Name: Assessing Autophagic Flux durch Messung von LC3, p62 und LAMP1 Co-Lokalisierung mittels Multispektral Imaging Flow Cytometry (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Autophagie-Flussmessung durch LC3-, p62- und LAMP1-Kolokalisierung mit multispektraler Bildgebungs-Flusszytometrie in Jurkat-Zellen durchführen. Diese quantitative Methode ermöglicht objektive und statistisch robuste Analysen.

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Ich möchte meinen Mitarbeitern bei MilliporeSigma, Philip J. Morrissey und Sherree L. Friend, für ihre Unterstützung und Führung im Laufe der Jahre danken. Ich möchte auch Vidya Venkatachalam und Bryan R. Davidson für ihre Hilfe bei der BDC3-Funktion in der IDEAS-Software , Ryan P. Jessup für die Bearbeitung dieses Manuskripts, Raymond Kong für Hilfe am Tag des Schießens und ein besonderes Dankeschön danken Zum Maskenbildner Cynthia Xamonthiene.

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Ich bin bei MilliporeSigma beschäftigt, dem Hersteller der Amnis-Marke ImageStream, die in dieser Studie verwendet wurde.

Bei der Durchführung dieser Analyse gibt es ein paar Dinge zu beachten. Es ist wichtig, entsprechende Kontrollproben zu haben. Für dieses Experiment wurden zwei verschiedene Kontrollen verwendet: Kontrolle und Kontrolle + Chloroquin. Die Kontrollprobe wurde verwendet, um die Schwelle für die Regionen festzulegen. Es stellt die Grundstufe der Autophagie dar, ohne den lysosomalen Abbau zu stoppen und ist die Kontrolle für die verstorbene Probe. Allerdings ist die Kontrollprobe keine geeignete Kontrolle, um mit den Ergebnissen der Starved + Chloroquine Probe zu vergleichen, da Chloroquin selbst die Kontrollprobe beeinflusst. Daher war es notwendig, eine Kontrolle + Chloroquin Probe zu haben. Vor der Durchführung einer Analyse für Autophagie, ist es wichtig, nur analysieren / Gate auf einzelne Zellen, die im Fokus sind ( dh Gradient RMS größer als 60), da die Ergebnisse betroffen sein könnten, wenn es mehr als eine Zelle oder die Bilder sind unscharf. Es ist entscheidend, dass das AutophagosomEs und Lysosomen sind im Fokus für die richtige Punktzählung und BDC3-Analyse. Apoptotische Zellen müssen vor der Autophagie-Analyse entfernt werden, da sie Ergebnisse schneiden können und nicht aufgenommen werden sollten. Es sollte eine angemessene Färbung für alle drei Marker ( dh LC3, p62 und LAMP1) geben. Zum Beispiel sind alle drei Marker intrazellulär und sollten ein punktuelles Signal haben; Wenn das Signal nicht punktiert ist oder ob es sich auf der Oberfläche der Zelle befindet, wäre die Färbung nicht angemessen und das Experiment / Färben sollte erneuert werden. Darüber hinaus, für BDC3 genau zu sein, ist es wichtig, auf Zellen, die hell sind für alle drei fluoreszierenden Marker von Interesse. Gating auf positive Ereignisse ist erforderlich, um die Messung von BDC3 auf unspezifische Bindung, Bildgebung Artefakte und / oder Rauschen zu verhindern. Dies ist entscheidend, da BDC3 potenziell Artefakte verstärken kann, die keine wahren Signale sind. Da BDC3 nur bei hellen positiven Ereignissen durchgeführt werden kann, können viele Zellen nicht in die endgültige Analyse einbezogen werden; Das ist especEcht für Kontrollzellen, die keine Akkumulation von LC3, p62 und / oder LAMP1 haben. Eine Einschränkung dieses Assays besteht also darin, dass BDC3 nur Zellen untersucht, die für alle drei Marker positiv sind, die für alle Autophagieexperimente nicht geeignet sind. Wie BDS, die bereits gemeldet wurde, 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , BDC3 allein, berücksichtigt nicht die Anzahl der autophagischen Organellen, die sich lokalisieren, was zu einem großen Teil führt Der Variabilität in der Anzahl der Autophagosomen. Daher ist der bivariate Ansatz von Rajan et al. war angestellt. Wenn man die bivariate Plots betrachtet, könnte man fragen, obDie Zellen müssen positiv für LC3, p62 und LAMP1 sein; Warum gibt es so viele Zellen, die 0 Spots haben? Dies liegt daran, dass das LC3-Signal für die Co-Lokalisierung hell genug sein könnte, aber es könnte nicht die von der Peak-Maske eingestellte Schwelle (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) erfüllen, die für die Verwendung als a erforderlich ist Stelle. Das hier vorgestellte Protokoll verwendete MIFC, um LC3 puncta zu zählen und die Co-Lokalisierung von drei Autophagie-Markern zur Messung des autophagischen Flusses. Unter basalen Bedingungen (Kontrollprobe) war die Anzahl der Autophagosomen niedrig, und wenige Zellen wurden mit &quot;High Spots&quot; gefunden. Mit der Zugabe von Chloroquin, das die Autophagosom / Lysosomen-Fusion hemmt, kam es zu einer Erhöhung der Anzahl der LC3-Spots. Da das Lysosom nicht in der Lage ist, das Autophagosom zu brechen und das p62, das im Autophagosom liegt, führt dies zu einer Erhöhung der Co-Lokalisation der LC3-, p62- und LAMP1-Autolysosomen-Akkumulation. Dieser Effekt wurde unter Nährstoff-Starvat verstärktIonen, die Autophagie induziert. Allerdings, ohne die Zugabe von Chloroquin, gab es keine signifikante Erhöhung der Anzahl der Autophagosomen, wahrscheinlich aufgrund einer Erhöhung der Rate der autophagischen Umsatz. Als die Zellen in Gegenwart von Chloroquin verhungert wurden, gab es eine Zunahme der Co-Lokalisierung und Anzahl der Autophagosomen, die die Schlussfolgerung unterstützt, dass der Hunger den autophagischen Fluss erhöht. EBSS ist bekannt als ein leistungsfähiger Induktor der Autophagie. Daher ist zu erwarten, dass die Zunahme groß wäre. Wenn ein anderes Verfahren, wie z. B. Arzneimittelinduktion, verwendet wird, um Autophagie zu induzieren, kann der Unterschied zwischen der Kontrolle und den behandelten Proben subtiler sein. Dieses spezielle Protokoll wurde entwickelt, um Autophagie in menschlichen Zelllinien zu messen, aber der Assay könnte an andere Spezies angepasst werden, indem er auf Antikörper für diese spezielle Spezies umschaltet. Darüber hinaus könnte die Analyse-Methode für jede intrazelluläre Anwendung, die die Co-Lokalisierung erfordert verwendet werdenVon drei Sonden / Markern.

