in die Mitte des Sichtfelds, ohne den Embryo dem Laser auszusetzen. Drehen Sie den Embryo um 360 Grad in 90-Grad-Schritten, um das Gewebe auf Schäden zu untersuchen, die während des Einlagerungsprozesses aufgetreten sein könnten. Definieren Sie im Floreszenzmodus den Z-Stapel für jede Richtung, indem Sie einen räumlichen Puffer von 25 bis 50 Mikrometern vor und hinter dem Embryo hinzufügen und den Z-Abstand definieren.

Für die Langzeitbildgebung ist darauf zu achten, dass die Probenkammer mit ausreichend Bildgebungspuffer gefüllt ist und die Öffnung der Probenkammer abdeckt. Starten Sie dann den Bildgebungsprozess und überwachen Sie die korrekte Aufnahme entlang aller Richtungen in allen Kanälen für alle Embryonen. Am Ende der Bildgebungsphase nehmen Sie den Probenhalter aus der Probenkammer und übertragen den Embryo auf einen Objektträger.

Wenn eine Agarosesäule verwendet wurde, verwenden Sie eine scharfe Klinge, um die Embryonen aus der umgebenden Agarose zu extrahieren. Wenn eine Agarose-Halbkugel verwendet wurde, übertragen Sie die Halbkugel mit einer flachen Seite auf den Objektträger. Für die Spinnwebenhalter-Methode verwenden Sie einen Pinsel, um den Embryo vorsichtig von der Agarosefolie zu lösen.

Dann inkubieren Sie den mit Embryo beladenen Objektträger in einer kleinen Glasschale in einer gesättigten Feuchtigkeitsatmosphäre unter normalen Bedingungen, bis die Larven schlüpfen. Um die Daten des beobachteten Embryos zu verarbeiten, öffnen Sie die gewünschten Dateien in der entsprechenden Bildgebungssoftware und drehen Sie die Z-Stacks, um die vordere hintere Achse des Embryos bei Bedarf mit der Y-Achse auszurichten. Schneiden Sie die Z-Stapel entlang der X- und Y-Achse so zu, dass nur ein minimaler Hintergrund übrig bleibt, und berechnen Sie dann die maximale Z-Projektion für jeden Z-Stapel.

Nehmen Sie dann, abhängig von der transgenen Linie und den Bildgebungsmodalitäten, die entsprechenden dynamischen Intensitätsanpassungen der Zeitstapel vor, um bei Bedarf Photobleich- oder Expressionsschwankungen der Flora zu korrigieren. Unter Verwendung einer transgenen Linie, die ein Histon-2B-M-Emerald-Fusionsprotein exprimiert, wurden unter der Kontrolle des Alpha-Tubublin 1-Promotors 66 Stunden Embryonalentwicklung bei Raumtemperatur von der Keimbandretraktion bis zum dorsalen Verschluss aufgezeichnet. Diese Enhancer-Trap-Linie kann verwendet werden, um neuronale Cluster innerhalb der Kopfanhänge und die Dynamik der Cirrosa-Migration während des dorsalen Verschlusses sichtbar zu machen.

Bei der Darstellung einer ähnlichen transgenen Linie, die das gleiche Trans-Gen, aber an einer anderen genomischen Stelle trägt, zeigen die optischen Schnitte des Übergangs von der Gastrulation zur Keimbandverlängerung die interne Zellanordnung der entstehenden Keimbande. Unter Verwendung der glia-blauen transgenen Linie ermöglicht die Erfassung von Z-Stacks in mehrere Richtungen mittels Probenrotation die Beobachtung der Reorganisation von Gliazellen entlang und um den ventralen Nervenstrang sowie deren Proliferationsdynamik der dorsalen Seite der Kopflappen im selben Embryo. Kleine fluoreszierende Farbstoffe können auch für die spezifische Markierung interzellulärer Strukturen verwendet werden, um bestimmte embryonale Merkmale hervorzuheben, wie z. B. die Zirrhose gar, die hinteren ventralen Zirrhosezellen oder die Trischicht des Serosa-Amnionen-Keimbandgewebes, die während des Verschlusses des Serosa-Fensters austritt.

Die zweifarbige Fluoreszenzfärbung ermöglicht die weitere Visualisierung von zwei interzellulären Strukturen im selben Embryo. Zum Beispiel das Aktin-Zytoskelett und die Kernhülle. Sobald die Aufzeichnung abgeschlossen ist, ist es für die Qualitätskontrolle des Experiments wichtig, die Embryonen zu entnehmen und sie zu gesunden, fruchtbaren Erwachsenen aufzuziehen.

Dieses Verfahren kann mit anderen Techniken wie der elterlichen RNA-Differenz kombiniert werden, um niedergeschlagene Phänotypen zu analysieren.