In-vitro- Wachstum der Maus Preantral Follikel in simulierter Schwerelosigkeit
17. Dezember 2017
Eine vielversprechende Technik, um Gewebe zu generieren baut ohne Verwendung von Matrix an Zellkulturen in simulierter Schwerelosigkeit Zustand ist. Mit einem rotierenden Kultursystem, untersuchten wir Wachstum der Follikel und Eizellreifung Follikel überleben, Morphologie, Wachstums-und Eizelle Funktion unter der Bedingung der simulierten Schwerelosigkeit.
In vitro Wachstum von präantralen Follikeln der Maus unter der simulierten Schwerelosigkeit. Das gesamte Verfahren kann in vier Teile unterteilt werden. Teil eins: Mechanisches Isolieren von Follikeln aus den Eierstöcken mit Nadeln unter dem Stereomikroskop.
Teil zwei: Verkapseln Sie einen einzelnen Follikel, indem Sie ihn in die Mitte jeder Alginatkugel pipettieren. Im dritten Teil werden die Alginatkügelchen, die die einzelnen Follikel enthalten, in das Tröpfchen des Nährmediums in das rotierende Kultursystem übertragen, das die simulierte Schwerelosigkeit erzeugt. Im vierten Teil nehmen Sie Alginatkügelchen auf und entkapseln die Follikel von den Alginatkügelchen, indem Sie in einem mit Alginatlyase angereicherten Medium 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Follikelisolierung und -verkapselung. Sammeln Sie die Eierstöcke in einem Handhabungsmedium und legen Sie die Eierstöcke dann weiter in eine zentrierte Vertiefungsplatte. Unter einem Stereomikroskop werden die Follikel mit zwei Nadeln von den Eierstöcken isoliert.
Achten Sie darauf, die Gefäßmembran nicht zu beeinträchtigen. Bereiten Sie ein Gericht mit mittelgroßen Tröpfchen zu und bedecken Sie es mit dem Öl. Übertragen Sie die Follikel in das vorbereitete Gericht.
Waschen Sie die Follikel in dem neuen Medium und übertragen Sie sie dann in die Tröpfchen des Mediums. Ein Tröpfchen Medium enthält einen einzelnen Follikel. Bereiten Sie eine zentrierte Kulturschale vor und geben Sie die Verkapselungslösung in den äußeren Kreis.
Bereiten Sie ein Fläschchen mit dem Nullpunkt acht Prozent Alginatlösung vor. Geben Sie null Komma fünf Mikroliter Alginatlösung in die Mitte der Schale. Tröpfchen der Alginatlösung in die Verkapselungslösung im äußeren Kreis der Schale geben.
Übertragen Sie den Follikel in die Alginatlösung in der Mitte der Schale. Spülen Sie die Follikel mit der Alginatlösung aus. Übertragen Sie die Follikel durch die weiche Oberfläche der Lösung in die Mitte jeder Alginatperle.
Jede Alginatkügelchen enthält einen einzelnen Follikel. Spülen Sie die Alginatkügelchen mit der Verkapselungslösung ab, um die Kügelchen zu verfestigen. Übertragen Sie die Alginatkügelchen in eine neue Schale mit Handhabungsmedium.
In-vitro-Kultur von verkapselten Follikeln unter simulierter Schwerelosigkeitsbehandlung. Geben Sie für die Kontrollgruppe 150 Milliliter Nährmedium in eine neue Schale und bedecken Sie sie mit Öl. Übertragen Sie drei Alginatkügelchen in das mittlere Tröpfchen.
Inkubieren Sie das Gericht in einem Dioxid-Inkubator für die Kultur. Bereiten Sie für eine simulierte Behandlung in der Schwerelosigkeit eine Schale mit Öl vor, entfernen Sie den Portdeckel und geben Sie das Öl durch den offenen Port in das Gefäß, bis das Gefäß fast voll ist. Geben Sie ein 50-Milliter-Nährmedium in das Öl.
Übertragen Sie drei Alginatkügelchen in das mittlere Tröpfchen. Bringen Sie die Kappe des offenen Anschlusses wieder an. Die Luftblasen im Gefäß müssen entfernt werden.
Entfernen Sie die Kappe des Spritzenanschlusses. Legen Sie zwei Spritzen mit Öl auf den Spritzenanschluss. Manövrieren Sie die Luftblasen unter den Spritzenanschluss.
Ziehen Sie die Blasen in die Spritze und injizieren Sie die gleiche Menge Öl aus der anderen Spritze. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen im Gefäß befinden. Schließen Sie die Ventile, entfernen Sie die Spritzen und setzen Sie die Kappe des Spritzenanschlusses wieder auf.