Makroautophagie, im Folgenden Autophagie genannt, ist ein katabolischer Weg, in dem beschädigte oder dysfunktionelle Komponenten, langlebige Proteine ​​und Organellen über das Lysosom abgebaut und recycelt werden 1 . Autophagie ist ein dynamischer, mehrstufiger Prozess, der die Bildung eines Autophagosoms beinhaltet; Die Verschmelzung des Autophagosoms mit dem Lysosom, die das Autolysosom bildet; Und der Abbau des Inhalts des Autolysosoms 2 . Der entscheidende biologische Marker, der zur Identifizierung von Autophagie in Säugetiersystemen verwendet wird, ist das Mikrotubuli-assoziierte Protein 1A / 1B-leichte Kette 3 (LC3), das die autophagosomale Membran bildet. Während der Autophagie wird zytosolisches LC3-1 an Phosphatidylethanolamin konjugiert, um LC3-II zu bilden; LC3-II wird dann in die autophagosomale Membran 3 eingearbeitet. Ein weiterer weit verbreiteter Marker für autophagischen Fluss ist das Autophagie-Rezeptor-Sequestosom 1 (SQSTM1, p62), das physisch liNaut autophagische Ladung an die autophagische Membran 4 , 5 . Methoden, die traditionell verwendet wurden, um Autophagie zu messen, sind Western Blots und Fluoreszenzmikroskopie 7 . Jedoch werden keine dieser Methoden als der &quot;Goldstandard&quot; betrachtet 2 , 6, da es Herausforderungen gibt, die mit diesen beiden Techniken verbunden sind. Western Blots geben nur einen Durchschnitt, weil sie eine homogenate Probe verwenden, so dass Beobachter nicht sehen können, was in einzelnen Zellen passiert. Auf der anderen Seite gibt die Fluoreszenzmikroskopie eine Beobachterinformation auf der einzelligen Ebene, aber es fehlt die Durchsatzfähigkeit, so dass es schwierig ist, objektive und statistisch rigorose Einschätzungen zu erhalten. In den letzten Jahren hat die Messung von LC3 und p62 durch multispektrale Bildgebungsdurchflusszytometrie (MIFC, siehe Tabelle der Materialien ) popu gewonnenGröße durch seine quantitative Leistung, hohe Durchsatzfähigkeiten, Multiplex-Potential und die Fähigkeit, jede Zelle abzubilden. Eine der am weitesten verbreiteten Methoden zur Messung der Autophagie mit MIFC, zusammen mit ihrer Begleitanalyse-Software (siehe Tabelle der Materialien ), ist durch die Punktzählung von LC3 puncta oder autophagosomen 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Allerdings bedeutet eine Erhöhung der Autophagosomen nicht zwangsläufig, dass es eine Erhöhung der Autophagie gibt, da sie auch eine Blockade im Prozess darstellen könnte 2 . LC3-II Umsatz ist ein nützlicher Parameter, um autophagischen Fluss zu messen durch die Analyse von Zellen in der Gegenwart undAbwesenheit eines lysosomalen Abbauinhibitors, wie Chloroquin. Chloroquin inhibiert die Fusion des Autophagosom zum Lysosom, wodurch die Quantifizierung der Autophagosom Bildung als Maß für den Grad der durch autophagy autophagischen Flußmittel vor dem lysosomalen Abbau Arretieren kann 18 auftreten. Darüber hinaus wird p62 primär durch Autophagie abgebaut, und wenn der lysosomale Abbau des Autophagosoms und seines Inhalts blockiert wird, wird eine Anreicherung von p62 erwartet, 17 , 19 . Autophagy ist ein mehrstufiger Prozess, und die Messung von LC3 oder p62 allein liefert kein vollständiges Bild dessen, was in den Zellen passiert. Die jüngsten Veröffentlichungen haben die Notwendigkeit betont, die gleichzeitige Bildung des Autolysosoms 2 , 17 , 20 , 21 zu untersuchen . MIFC istDie die Bildung des Autolysosoms durch die Abbildung der Co-Lokalisierung des Autophagosoms an das Lysosom 15 - 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 eindeutig messen kann. Darüber hinaus wurde auch die Co-Lokalisierung von p62 und LC3 unter Verwendung von MIFC untersucht, um den autophagischen Fluss 5 zu messen. In der referenzierten Analysesoftware heißt das &quot;Merkmal&quot;, das die Co-Lokalisierung misst, &quot;Bright Detail Similarity R3&quot; (BDS) und wurde speziell entworfen, um die kleinen, hellen Bilddetails von zwei Bildern zu vergleichen. BDS ist der logarithmierte Pearson-Korrelationskoeffizient der lokalisierten hellen Flecken mit einem Radius von 3 Pixeln oder weniger; Mit anderen Worten, BDS berechnet den Grad von oVerkürzte Pixel aus zwei verschiedenen Fluoreszenzkanälen. Die hellen Flecken sind entweder korreliert ( dh gleiche räumliche Lage) oder unkorrelierte ( dh unterschiedliche räumliche Orte). Daher variiert der Korrelationskoeffizient zwischen 0 (unkorreliert) und 1 (perfekte Korrelation). Der Koeffizient wird log-transformiert, um den Bereich zwischen null und unendlich 26 , 27 zu erhöhen. BDS allein darf nicht ausreichen; Rajan et al. Dass mit nur BDS zu falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen führen könnte 21 . BDS bewertet die Co-Lokalisierung von zwei Marker der Autophagie, aber nicht die Anzahl der Autophagosomen. Um die Anzahl der Autophagosomen zu berücksichtigen, haben Rajan et al. Inklusive Punktzählung der LC3 puncta 21 . Rajan et al. Vorgeschlagen, mit einem bivariate Scatter-Plot von LC3-Spot-Zählung gegenüber BDS. Mit dieser bivariate Handlung, zwei Populationen werE zuerst identifiziert: eine mit Zellen, die ein hohes Maß an LC3 Spots und eine mit Zellen, die ein niedriges Niveau von LC3 Spots haben. Die Hoch-LC3-Punkt-Population wurde weiter in zwei Populationen unterteilt: Zellen mit geringer Co-Lokalisierung ( dh Akkumulation von Autophagosomen) und Zellen mit hoher Co-Lokalisierung ( dh Akkumulation von Autolysosomen). Diese bivariate Handlung erlaubt es, zwischen Zellen mit sehr wenigen Autophagosomen und Zellen mit einer Anhäufung von Autophagosomen und / oder Autolysosomen zu unterscheiden 21 . Bisher war die gleichzeitige Ko-Lokalisierung von LC3, p62 und LAMP1 (lysosomaler Marker) nicht möglich mit einem einzigen &quot;Feature Type&quot; in der MIFC Companion Analysesoftware (siehe Tabelle der Materialien ). Ein neues Feature, das kürzlich in Version 6.1 eingeführt wurde, heißt Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 vergleicht die hellen Detailbilder von jedem der drei Bilder (in diesem Fall LC3, p62 und LAMP1) und quantifiziert die Co-Lokalisierung der drei Sonden ( dh LC3, p62 und LAMP1). Die BDC3-Funktion berechnet den Korrekturkoeffizienten des Pearson, der modifiziert wurde, um auf drei Bilder zu erweitern. Da die hellen Flecken in den drei Bildern entweder korreliert oder unkorreliert sind, variiert der Korrelationskoeffizient zwischen 0 (unkorreliert) und 1 (perfekte Korrelation). Der Koeffizient wird log-transformiert, um den Dynamikbereich zwischen 0 und unendlich zu erhöhen. Durch das Ausschalten der BDS-Funktion mit der BDC3-Funktion, die Analyse-Methode von Rajan et al. Kann nun die drei am häufigsten verwendeten Marker zur Messung der Autophagie in einem System zur gleichen Zeit einbinden. Die Fähigkeit, diese drei Marker von Autophagie in einem einzigen Assay zu lokalisieren, könnte zu neuartigen Einsichten in die Induktion und Regulierung der Autophagie führen. Das folgende Protokoll skizziert die Schritte, um Autophagie in Jurkat-Zellen zu induzieren; Markieren Sie die Zellen mit LC3-, p62- und LAMP1-Antikörpern; Erwerben von Daten auf einem MultispEctral Bildgebungsdurchflusszytometer; Und analysieren die Daten, um autophagischen Fluss zu beurteilen.

