In-vitro- Wachstum der Maus Preantral Follikel in simulierter Schwerelosigkeit
17. Dezember 2017
Eine vielversprechende Technik, um Gewebe zu generieren baut ohne Verwendung von Matrix an Zellkulturen in simulierter Schwerelosigkeit Zustand ist. Mit einem rotierenden Kultursystem, untersuchten wir Wachstum der Follikel und Eizellreifung Follikel überleben, Morphologie, Wachstums-und Eizelle Funktion unter der Bedingung der simulierten Schwerelosigkeit.
In-vitro-Wachstum von murinen präantralen Follikeln unter simulierter Mikrogravitation. Der gesamte Vorgang kann in vier Teile unterteilt werden. Teil eins: mechanische Isolierung von Follikeln aus den Eierstöcken mithilfe von Nadeln unter dem Stereomikroskop.
Teil zwei: Einzelne Follikel durch Pipettieren in die Mitte jeder Alginate-Kugel einschließen. Teil drei: Die Alginate-Kugeln, die einzelne Follikel enthalten, in den Kultivierungstropfen im rotierenden Kultivierungssystem überführen, das Schwerelosigkeit simuliert. Teil vier: Alginate-Kugeln aufnehmen und die Follikel durch Inkubation in Medium, das mit Alginitlyase ergänzt ist, 30 Minuten bei 37 Grad Celsius aus den Alginate-Kugeln freisetzen.
Isolierung und Einschließung von Follikeln. Sammeln Sie die Eierstöcke in einem Handhabungspuffer und geben Sie die Eierstöcke anschließend in eine mittig positionierte Mulde einer Mehrmuldenplatte. Unter einem Stereomikroskop werden die Follikel mit zwei Nadeln von den Eierstöcken isoliert.
Achten Sie darauf, die Vasomembran nicht zu beschädigen. Bereiten Sie eine Schale mit Tropfen Medium vor und bedecken Sie sie mit Öl. Überführen Sie die Follikel in die vorbereitete Schale.
Waschen Sie die Follikel in dem neuen Medium und überführen Sie sie anschließend in die Tropfen des Mediums. Ein Tropfen Medium enthält jeweils einen einzelnen Follikel. Bereiten Sie eine zentrierte Kulturschale vor und geben Sie die Kapselungslösung in den äußeren Kreis.
Bereiten Sie ein Vial mit der 0,8-prozentigen Alginate-Lösung vor. Geben Sie 0,5 µL Alginate-Lösung in die Mitte der Schale. Fügen Sie Tropfen der Alginate-Lösung in die Kapselungslösung im äußeren Kreis der Schale hinzu.
Überführen Sie den Follikel in die Alginate-Lösung in der Mitte der Petrischale. Spülen Sie die Follikel mit der Alginate-Lösung ab. Überführen Sie die Follikel durch die weiche Oberfläche der Lösung in die Mitte jedes Alginate-Perls.
Jede Alginate-Kugel enthält einen einzelnen Follikel. Spülen Sie die Alginate-Kügelchen mit der Einschlusslösung, um die Kügelchen zu stabilisieren. Überführen Sie die Alginate-Kügelchen in eine neue Schale mit Handhabungsmedium.
Kultivierung von eingeschlossenen Follikeln in vitro unter simulierter Mikrogravitation. Für die Kontrollgruppe 150 Milliliter Kulturmedium in eine neue Petrischale geben und mit Öl bedecken. Drei Alginate-Perlen in den Mediumstropfen überführen.
Die Schale in einem Inkubator mit Kohlendioxid für die Kultur inkubieren. Zur Behandlung unter simulierter Mikrogravitation eine Schale mit Öl vorbereiten, die Verschlusskappe entfernen und das Öl über die offene Öffnung in das Gefäß geben, bis das Gefäß fast voll ist. Ein 50-Milliliter-Kulturmedium zum Öl hinzufügen.
Übertragen Sie drei Alginate-Kügelchen in den Mediumstropfen. Setzen Sie die offene Verschlusskappe wieder auf. Die Luftblasen im Gefäß müssen entfernt werden.
Entfernen Sie die Verschlusskappe des Spritzhafens. Platzieren Sie zwei Spritzen mit Öl auf dem Spritzhafen. Manövrieren Sie die Luftblasen unterhalb des Spritzhafens.
Ziehen Sie die Luftblasen in die Spritze und injizieren Sie das gleiche Volumen Öl aus der anderen Spritze heraus. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen im Gefäß befinden. Schließen Sie die Ventile, entfernen Sie die Spritzen und setzen Sie die Verschlusskappe für den Spritzenanschluss wieder auf.
