Die DNA-Farbstoff-ausgelöste Seitenbevölkerung Phänotyp zur Erkennung und Reinigung von Krebsstammzellen aus biologischen Proben

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mutmaßliche Krebsstammzellpopulationen in biologischen Proben auf der Grundlage der Farbstoffextrusionskapazität der Seitenpopulationszellen nachzuweisen. Diese Methode adressiert eine Schlüsselfrage in der Krebsstammzellforschung nach zuverlässigen Mitteln zum Nachweis und zur Reinigung von Krebsstammzellen aus biologischen Proben. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie funktionale Marker einsetzt und somit eine bessere Auflösung bietet.

Darüber hinaus ist die Expression dieser ABC-Wirkstofftransporter in Krebsstammzellen hoch konserviert, so dass wir diese Technik für viele verschiedene Krebsentitäten einsetzen können. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Entdeckung von Krebs-Stammzelltherapeutika, da sie nachgelagerte Analysen wie die Erstellung von Genexpressionsprofilen und die Zielvalidierung in hochreinen Krebszellen erleichtern. Diese Methode kann also Aufschluss über die Eigenschaften von Krebsstammzellen geben.

Wir können diese Methode auch verwenden, um ein System zu charakterisieren, das ABC-Wirkstofftransporter umfasst, der Populationen wie das Knochenmark exprimiert. Das Verfahren wird von Elisabeth Hoflehner, einer Technikerin aus meinem Labor, vorgeführt. Kultivieren Sie zunächst die gewünschte menschliche Krebszelllinie bei 37 Grad Celsius in 10 bis 30 Millilitern RPMI 1640 Medium, das mit 10 % FBS, zwei Millimeter L-Glutamin und Antibiotika ergänzt wird.

Wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 70 bis 90 % erreichen, entfernen Sie das Medium und fügen Sie zwei Milliliter 0,05 % Trypsin-EDTA hinzu, um die Zellen von der Oberfläche der Kulturschale zu lösen. Waschen Sie dann die Zellen mit 10 Millilitern Nährmedium, geben Sie die Suspension in ein sauberes 15-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie sie fünf Minuten lang bei 250 mal G bei vier Grad Celsius. Sobald die Zellen pelletiert sind, entsorgen Sie das Pellet und suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Kulturmedium.

Mischen Sie ein kleines Aliquot der Zellsuspension mit Trypanblau-Lösung und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Zur Vorbereitung von Testproben werden die Zellen in frischem Kulturmedium suspendiert, um eine Zellsuspension von einmal zehn bis sechs Zellen pro Milliliter zu erhalten. Nach dem Einstellen der Zelldichte werden drei Milliliter der Probe in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden überführt, das als Test gekennzeichnet ist.

Geben Sie dann 10 Mikromolare violetten Farbstoffs in die Probe und wirbeln Sie die Suspension vorsichtig ein. Bereiten Sie als nächstes Inhibitionskontrollen vor, indem Sie 500 Mikroliter des Farbstoffs, der die Zellsuspension enthält, in zwei Durchflusszytometrieröhrchen übertragen, die als Kontrolle gekennzeichnet sind. Fügen Sie dem ersten 50 Mikromolar Verapamil hinzu.

Und 20 Mikromolar Fumitremorgin C in das zweite Röhrchen. Und mischen Sie die Lösungen durch vorsichtiges Pipettieren. Decken Sie alle Röhrchen mit Kappen ab und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius im Dunkeln für 90 Minuten.

Rühren Sie die Proben alle 15 Minuten vorsichtig um. Sobald die Färbung abgeschlossen ist, waschen Sie die Hemmungskontrollen in drei bis vier Millilitern eiskaltem PBS. Und bereiten Sie Aliquots der Testprobe für die anschließende Costaining mit Antikörpern vor.

Waschen Sie auch diese Aliquots und filtrieren Sie alle Proben durch 70-Mikron-Trennsiebe, um mögliche Zellaggregate zu entfernen. Und dann zentrifugieren Sie die Suspensionen bei 250 mal G bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Nachdem Sie das resultierende Pellet in 100 Mikrolitern PBS resuspendiert haben, halten Sie die Zellen auf Eis lichtgeschützt.