<table><tbody><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>AF647 beschriftet Esel Anti-Maus - IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>Esel-Anti-Maus-IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 647. Konzentration: 2 mg/ml. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td></tr><tr><td>Anti-Human-CD107a-PE (LAMP1)</td><td>BioLegend</td><td>328607</td><td>Klon H4A3. Konzentration 400 &Mikro; g/ml. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>Anti-Human-CD45- AF488</td><td>BioLegend</td><td>304017</td><td>Klon HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td></tr><tr><td>Anti-Human-CD45-PE&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304008</td><td>Klon HI30.&nbsp; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td></tr><tr><td>Anti-Human-CD45-AF647&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304018</td><td>Klon HI30.&nbsp; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td></tr><tr><td>Anti-LC3 (Mensch) mAb Klon 4E12</td><td>MBL International Corporation</td><td>M152-3</td><td>Klon 4E+12.&nbsp; Konzentration 2 mg/ml.&nbsp; https://www.mblintl.com/products/m152-3</td></tr><tr><td>Anti-SQSTM1 / p62 Antikörper [EPR4844] - Autophagosomenmarker (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab185015</td><td>Klon EPR4844.&nbsp; Konzentration 0,5 mg/ml.&nbsp; http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td></tr><tr><td>Chloroquindiphosphat Salz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td></td></tr><tr><td>Reiniger - Schar Clenz&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546931</td><td>Füllen Sie den Behälter mit 200 mL Reiniger.&nbsp;</td></tr> <tr><td>https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ DAPI Stain 5 mg/mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>508741</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td></tr><tr><td>Debubbler - 70% Isopropanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.3704</td><td>Behälter mit 200 mL Debubbler füllen.&nbsp; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 10x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-2010-B</td><td>&nbsp; Ca++Mg++ frei&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS Ca++Mg++ frei&nbsp;</td></tr><tr><td>Earle's Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14155</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd, 10%, methanolfrei, Ultra Pure</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>Dies wird für das 4%ige und 1%ige Formalin verwendet. ACHTUNG: Formalin/Formaldehyd giftig beim Einatmen und Verschlucken. Reizt die Augen, die Atemwege und die Haut. Kann durch Einatmen oder Hautkontakt eine Sensibilisierung verursachen. Gefahr schwerer Augenschäden&nbsp; Potentielle Krebsgefahr. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr> <tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat, Klon E6-1 (ATCC TIB-152)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td></tr><tr><td>MEM Nicht-essentielle Aminosäuren 100x</td><td>HyClone</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td> Zum <td>Einsatz kam eine ImageStreamX Mark II mit 2 Kameras, die mit den Lasern 405nm, 488nm und 642nm ausgestattet waren. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td></tr><tr><td>MIFC Analysesoftware - IDEAS 6.2</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>Die Begleitsoftware zum MIFC (ImageStreamX MKII).&nbsp; IDEAS Version 6.2</td></tr><tr><td>MIFC Software - INSPIRE</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>Dies ist die Software, die die MIFC (ImageStreamX MKII) ausführt. INSPIRE Version 200.1.388.0</td></tr><tr><td>PE Anti-Human-CD107a (LAMP-1) Antikörper-Klon H4A3</td><td>BioLegend</td><td>328608</td><td>http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>Penicllin/Streptomycin/Glutamin Lösung 100x</td><td>HyClone</td><td>SV30082.1</td><td></td></tr><tr><td>Spülung - Reinstwasser oder deionisiertes Wasser</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Sie können jedes Reinstwasser oder entionisiertes Wasser verwenden. Füllen Sie den Behälter mit 900 mL Spülung.</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium 1x</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Hülle - PBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>Dies ist das gleiche wie Dulbecco's Phosphate Buffered Kochsalzlösung 1X&nbsp; Ca++MG++ kostenlos.&nbsp; Füllen Sie den Behälter mit 900 mL Mantel.</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen aus silikonisiertem Polypropylen</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-320</td><td>Fisherbran Silikonisierte Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Retention 1,5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td></tr><tr><td>Natriumpyruvatlösung (100 mM)</td><td>HyClone</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>Sterilisator - 0,4 - 0,7 % Hypochlorit</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>Dies sind grundsätzlich 10% Clorox-Bleichmittel, das durch Entlüren von Clorox-Bleiche mit Wasser hergestellt werden kann. Füllen Sie den Behälter mit 200 mL Sterilisator.</td></tr><tr><td>Reagenz für die Systemkalibrierung - SpeedBead</td><td>MilliporeSigma</td><td>400041</td><td>Jedes Röhrchen fasst ~10 mL.&nbsp; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&nbsp;</td></tr><tr><td>T75 Flasche</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100, PROTEIN GRADE Reinigungsmittel, 10% Lösung, steril gefiltert</td><td>MilliporeSigma</td><td>648463-50ML</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td></tr><tr><td>Wasser, Zellkulturqualität&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing autophagic flux durch messung von lc3, p62 und lamp1 co-lokalisierung mittels multispektral imaging flow cytometry