Wir haben bereits vier Gefäße mit Alginate-Kügelchen vorbereitet. Nun ist es an der Zeit, die Gefäße auf der rotierenden Basis zu befestigen. Stellen Sie die Rotationsgeschwindigkeit so ein, dass sich der Mediumstropfen im Gleichgewichtszustand befindet.
Überführen Sie beide Gefäße und die Basis in einen Dioxid-Inkubator zur Kultivierung. Wechseln Sie das Kulturmedium. Entfernen Sie die Öffnungsverschlusskappe, sammeln Sie die Alginate-Perlen und das Öl in einer neuen Schale.
Finden und übertragen Sie die Alginate-Perlen in eine Schale mit dem Handhabungsmedium. Stellen Sie das Gefäßkultursystem wie zuvor wieder her. Follikelentnahme.
Entfernen Sie die offene Portkappe, sammeln Sie die Alginateperlen und das Öl in einer neuen Schale. Heben Sie die Alginateperlen und die entkapselten Follikel aus den Alginateperlen auf, indem Sie sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Behandlungsmedium inkubieren, das mit einer Alginitlyase ergänzt ist. Ergebnisse. Der Zellviabilitätstest zeigte, dass die einzelnen Follikel, die unter Normalgravitationsbedingungen kultiviert wurden, mehr lebende Zellen und weniger tote Zellen aufwiesen als die Follikel, die unter simulierten Mikrogravitationsbedingungen kultiviert wurden.
Die Follikelgröße nahm unter beiden Schwerkraftbedingungen signifikant zu. Schlussfolgerung. Unsere Methode bietet ein Modell, um die Mechanismen zu untersuchen, die an den in vitro Entwicklungsvorgängen von Oozyten und Granulosazellen unter simulierter Mikrogravitation beteiligt sind.
Übersicht
Diese Studie beschreibt ein Protokoll zur Kultivierung von murinen präantralen Follikeln unter simulierten Mikrogravitationsbedingungen mithilfe eines rotierenden Kultursystems. Die Methode umfasst die Isolierung und Einbettung von Follikeln in Alginate-Kügelchen, die Kultivierung unter normalen sowie simulierten Mikrogravitationsbedingungen und die Beurteilung von Follikelüberleben, Wachstum und Oozyten-Ultrastruktur. Die Ergebnisse verdeutlichen den Einfluss der Mikrogravitation auf die Follikelviabilität und die Oozytenentwicklung und stellen ein Modell für weitere Untersuchungen der in-vitro-Follikulogenese unter veränderter Schwerkraft bereit.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Reproduktionsbiologie
- Entwicklungsbiologie
- Gewebetechnik
Hintergrund
- Umgebungen mit Mikrogravitation können die Entwicklung von Zellen und Geweben beeinflussen.
- Die in-vitro-Follikelkultur ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Entwicklung von Oozyten und Granulosazellen.
- Mit simulierten Mikrogravitationssystemen lässt sich die Rolle der Schwerkraft in der Follikulogenese erforschen.
- Die Alginateinschließung ermöglicht die dreidimensionale Follikelkultur.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Kultivierung von murinen präantralen Follikeln unter simulierter Mikrogravitation.
- Vergleich von Überleben und Entwicklung der Follikel unter Normalgravitation und simulierter Mikrogravitation.
- Beurteilung der Auswirkungen der Mikrogravitation auf die Entwicklung von Oozyten und granulosen Zellen.
Verwendete Methoden
- Mechanische Isolierung präantraler Follikel aus Eierstöcken von 14 Tage alten Mäusen mittels Nadeln unter einem Stereomikroskop.
- Einkapselung einzelner Follikel in 0,8 %igen Alginate-Pellets.
- Kultivierung der eingeschlossenen Follikel in einem rotierenden Gefäßsystem zur Simulation von Mikrogravitation sowie paralleler Kontrollkultur unter Normalgravitation.
- Gewinnung und Entkapselung der Follikel mittels Alginitlyase.
- Beurteilung der Follikelüberlebensrate, Messung der Durchmesser von Follikeln und Oozyten sowie ultrasruckturelle Analyse der Oozyten.
Hauptergebnisse
- Follikel, die unter Normalgravitation kultiviert wurden, wiesen eine höhere Zellviabilität auf als jene unter simulierter Mikrogravitation.
- Die Größe der Follikel nahm unter beiden Gravitationsbedingungen signifikant zu.
