Name: Live-Zelle Bildgebung von Platelet Degranulation und Sekretion unter Flow (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Lernen Sie eine Fluoreszenzmikroskopie-basierte Methode zur Untersuchung von Thrombozytenadhäsion, -spreizung und -sekretion unter Flussbedingungen. Diese vielseitige Plattform ermöglicht mechanistische Forschung zu Thrombose und Hämostase.

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CM erkennt die finanzielle Unterstützung der Internationalen Patientenorganisation für C1-Inhibitor-Defizite (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht und der Landsteiner Stiftung für Bluttransfusionsforschung (LSBR) an.

Das örtliche medizinische Ethikkomitee des Universitätsklinikums Utrecht genehmigte die Zeichnung von Blut für Ex-vivo- Forschungszwecke, einschließlich derjenigen dieser Studie. 1. Lösungsvorbereitung <ol><li> Zubereitung eines 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinansulfonsäure- (HEPES) Tyrode-Puffers durch Auflösen von 10 mM HEPES, 0,5 mM Na 2 HPO 4 , 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO 4 und 5,55 mM D- Glukose in destilliertem Wasser. <ol><li> Machen Sie zwei Varianten des Puffers: Stellen Sie den pH-Wert bei 6,5 bzw. 7,4 ein. Machen Sie frischen Puffer für jeden Tag der Experimente. Ergänzung mit 10 ng / mL Prostacyclin wo angegeben. </li></ol></li><li> Bereiten Sie TRIS-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) vor, indem Sie 50 mM Tris und 150 mM NaCl in destilliertem Wasser auflösen und den pH-Wert auf 9,0 einstellen. </li><li> Säurecitrat-Dextrose (ACD) durch Auflösen von 85 mM Tri-Natriumcitrat, 71 mM Zitronensäure und 111 mM D-Glucose in disWasser. </li><li> Vorbereitung einer Fixierlösung durch Zugabe von 2% (v / v) Paraformaldehyd (PFA) zu HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4. Hitze auflösen (50 - 70 ° C) und den pH-Wert auf 7,4 einstellen. Aliquot und bei -20 ° C aufbewahren. Tauen bei 37 ° C vor Gebrauch. </li><li> Stickstoffpuffer durch Auflösen von 1% (m / v) Humanserumalbumin (HSA) in HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4, vorbereiten </li><li> Eine Polyvinylalkohol-Lösung durch Zugabe von 4,8 g Polyvinylalkohol zu 12 g Glycerin zugeben und gut vermischen. 12 ml destilliertes Wasser zugeben und bei Raumtemperatur über Nacht auf einen Rotator geben. <ol><li> Zugabe von 24 ml 0,2 M Tris-HCL, pH 8,5. Bei 30 ° C auf 50 ° C erhitzen. 1,25 g 1,4-Diazabicyclo [2.2.2] octan (DABCO) zugeben und gut vermischen. Zentrifuge bei 1.500 xg für 5 min. Aliquot der Überstand (1 ml reicht für 15-20 Folien) und bei -20 ° C lagern. Benutze die Aliquote einmal. </li></ol></li></ol> 2. Deckglas-Vorbereitung <ol><li> Entfetten Sie die AbdeckungGläser (25 x 50 mm 2 ) durch Inkubieren über Nacht in unverdünnter Chromschwefelsäure. Spülen Sie die Deckgläser mit destilliertem Wasser ab und trocknen Sie sie über Nacht bei 60 ° C in einem Ofen. </li><li> Halten Sie einen Streifen eines Paraffinfilms (10 x 15 cm 2 ) auf eine Laborbank mit einem Tropfen Wasser und entfernen Sie die Luft durch Glätten des Paraffinfilms. Pipettieren Sie 80 μl Tropfen von 10 μg / mL VWF oder 100 μg / ml Fibrinogen auf den Paraffinfilm. Legen Sie die Brille auf die Tropfen; Die Proteinlösung wird sich zwischen den beiden Oberflächen verteilen, um die gesamte Rückseite des Glases zu bedecken. Inkubieren für 1,5 h bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Entfernen Sie den Paraffinfilm und blockieren Sie die Deckgläser, indem Sie sie mit der beschichteten Seite nach oben in eine 4-Well-Platte mit Blockierpuffer legen. 