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Autophagie ist ein katabolischer Weg, in dem normale oder dysfunktionelle zelluläre Komponenten, die sich während des Wachstums und der Differenzierung ansammeln, über das Lysosom abgebaut und recycelt werden. Während der Autophagie wird das zytoplasmatische LC3-Protein lipidiert und an die autophagosomalen Membranen rekrutiert. Das Autophagosom verschmilzt dann mit dem Lysosom, um das Autolysosom zu bilden, wo der Abbau der Autophagosomen-Vesikel und deren Inhalt auftritt. Das ubiquitin-assoziierte Protein p62, das an LC3 bindet, wird auch zur Überwachung des autophagischen Flusses verwendet. Zellen, die sich einer Autophagie unterziehen, sollten die Co-Lokalisierung von p62, LC3 und lysosomalen Markern nachweisen. Immunfluoreszenzmikroskopie wurde verwendet, um LC3 puncta, p62 und / oder Lysosomen auf einer per-Zell-Basis visuell zu identifizieren. Eine objektive und statistisch rigorose Bewertung kann jedoch schwierig sein. Um diese Probleme zu überwinden, wurde die multispektrale Bildgebungsdurchflusszytometrie zusammen mit einem analytischen Merkmal verwendet, das die helle de vergleicht(LC3, p62 und lysosomale LAMP1) und quantifiziert ihre Co-Lokalisierung in Kombination mit LC3-Punktzählung, um Autophagie in einer objektiven, quantitativen und statistisch robusten Weise zu messen.