Als nächstes fügen Sie den mit violettem Farbstoff vorgefärbten Zellen ein geeignetes Panel von Flurochrom-konjugierten Antikörpern hinzu. Wirbeln Sie die Suspensionen vor und inkubieren Sie sie bei vier Grad Celsius im Dunkeln für 20 bis 30 Minuten. Nach der Inkubation die Zellen in drei bis vier Millilitern eiskaltem PBS waschen, die Probe nach Belieben filtrieren.

Und dann bei 250 mal G bei vier Grad Celsius fünf Minuten lang zentrifugieren. Entsorgen Sie das Übergewicht und resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in 100 Mikrolitern PBS. Zum Schluss fügen Sie 7-AAD zu den mit violettem Farbstoff vorgefärbten Zellen hinzu.

Und inkubieren Sie die Proben fünf bis 10 Minuten lang im Dunkeln. Um die Zellen mit dem Durchflusszytometer zu analysieren, gaten Sie eine geeignete Zellpopulation auf einem FSC SSC-Punktdiagramm. Schließen Sie dann mit unterschiedlichen FSC-Signalen alle Zellaggregate aus der ausgewählten Population aus.

Schließen Sie Zellen mit positiver 7-AAD-Färbung aus, um die Population lebensfähiger Zellen zu erhalten. Um ein Punktdiagramm für die Emission von blauem und rotem Farbstoff zu erstellen, zeigen Sie den blauen Fluoreszenzkanal auf der y-Achse und den roten Fluoreszenzkanal auf der x-Achse an. Schalten Sie beide Kanäle in den linearen Modus und passen Sie die Detektorspannung entsprechend an, so dass sich die Seitenpopulation im unteren linken Teil des Diagramms befindet.

Gate dann die Seitenpopulation. Und stoppen Sie die Akquisition. Laden Sie als Nächstes die Inhibitionssteuerungen und erfassen Sie die Daten.

Erstellen Sie abschließend ein Punktdiagramm, das die rote Floreszenz des violetten Farbstoffs auf der x-Achse und einen entsprechenden Floreszenzkanal auf der y-Achse im logarithmischen Modus darstellt. Laden Sie die Probe, passen Sie dann die Detektorspannungen entsprechend an und identifizieren Sie die Fraktion der Seitenpopulationszellen, die die untersuchte Oberfläche exprimieren. Zeichnen Sie dann die Daten auf.

Vorgestellt werden hier repräsentative Ergebnisse der Nebenpopulationsanalyse, die an humanen Eierstockkrebszellen durchgeführt wurde. Die Seitenpopulation, die durch die Analyse der blauen und rot-violetten Emission unterschieden wurde, wurde im linken unteren Quadranten des Punktdiagramms identifiziert und machte 0,70% der gesamten analysierten Population aus. Die spätere Verwendung von Effluxhemmern führte zum Verschwinden des Fluoreszenzsignals, das bei den zuvor identifizierten Zellen beobachtet wurde, was ihren Phänotyp der Seitenpopulation bestätigt.

Schließlich wurden die humanen Ovarialzellen auch hinsichtlich der ABCG2-Expression charakterisiert. Eine ABCG2-positive Färbung wurde in 0,67% der Zellen beobachtet, die der identifizierten Seitenpopulation entsprachen. Einmal gemeistert, kann dieses Verfahren in etwa zwei bis drei Stunden durchgeführt werden, wenn es richtig durchgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Phänotyp der Seitenpopulation streng von einem optimalen Verhältnis von Farbstoffkonzentration zu Zelldichte abhängt. Eine Hydratation beider Variablen wird daher vor dem Experiment dringend empfohlen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Erstellung von Genexpressionsprofilen durchgeführt werden, um die Zellen der Seitenpopulation weiter zu charakterisieren und somit neue Krebsstammzell-spezifische Ziele für die zukünftige Arzneimittelentwicklung zu identifizieren.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Stammzellbiologie, um die Eigenschaften von Gewebestammzellen und Krebsstammzellen sowohl bei Mäusen als auch bei Menschen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die durch violetten Farbstoff ausgelöste Seitenpopulation SA durchführen und wie Sie mutmaßliche Krebsstammzellen in biologischen Proben in Ihrem eigenen Labor nachweisen können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit biologischen Proben äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Arbeit mit diesem Verfahren Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von PSA und biologischen Sicherheitswerkbänken getroffen werden sollten.