Wir haben bereits vier Gefäße mit Alginatkügelchen vorbereitet. Jetzt ist es an der Zeit, die Gefäße in der rotierenden Basis zu fixieren. Passen Sie die Rotationsrate an, bis sich das mittlere Tröpfchen im Gleichgewicht befindet.
Übertragen Sie sowohl die Gefäße als auch den Boden in einen Dioxid-Inkubator für die Kultur. Kulturmedium wechseln. Entfernen Sie die offene Portkappe, sammeln Sie die Alginatkügelchen und das Öl in einer neuen Schale.
Suchen Sie die Alginatkügelchen und geben Sie sie in eine Schale mit dem Handhabungsmedium. Stellen Sie das Gefäßkultursystem wieder wie zuvor her. Follikel-Entnahme.
Entfernen Sie die offene Portkappe, sammeln Sie die Alginatkügelchen und das Öl in einer neuen Schale. Nehmen Sie die Alginatkügelchen und entkapselten Follikel von den Alginatkügelchen auf, indem Sie sie in einem Handhabungsmedium inkubieren, das 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit einer Alginat-Lyase ergänzt wird. Befund. Der Zellviabilitätsassay zeigte, dass die einzelnen Follikel, die unter normalen Schwerkraftbedingungen kultiviert wurden, mehr lebende Zellen und weniger tote Zellen enthielten als die Follikel, die unter simulierten Schwerelosigkeitsbedingungen kultiviert wurden.
Die Follikelgröße nahm unter beiden Schwerkraftbedingungen signifikant zu. Schlussfolgerung. Unsere Methode bietet ein Modell, um die Mechanismen zu untersuchen, die an den in vitro Entwicklungsprozessen von Eizellen und Granulosazellen unter simulierten Mikrogravitationsbedingungen beteiligt sind.
Übersicht
Diese Studie beschreibt ein Protokoll zur Kultivierung von murinen präantralen Follikeln unter simulierten Mikrogravitationsbedingungen mithilfe eines rotierenden Kultursystems. Die Methode umfasst die Isolierung und Einbettung von Follikeln in Alginate-Kügelchen, die Kultivierung unter normalen sowie simulierten Mikrogravitationsbedingungen und die Beurteilung von Follikelüberleben, Wachstum und Oozyten-Ultrastruktur. Die Ergebnisse verdeutlichen den Einfluss der Mikrogravitation auf die Follikelviabilität und die Oozytenentwicklung und stellen ein Modell für weitere Untersuchungen der in-vitro-Follikulogenese unter veränderter Schwerkraft bereit.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Reproduktionsbiologie
- Entwicklungsbiologie
- Gewebetechnik
Hintergrund
- Umgebungen mit Mikrogravitation können die Entwicklung von Zellen und Geweben beeinflussen.
- Die in-vitro-Follikelkultur ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Entwicklung von Oozyten und Granulosazellen.
- Mit simulierten Mikrogravitationssystemen lässt sich die Rolle der Schwerkraft in der Follikulogenese erforschen.
- Die Alginateinschließung ermöglicht die dreidimensionale Follikelkultur.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Kultivierung von murinen präantralen Follikeln unter simulierter Mikrogravitation.
- Vergleich von Überleben und Entwicklung der Follikel unter Normalgravitation und simulierter Mikrogravitation.
- Beurteilung der Auswirkungen der Mikrogravitation auf die Entwicklung von Oozyten und granulosen Zellen.
Verwendete Methoden
- Mechanische Isolierung präantraler Follikel aus Eierstöcken von 14 Tage alten Mäusen mittels Nadeln unter einem Stereomikroskop.
- Einkapselung einzelner Follikel in 0,8 %igen Alginate-Pellets.
- Kultivierung der eingeschlossenen Follikel in einem rotierenden Gefäßsystem zur Simulation von Mikrogravitation sowie paralleler Kontrollkultur unter Normalgravitation.
- Gewinnung und Entkapselung der Follikel mittels Alginitlyase.
- Beurteilung der Follikelüberlebensrate, Messung der Durchmesser von Follikeln und Oozyten sowie ultrasruckturelle Analyse der Oozyten.
Hauptergebnisse
- Follikel, die unter Normalgravitation kultiviert wurden, wiesen eine höhere Zellviabilität auf als jene unter simulierter Mikrogravitation.
- Die Größe der Follikel nahm unter beiden Gravitationsbedingungen signifikant zu.