Diese Analysemethode verwendet mehrere Merkmale, um den autophagischen Fluss zu bekämpfen. Um die endgültige bivariate Handlung vollständig zu verstehen, müssen zunächst die einzelnen Analysemerkmale untersucht werden. Das Zählen von Autophagosomen ist ein logischer Weg, um Autophagie zu messen; Allerdings kann die Größe / Form / Helligkeit von LC3 puncta drastisch zwischen den Zellen variieren. Variation kann es schwierig machen, Autophagosomen manuell zu zählen oder eine Spot-Zählfunktion in der Analysesoftware zu verwenden. Daher ist kein Punktzähler-Feature perfekt aufgrund dieser großen Variabilität in Autophagosomen. Jedoch wird ein gutes Punktzählungsmerkmal an den meisten Zellen arbeiten 26 . Abbildung 3 zeigt Beispiele für die Punktmaskierung von LC3-Puncta in Jurkat-Zellen mit verschiedenen Spotmasken. Die für diesen Datensatz ausgewählte Spot-Count-Funktion ist Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, was bedeutet, dass die Spot-Zähl-Funktion die Spots gezählt hatAk-Maske (M11) auf Kanal 11 (Ch11-LC3-AF647) mit einem Punkt-zu-Zellen-Hintergrundverhältnis von 4 (Bright, 4) identifiziert. Fig. 4 zeigt Spot-Zähl-Histogramme und repräsentative Bilder für die mittlere Spotzahl für die mit Anti-LC3-AF647 markierten Kontroll-, Kontroll- + Chloroquin-, verhungerten und verhungerten + Chloroquin-Jurkat-Zellen. Die Kontrolle und die verhungerten Mittelpunkte sind nicht signifikant unterschiedlich; Bei der Zugabe von Chloroquin gibt es einen großen Unterschied im Mittel der Kontrolle + Chloroquin im Vergleich zu dem Starved + Chloroquin. Die nächste zu untersuchende Funktion ist BDC3. BDC3 ist ein Maß für die Co-Lokalisierung von drei Markern / Sonden, in diesem Fall LC3, p62 und LAMP1. Abbildung 5A - 5D zeigt BDC3-Histogramme für die mit Anti-p62-AF488 markierten Kontroll-, Kontroll- + Chloroquin-, verhungerten und verhungerten + Chloroquin-Jurkat-Zellen, Anti-LAMP1-PE und Anti-LC3-AF647. Es gibt eine Verschiebung zwischen dem Kontrollmittel zum verhungerten Mittelwert, sowie die Kontrolle + Chloroquin bedeutet für das Starved + Chloroquin-Mittel. Wenn man jedoch die Bilder von Zellen aus den mittleren BDC3-Scores in Abbildung 5E- 5H betrachtet , gibt es einen größeren Unterschied zwischen den Proben, als die Histogramme einen zu glauben führen können. Dies ist, weil BDC3 nicht die Anzahl der Autophagie Organellen, die co-lokalisieren, was zu einem großen Maß an Variabilität in der Anzahl der Autophagosomen für die gleiche BDC3-Score. In den meisten Fällen gibt es eine Überlappung zwischen allen drei Sonden, da auch in Basalstufen p62, LAMP1 und LC3 bis zu einem gewissen Grad in ähnlichen Bereichen in den Zellen co-lokalisieren oder sich befinden sollen. Als Kontrast kann ein Beispiel für drei Sonden, die nicht ko-lokalisieren sollten, anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 und DAPI-Kernfarbstoff für die Starved + Chloroquine-Probe, wie in Abbildung 6 gezeigt/ P&gt; Wenn das Spot-Zählmerkmal und die BDC3-Funktion kombiniert werden, ist das Vorhandensein unterschiedlicher Subpopulationen, die die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen den verschiedenen Proben / Bedingungen verbessern, offensichtlich. Abbildung 7 zeigt die bivariate Darstellung der Spotzahl von LC3 gegenüber BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 für die vier Proben: Kontrolle, Kontrolle + Chloroquin, verhungert und verhungert + Chloroquin. Die Kontrollprobe wurde verwendet, um die Gating-Strategie für drei Populationen festzulegen: Low Spots, High Spots / Low BDC3 und High Spots / High BDC3. Die Kontrollproben zeigten, dass mehr als 98% der Zellen 1 oder weniger Flecken hatten. Die Grenze zwischen den High Spots / Low BDC3 und High Spots / High BDC3 wurde auf einen BDC3 Score von 1 gesetzt, da mehr als 91% der Control Probe einen BDC3 Score von weniger als 1 hatten. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse für die bivariate Plots Ist in Tabelle 1 dargestellt . Alter = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> Abbildung 1: Einstellung des MIFC-Geräts. Ein Screenshot der MIFC-Instrumenteneinstellungen, die für dieses Experiment verwendet wurden, in Schritt 8 des Protokolls skizziert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> Abbildung 2: Analyse-Software-Gating-Strategie. Ein Screenshot der Analyse-Software-Gating-Schema, skizziert in Schritt 9 des Protokolls. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3: LC3-Spot-Maskierung. Jurkat Zelle Bilder und Masken verwendet, um die Spot-Zähl-Feature zu erstellen. Gezeigt sind BrightField (BF), LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 2), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647) , Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 5,3,1) und Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 6,2,1). Die Maske, die am besten für alle gezeigten Zellen funktionierte, war Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> Abbildung 4: LC3-Spot-Count-Histogramme. Verwenden Sie die Spot-Count-Funktion Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 und die LC3-AF647 Spot-Zähler-Histogramme für Control ( A , hellblau), Control + ChloroquinE ( B , blau), verhungert ( C , rosa) und verhungert + Chloroquin ( D , rot). Der mittlere Punkt zählt für Kontrolle, Kontrolle + Chloroquin, verhungert und verhungert + Chloroquin sind 0,07, 1,13, 0,10 bzw. 2,77. BF, LC3-AF647 (rot), DAPI-Kernfarbstoff (blau) und ein Komposit der LC3-AF647- und DAPI-Bilder von repräsentativen Zellen für die mittlere Punktzahl sind für die Kontrolle ( E , 0-Punkte), Control + Chloroquin ( F , 1 Stelle), Starved ( G , 0 Spots) und Starved + Chloroquine ( H , 3 Spots). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> Abbildung 5: BDC3 Histogramme von p62 / LAMP1 / LC3. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Histogramme fürR Kontrolle ( A , hellblau), Kontrolle + Chloroquin ( B , Blau), Verhungert ( C , Rosa) und Starved + Chloroquin ( D , Rot). Die mittlere BDC3-Punktzahl für Kontrolle, Kontrolle + Chloroquin, Starved und Starved + Chloroquin beträgt 0,57, 0,82, 0,74 bzw. 0,98. BF; P62-AF488 (grün); LAMP1-PE (gelb); LC3-AF647 (rot); Und ein Composite der p62-AF488-, LAMP1-PE- und LC3-AF647-Bilder von repräsentativen Zellen für den mittleren BDC3 sind für die Kontrolle ( E ), Control + Chloroquin ( F ), Starved ( G ) und Starved + Chloroquin ( H ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> Abbildung 6: BDC3 Histogramme von p62 / LC3 / DAPI für die Starved + Chloroquine Probe. ( A ) BDC3 p62 / LC3 / DAPI-Histogramm für die Starved + Chloroquin-Probe wird gezeigt. Die mittlere BDC3-Punktzahl beträgt 0,07. ( B ) BF; P62-AF488 (grün); LC3-AF647 (rot); DAPI (blau); Und ein Komposit der p62-AF488-, LC3-AF647- und DAPI-Bilder von repräsentativen Zellen für den mittleren BDC3 ist für die Starved + Chloroquin-Probe gezeigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> Abbildung 7: Bivariate Plots von LC3 Spot Count gegen BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) Bivariate Plots der LC3-Spotzahl gegenüber BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 für Control, Control + Chloroquine, Starved und Starved + Chloroquine Jurkat-Zellen. ( B ) BF; P62-AF488 (Grün); LAMP1-PE (gelb); LC3-AF647 (rot); Und ein Verbund der p62-AF488-, LAMP1-PE- und LC3-AF647-Bilder aus drei Regionen ( dh Low Spots, High Spots / Low BDC3 und High Spots / High BDC3) sind für die Starved + Chloroquine-Probe gezeigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Anzahl der Zellen </td><td> Helles Detail Kolokalisierung 3 Mittelwert </td><td> Spot Count LC3 Mittler </td><td> % Niedriger Punkt </td><td> % High Spot / Low BDC3 </td><td> % High Spot / High BDC3 </td></tr><tr><td> Steuern </td><td> 439 </td><td> 0,57 </td><td> 0,07 </td><td> 98.2 </td><td> 1.8 </td><td> 0,0 </td></tr><tr><td> Kontrolle + Chloroquin </td><td> 1432 </td><td> 0,82 </td><td> 1.13 </td><td> 68,9 </Td&gt; <td> 19.5 </td><td> 11.7 </td></tr><tr><td> Verhungert </td><td> 1204 </td><td> 0,74 </td><td> 0.10 </td><td> 98.4 </td><td> 0,6 </td><td> 1,0 </td></tr><tr><td> Verhungert + Chloroquin </td><td> 1811 </td><td> 0,98 </td><td> 2.77 </td><td> 32.1 </td><td> 36,9 </td><td> 31.0 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Zusammenfassung der Jurkat LC3 Spotzählung gegenüber BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Bivariate Plot