- Die simulierte Mikrogravitation führte zu einer verminderten Follikelüberlebensrate und einer Herunterregulation der Expression von proliferierendem nukleärem Antigen der Zellen (PCNA) sowie des Wachstumsdifferenzierungsfaktors 9 (GDF9).
- Oozyten aus der Mikrogravitationsgruppe wiesen ultrastrukturelle Anomalien auf.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebene Methode ermöglicht die Untersuchung der in-vitro-Follikel- und Oozytenentwicklung unter simulierter Mikrogravitation.
- Die simulierte Mikrogravitation beeinträchtigt die Follikelüberlebensrate und die Oozytenqualität negativ.
- Weitere Optimierungen des Kultursystems sind erforderlich, um die in-vitro-Follikulogenese unter veränderten Schwerkraftbedingungen besser modellieren zu können.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Kultur von murinen präantralen Follikeln unter simulierter Mikrogravitation bietet ein kontrolliertes System, um die mechanistischen Auswirkungen veränderter physikalischer Kräfte auf die frühe Follikulogenese zu untersuchen. Dieses Modell ermöglicht eine quantitative Beurteilung des Follikelüberlebens, des Oozytenwachstums und molekularer Marker und stützt somit die Vorhersagekraft in Studien zur Entwicklungsbiologie. Die Methode liefert Grundlagen für risikoadjustierte Entscheidungen in der translationsorientierten Forschung im Bereich der Reproduktions- und Gewebeengineering-Verfahren.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die mechanistische Entschärfung von Follikel- und Oozytenentwicklung unter veränderten Schwerkraftbedingungen.
- Unterstützt die funktionelle Validierung molekularer Marker wie PCNA und GDF9 bei der Granulosazell- und Oozytenreifung.
- Bietet eine quantitative Plattform für Hypothesentests in der Reproduktionsbiologie und Gewebeengineering.
Screening und Assay-Entwicklung
- Etabliert ein reproduzierbares 3D-Kultursystem zur Beurteilung der Follikelviabilität und Wachstumsparameter.
- Erleichtert die Standardisierung quantitativer Messgrößen, einschließlich der Durchmesser von Follikeln und Oozyten.
- Ermöglicht die vergleichende Analyse von Überlebensraten und molekularen Expressionen unter variablen physikalischen Bedingungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Bietet ein Modell zur Untersuchung krankheitsrelevanter Mechanismen, die die Oozytenqualität und das Follikelüberleben beeinflussen.
- Unterstützt die Abstimmung von in-vitro-Befunden mit der translationellen Biomarker-Entwicklung in der reproduktiven Gesundheit.
- Informiert präklinische Strategien zur Optimierung von Gewebekultursystemen unter nichtstandardisierten Umgebungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Forschung, indem sie mechanistische Studien in frühen Entwicklungsstadien sowie die Entwicklung quantitativer Assays für die Fortpflanzungsbiologie und das Gewebegewirke ermöglicht.
- Entdeckungsbiochemie Unterstützt die hypothesengeleitete Untersuchung der Wirkung der Schwerkraft auf die Follikulogenese und die Oozytenreifung.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative Aussagen zur Vitalität und zum Wachstum unter kontrollierten Bedingungen.
- Analytik: Liefert messbare Endpunkte wie Überlebensraten, die Expression molekularer Marker und die ultrasruckturelle Analyse.
- Translationale Forschung Verbindet in-vitro-Ergebnisse mit präklinischen Modellen für die reproduktive und regenerative Medizin.
- Unternehmensweites Wiederverwenden: Etabliert eine wiederverwendbare Plattform für mechanistische Studien über verschiedene Gewebe- und Zelltypen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert das Vorhersagevertrauen in Modellen der Entwicklungs- und Reproduktionsbiologie.
- Operationaler Wert: Fördert die Standardisierung und Reproduzierbarkeit in 3D-Kultur- und quantitativen Bewertungsabläufen.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen für die Weiterentwicklung von Gewebeengineering- und Fortpflanzungsgesundheitsprogrammen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung mechanistischer und translationsorientierter Forschungsinitiativen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Follikelisolierung, Kapselung und 3D-Kultivierungstechniken.
- Setzt Zugang zu spezialisierten rotierenden Kultursystemen und analytischer Infrastruktur für quantitative Bewertungen voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei Vitalitätsassays und der Analyse molekularer Marker.
- Kann je nach Forschungsschwerpunkt eine Anpassung an verschiedene Gewebetypen oder Arten erfordern.
- Die Optimierung der Parameter zur Mikroschwerkraftsimulation ist entscheidend für Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit des Modells.