- Die simulierte Mikrogravitation führte zu einer verminderten Follikelüberlebensrate und einer Herunterregulation der Expression von proliferierendem nukleärem Antigen der Zellen (PCNA) sowie des Wachstumsdifferenzierungsfaktors 9 (GDF9).
- Oozyten aus der Mikrogravitationsgruppe wiesen ultrastrukturelle Anomalien auf.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebene Methode ermöglicht die Untersuchung der in-vitro-Follikel- und Oozytenentwicklung unter simulierter Mikrogravitation.
- Die simulierte Mikrogravitation beeinträchtigt die Follikelüberlebensrate und die Oozytenqualität negativ.
- Weitere Optimierungen des Kultursystems sind erforderlich, um die in-vitro-Follikulogenese unter veränderten Schwerkraftbedingungen besser modellieren zu können.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Kultur von murinen präantralen Follikeln unter simulierter Mikrogravitation bietet ein kontrolliertes System, um die mechanistischen Auswirkungen veränderter physikalischer Kräfte auf die frühe Follikulogenese zu untersuchen. Dieses Modell ermöglicht eine quantitative Beurteilung des Follikelüberlebens, des Oozytenwachstums und molekularer Marker und stützt somit die Vorhersagekraft in Studien zur Entwicklungsbiologie. Die Methode liefert Grundlagen für risikoadjustierte Entscheidungen in der translationsorientierten Forschung im Bereich der Reproduktions- und Gewebeengineering-Verfahren.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die mechanistische Entschärfung von Follikel- und Oozytenentwicklung unter veränderten Schwerkraftbedingungen.
- Unterstützt die funktionelle Validierung molekularer Marker wie PCNA und GDF9 bei der Granulosazell- und Oozytenreifung.
- Bietet eine quantitative Plattform für Hypothesentests in der Reproduktionsbiologie und Gewebeengineering.
Screening und Assay-Entwicklung
- Etabliert ein reproduzierbares 3D-Kultursystem zur Beurteilung der Follikelviabilität und Wachstumsparameter.
- Erleichtert die Standardisierung quantitativer Messgrößen, einschließlich der Durchmesser von Follikeln und Oozyten.
- Ermöglicht die vergleichende Analyse von Überlebensraten und molekularen Expressionen unter variablen physikalischen Bedingungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Bietet ein Modell zur Untersuchung krankheitsrelevanter Mechanismen, die die Oozytenqualität und das Follikelüberleben beeinflussen.
- Unterstützt die Abstimmung von in-vitro-Befunden mit der translationellen Biomarker-Entwicklung in der reproduktiven Gesundheit.
- Informiert präklinische Strategien zur Optimierung von Gewebekultursystemen unter nichtstandardisierten Umgebungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Forschung, indem sie mechanistische Studien in frühen Entwicklungsstadien sowie die Entwicklung quantitativer Assays für die Fortpflanzungsbiologie und das Gewebegewirke ermöglicht.
- Entdeckungsbiochemie Unterstützt die hypothesengeleitete Untersuchung der Wirkung der Schwerkraft auf die Follikulogenese und die Oozytenreifung.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative Aussagen zur Vitalität und zum Wachstum unter kontrollierten Bedingungen.
- Analytik: Liefert messbare Endpunkte wie Überlebensraten, die Expression molekularer Marker und die ultrasruckturelle Analyse.
- Translationale Forschung Verbindet in-vitro-Ergebnisse mit präklinischen Modellen für die reproduktive und regenerative Medizin.
- Unternehmensweites Wiederverwenden: Etabliert eine wiederverwendbare Plattform für mechanistische Studien über verschiedene Gewebe- und Zelltypen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert das Vorhersagevertrauen in Modellen der Entwicklungs- und Reproduktionsbiologie.
- Operationaler Wert: Fördert die Standardisierung und Reproduzierbarkeit in 3D-Kultur- und quantitativen Bewertungsabläufen.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen für die Weiterentwicklung von Gewebeengineering- und Fortpflanzungsgesundheitsprogrammen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung mechanistischer und translationsorientierter Forschungsinitiativen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Follikelisolierung, Kapselung und 3D-Kultivierungstechniken.
- Setzt Zugang zu spezialisierten rotierenden Kultursystemen und analytischer Infrastruktur für quantitative Bewertungen voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei Vitalitätsassays und der Analyse molekularer Marker.
- Kann je nach Forschungsschwerpunkt eine Anpassung an verschiedene Gewebetypen oder Arten erfordern.
- Die Optimierung der Parameter zur Mikroschwerkraftsimulation ist entscheidend für Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit des Modells.