Hier wurde die multispektrale bildgebende Durchflusszytometrie mit einem analytischen Merkmal, das helle Detailbilder von 3 Autophagie-Markern vergleicht und deren Co-Lokalisierung zusammen mit der LC3-Spotzählung quantifiziert, verwendet, um Autophagie objektiv, quantitativ und statistisch robust zu messen.

Assessing Autophagic Flux durch Messung von LC3, p62 und LAMP1 Co-Lokalisierung mittels Multispektral Imaging Flow Cytometry

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Kolokalisation von drei Autophagie-Markern unter gleichzeitiger Quantifizierung von LC3-Punkten zur objektiven, quantitativen und statistisch robusten Messung der Autophagie zu bestimmen. Diese Methode ermöglicht es, die Kolokalisation von drei Autophagie-Markern in einem einzigen Testverfahren zu messen, was möglicherweise zu neuen Erkenntnissen über die Induktion und Regulation der Autophagie führen kann. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass drei Autophagie-Marker gleichzeitig auf objektive, quantitative und statistisch robuste Weise gemessen werden können.Beginnen Sie damit, jeweils zwei mal 10 hoch 6 Jurkat-Zellen in einzelne 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu geben, die mit den entsprechenden Probennamen beschriftet sind. Geben Sie anschließend ausreichend Waschpuffer in jedes Röhrchen, um das Endvolumen jeder Probe auf 15 Milliliter aufzufüllen, und pelletieren Sie die Proben durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie die Pellets in 100 Mikrolitern 4 % Formalin und überführen Sie die Proben danach in beschriftete silikonisierte Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen.Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur die Proben mit einem Milliliter frischem Waschpuffer waschen. Die Pellets in 100 Mikroliter des ersten gewünschten Antikörpers in Permeabilisierungspuffer resuspendieren und 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren, dabei vor Licht geschützt halten. Die markierten und permeabilisierten Zellen mit einem Milliliter frischem Permeabilisierungspuffer waschen und anschließend wie gerade gezeigt mit dem nächsten gewünschten Antikörper markieren.Nachdem alle Proben mit dem endgültigen Antikörper markiert wurden, resuspendieren Sie die Pellets in 1 % Formalinlösung, gefolgt von der Zugabe von 10 Mikrolitern 10x DAPI-Kernfärbung. Mischen Sie die Zellen durch leichtes Vortexen und inkubieren Sie die Proben anschließend 10 Minuten bei Raumtemperatur, lichtgeschützt. Laden Sie am Ende der Inkubation die Standardvorlage auf dem multiskpektralen bildgebenden Durchflusszytometer und wählen Sie die geeigneten Laser aus.Geben Sie die gewünschte Laserleistung im Fenster neben jeder Laser-Taste ein und klicken Sie dann auf die Schaltfläche „Laden“, um die 1,5-Milliliter-Röhrchen in das Gerät einzulegen. Erstellen Sie ein Punktediagramm der Fläche M01 gegen das Seitenverhältnis M01 für die gesamte Population und zeichnen Sie einen Bereich um die Zellen. Benennen Sie diesen Bereich „Zelle“.Legen Sie die Erfassungsparameter fest. Geben Sie den Zielordner und den Dateinamen an und ändern Sie die Anzahl der Ereignisse auf 5.000. Wählen Sie anschließend die Zellpopulation aus und klicken Sie auf „Erfassen“, um die Datei aufzuzeichnen, und führen Sie die übrigen Proben wie gerade gezeigt unter denselben Laser-Einstellungen durch. Nachdem die Datei gesammelt wurde, klicken Sie auf „Zurück“, um die Probenröhre zurückzuholen.Um die multiskpektralen bildgebenden Durchflusszytometriedaten zu analysieren, klicken Sie auf „Analyse starten“, um den Assistenten zum Öffnen von Dateien in der Bildanalyse-Software zu starten. Klicken Sie dann auf das Apoptose-Assistenten-Symbol und auf die Schaltfläche „Assistenten auswählen“, um den Apoptose-Assistenten zu öffnen. Nachdem alle apoptotischen Zellen aus der Analyse entfernt wurden, zeichnen Sie einen Bereich um die nicht-apoptotischen Zellen und kennzeichnen Sie diese Population als Zellen. Klicken Sie anschließend auf das Symbol „Bausteine“.Wählen Sie die fluoreszenzpositiven Zellen nach einer Farbe aus und selektieren Sie die Zellpopulation und Intensität im MC-Kanal drei. Beschriften Sie die X-Achse mit Intensität Lampenkanal eins und zeichnen Sie einen Bereich, der die Zellen mit Intensitäten größer als 10.000 umfasst. Kennzeichnen Sie diesen Bereich als Lampenkanal-eins-positiv.Nachdem die P62- und LC3-positiven Zellen auf dieselbe Weise selektiert wurden, klicken Sie auf den Reiter Analyse und wählen Maske. Klicken Sie auf Neu und dann auf Funktion. Wählen Sie unter Funktion den Peak aus.Wählen Sie unter Maske M11 und unter Kanal Kanal 11 aus. Stellen Sie das Verhältnis von Spot zu Zellhintergrund auf vier ein.Klicken Sie dann auf „Okay“, um das Fenster der definierten Maskenfunktion zu schließen, gefolgt von „Okay“, um die Maske der Maskenliste hinzuzufügen. Klicken Sie auf „Schließen“, um den Masken-Manager zu verlassen, dann erneut auf den Reiter „Analyse“ und wählen Sie „Merkmale“. Klicken Sie auf „Neu“.Wählen Sie unter „Feature-Typ“ die Punktzahl aus und wählen Sie die zuvor erstellte Peak-Maske. Geben Sie als Namen „Punktzahl LC3“ ein und klicken Sie auf „OK“. Klicken Sie erneut auf „Neu“.Wählen Sie unter „Feature-Typ“ die Option „Bright Detail Colocalization Three“ oder „BDC3“. Wählen Sie unter „Maske“ „MC“. Wählen Sie unter „Bild eins“ Kanal zwei für P62. Wählen Sie unter „Bild zwei“ Kanal drei für Lamp1.Wählen Sie unter Bild drei den Kanal 11 für LC3 aus. Geben Sie BDC3p62/LAMP1/LC3 als Namen ein und klicken Sie auf „Okay“ und „Schließen“, um den Feature-Manager zu verlassen. Klicken Sie auf das neue Scatter-Plot-Symbol und wählen Sie die Population aus, die LAMP1-positiv, p62-positiv und LC3-positiv ist.Wählen Sie BDC3/p62/LAMP1/LC3 für die X-Achse und die Spotanzahl-LC3-Merkmal für die Y-Achse aus und klicken Sie auf „OK“. Wählen Sie im Dateimenü „Datenanalyse-Datei speichern“ und klicken Sie auf „Speichern“ und „Ja“, um die Daten aus dem Zustand der Hungersimulation plus Chloroquin als Datenanalyse-Datei zu speichern und die vorherige Version der Datei zu ersetzen. Öffnen Sie nun die Kontrolldatei und wählen Sie die geeignete Kompensationsmatrix sowie die Datenanalyse-Datei für die Hungersimulation plus Chloroquin als Vorlage aus.Klicken Sie auf „Okay“. Um Bereiche für die Akkumulation von Autophagosomen und die Akkumulation von Autolysosomen zu erstellen, öffnen Sie die Kontrollprobe und zeichnen Sie einen rechteckigen Bereich von den X-Achsen-Koordinaten 0,1 bis 3 und den Y-Achsen-Koordinaten 1,5 bis 0,3. Benennen Sie diesen Bereich „low spots“.Zeichnen Sie als Nächstes einen Bereich von den X-Achsen-Koordinaten 0,1 bis eins und den Y-Achsen-Koordinaten 17,5 bis 1,5 und benennen Sie diesen Bereich „hoher Fleck, niedriger BDC3“. Zeichnen Sie anschließend einen Bereich von den X-Achsen-Koordinaten eins bis drei und den Y-Achsen-Koordinaten 17,5 bis 1,5 und benennen Sie diesen Bereich „hohe Flecken/hohes BDC3“. Speichern Sie die Steuerdatei, damit sie als Vorlage verwendet werden kann, und öffnen Sie anschließend die anderen Dateien, einschließlich der „verhungerten plus Chloroquin“-Datei, wobei Sie die Steuerdatei als Vorlage verwenden, wie zuvor gezeigt. Die Größe, Form und Helligkeit der LC3-Punkte kann zwischen Zellen stark variieren, wie an diesen Punktmaskierungen der LC3-Punkte in Jurkat-Zellen unter Verwendung verschiedener Punktmasken beobachtet wurde.Die Maske, die für dieses Experiment am besten funktionierte, war die mit einem Verhältnis von vier zwischen Spot- und Zellhintergrundsignal. Bei diesen repräsentativen Spot-Zählungen von anti-LC3-markierten Jurkat-Zellen unterscheiden sich die mittleren Spot-Zahlen von Kontrolle und Hungerbehandlung nicht signifikant. Bei Zugabe von Chloroquin wird ein großer Unterschied zwischen dem Mittelwert der Kontrolle plus Chloroquin und dem Mittelwert der Hungerbehandlung plus Chloroquin beobachtet.In diesem Experiment zeigte sich eine Verschiebung zwischen dem gemessenen mittleren Kontrollwert der BDC3-Kokolokalisation und dem mittleren Wert unter Nährstoffentzug sowie zwischen dem Kontrollwert mit Chloroquin und dem Wert unter Nährstoffentzug mit Chloroquin. Die BDC3-Methode berücksichtigt nicht die Anzahl der Autophagie-Organelle, die kokolokalisieren, was zu einer hohen Variabilität der Anzahl von Autophagosomen bei identischem BDC3-Score führt. Tatsächlich überlappen sich in den meisten Fällen alle drei Sonden, da p62, LAMP1 und LC3 selbst auf Beyza-Ebene bis zu einem gewissen Grad in ähnlichen Zellregionen kokolokalisieren sollten.Als Kontrast hier ein Beispiel für die BDC3-Merkmalserkennung an drei Sonden, die nicht kolokalisiert sein sollten: P62, LC3 und DAPI. Wenn die Spotanzahl und die BDC3-Merkmale kombiniert werden, wird die Präsenz der verschiedenen Subpopulationen deutlich, die die Unterscheidungsfähigkeit zwischen den verschiedenen Proben und Bedingungen verbessern.Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in etwa acht Stunden abgeschlossen werden. Falls jedoch eine andere Spot-Zähl-Funktion erforderlich ist, wäre zusätzliche Analysezeit notwendig. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die geeigneten Kontrollen zu verwenden.Beispielsweise verwenden Sie die Kontrollprobe, um die Beyza-Schwellenwerte festzulegen, und die Kontrollprobe plus Chloroquin als Kontrolle für die Probe unter Nährstoffentzug plus Chloroquin. Dieses Verfahren kann auch für andere intrazelluläre Anwendungen verwendet werden, bei denen die Kocolokalisation von drei verschiedenen Markern erforderlich ist, indem einfach die entsprechenden Antikörper ausgetauscht werden. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen mit Autophagie-Markern markiert, Daten auf einem multiskpektralen bildgebenden Durchflusszytometer aufnimmt und die Daten zur Beurteilung des autophagosomen Flusses analysiert.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Formalin äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Autophagie ist ein allgegenwärtiges Prozess, Zellen zu zersetzen und zu recyceln Proteine ​​und Organellen ermöglicht. Wir bieten fortschrittliche Fluoreszenzmikroskopie zu visualisieren und zu quantifizieren, die klein, aber wichtig, körperliche Veränderungen mit der Induktion von Autophagie verbunden sind, einschließlich der Bildung und Verteilung von Autophagosomen und Lysosomen, und deren Verschmelzung zu autolysosomes.

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Zeitraffer-Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Autophagie Marker erlaubt die Überwachung der dynamischen Autophagie Reaktion mit hoher zeitlicher Auflösung. Mit spezifischen Autophagie und Organellen Marker in einer Kombination aus 3 verschiedenen Farben, können wir folgen den Beitrag eines Proteins an Autophagosom Bildung in einem robusten räumlichen und zeitlichen Kontext.

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Aktive Autophagie ist mit produktiven Muskelregeneration verbunden, die für die Muskelstammzell-Aktivierung (MuSC) essentiell ist. Hier stellen wir ein Protokoll für die in situ- Detektion von LC3, einen Autophagie-Marker in MyoD-positiven MuSCs von Muskelgewebeabschnitten von Kontroll- und verletzten Mäusen zur Verfügung.

In situ Immunfluoreszenz Färbung der Autophagie in Muskelstammzellen

Hier ist eine einfache und gut validierte Protokoll zur Messung der Masse selbstverdauende Sequestrierung Aktivität in Säugetierzellen beschrieben. Die Methode basiert auf der Quantifizierung des Anteils der Laktat-Dehydrogenase (LDH) im Sedimentable Zelle Fraktionen gegenüber dem gesamten zellulären LDH Niveau.

Laktat-Dehydrogenase Sequestrierung Assay – Eine einfache und zuverlässige Methode zur Bestimmung Bulk Selbstverdauende Sequestration Aktivität in Säugerzellen

Wir beschreiben unser Protokoll zur Messung biologischer Rhythmen im Proteinkatabolismus über Autophagie und das Proteasom in der Mausleber.

Messung von diurnalen Rhythmen in autophagischen und proteasomalen Flux

Mitophagie ist der primäre Mechanismus der mitochondrialen Qualitätskontrolle. Die Bewertung der Mitophagie in vivo wird jedoch durch das Fehlen zuverlässiger quantitativer Assays behindert. Hier wird ein Protokoll zur Beobachtung der Mitophagie in lebenden Zellen unter Verwendung eines zellpermierten grün-fluoreszierenden Mitochondrienfarbstoffs und eines rot fluoreszierenden Lysosomenfarbstoffs vorgestellt.

Visualisierung der Mitophagie mit Fluoreszenzfarbstoffen für Mitochondrien und Lysosomen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die autophagischen Konzentrationen bei Bauchspeicheldrüsenkrebs und Pankreasazinuszellen durch LC3-Immunfluoreszenz und LC3-Punktquantifizierung zu bestimmen.

Evaluierung der Autophagie in zwei verschiedenen Pankreaszellmodellen mittels LC3-Immunfluoreszenz

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für eine optimierte korrelative Lichtelektronenmikroskopie vor, die auf endogener, fluoreszierender Markierung basiert, um die Lokalisierung seltener Proteine in Bezug auf die zelluläre Ultrastruktur zu untersuchen. Die Leistungsfähigkeit dieses Ansatzes wird durch die ultrastrukturelle Lokalisierung von endogenem LC3 in ausgehungerten Zellen ohne Bafilomycin-Behandlung demonstriert.

Ultrastrukturelle Lokalisierung von endogenem LC3 mittels korrelativer Lichtelektronenmikroskopie

Hier stellen wir die Methodik zur prägnanten Bestimmung des Autophagosomenmarkers LC3-II-Spiegel in extrazellulären Vesikeln (EVs) durch Immunblotting vor. Die Analyse der LC3-II-Spiegel in EVs, der Autolysosomenbildung und der Omegasomenbildung deutet auf die neue Rolle von STX6 bei der Freisetzung von LC3-II-positiven EVs hin, wenn die Autophagosomen-Lysosomenfusion gehemmt wird.

Bewertung der LC3-II-Freisetzung über extrazelluläre Vesikel in Bezug auf die Akkumulation intrazellulärer LC3-positiver Vesikel

Die IP-FCM-Methode vorgestellt, die eine sensible, robust, biochemische Beurteilung der nativen Protein-Protein-Interaktionen ermöglicht, ohne dass Gentechnik oder große Stichproben.

IP-FCM: Immunpräzipitation mittels Durchflusszytometrie Detected

Erfahren Sie, wie Sie die Autophagie-Flussmessung durch LC3-, p62- und LAMP1-Kolokalisierung mit multispektraler Bildgebungs-Flusszytometrie in Jurkat-Zellen durchführen. Diese quantitative Methode ermöglicht objektive und statistisch robuste Analysen.

Assessing Autophagic Flux durch Messung von LC3, p62 und LAMP1 Co-Lokalisierung mittels Multispektral Imaging Flow Cytometry

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