1 Stunde bei 37 ° C oder Nacht bei 4 ° C inkubieren. Als Kontrolle blockieren Sie ein Deckglas, das nicht mit VWF oder Fibrinogen beschichtet wurde. </li></ol> 3. Herstellung von plättchenreichem Plasma (PRP) </pAufgaben <ol><li> Sammeln Sie citriertes Vollblut (Endkonzentration: 0,32% Natriumcitrat (M / V)) durch Venenpunktion. </li><li> Das Blut für 15 min bei 160 xg und RT ohne Bremse zentrifugieren. Sammle den Überstand ( dh den PRP) mit einer Plastik-Pasteurpipette. HINWEIS: Nach der Zentrifugation können drei Schichten beobachtet werden (von oben nach unten): PRP, weiße Blutkörperchen und rote Blutkörperchen. Achten Sie darauf, die weißen und roten Zellen nicht einzuschließen. Typischerweise können nach der Zentrifugation eines 9-ml-Blutröhrchens 3 ml PRP gesammelt werden. </li><li> Weiter mit Abschnitt 4, wenn das Experiment mit gewaschenen Plättchen durchgeführt wird. Wenn PRP gewünscht wird, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. </li><li> Nach der PRP-Auffangung wird der Rest des Blutes (mit dem roten Zellpellet) für 10 min bei 2.000 xg ohne Bremse zentrifugiert. Sammle den Überstand, der das Plättchen-arme Plasma (PPP) enthält. HINWEIS: In der Regel können 2 ml nach diesem zweiten Zentrifugationsschritt gesammelt werden. </li><li> Zähle die Nummer des pSpalte im PRP auf einem Zellanalysator und verdünnen sie mit dem PPP (Schritt 3.4) auf eine Konzentration von 150.000 Thrombozyten / μL. HINWEIS: Das Gesamtvolumen des verdünnten PRP hängt von der Thrombozytenzahl des Spenders ab. Die Plättchenzahlen variieren stark zwischen den Spendern, und die PRP-Verdünnung erfordert eine individuelle Einschätzung. Plättchenzählungen gelten als normal, wenn innerhalb von 150.000 und 450.000 Thrombozyten / μL. </li><li> Weiter mit Abschnitt 5. </li></ol> 4. Vorbereitung von gewaschenen Plättchen <ol><li> Bestimmen Sie das mittlere Plättchenvolumen (MPV) im PRP mit einem Zellanalysator. HINWEIS: Dies ist ein Indikator für die Plättchen-Voraktivierung 11 . Ein normaler MPV für die Rettung von Plättchen ist 7,5-11,5 fL 11 . Der MPV sollte während des Plättchenwaschvorgangs nicht um mehr als 1,5 fl ansteigen. </li><li> Füge 1/10 Volumen ACD zu PRP hinzu, um Thrombozytenvoraktivierung zu verhindern und 15 min bei 400 xg und RT ohne Bremse zu zentrifugieren. Den su entfernenPernieren und das Pellet vorsichtig in HEPES Tyrode-Puffer, pH 6,5, auf das ursprüngliche Volumen von PRP aufsetzen. </li><li> Tauen Sie ein Aliquot von Prostacyclin durch Zugabe von TBS zu einer Konzentration von 10 μg / ml; Halten Sie es auf Eis. </li><li> Um die Thrombozytenaktivierung zu verhindern, füge Prostacyclin bei einer Endkonzentration von 10 ng / mL zu den wieder suspendierten Plättchen hinzu und zerkleinere 15 Minuten lang bei 400 xg und RT ohne Bremse. Den Überstand entfernen und das Pellet vorsichtig in HEPES Tyrode-Puffer, pH 7.4, wieder suspendieren. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der Plättchen (Schritt 3.5) und bestimmen Sie die Änderung in MPV (Schritt 4.1) (die MPV sollte nicht mehr als 1,5 fL ändern). </li><li> Die Anzahl der Thrombozyten mit HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4, auf eine Konzentration von 150.000 Thrombozyten / μL einstellen. Lassen Sie die Thrombozyten für 30 Minuten bei RT vor den Experimenten zurück. Verwenden Sie gewaschene Plättchen für Experimente innerhalb von 4 h nach der Isolierung. </li></ol> 5. Durchflusskammermontage 12 . Es können eine Vielzahl von handelsüblichen Strömungskammern verwendet werden, solange sie ein Deckglas halten können, das vorzugsweise für weitere Analysen abnehmbar ist. Die für die beschriebenen Experimente verwendete Strömungskammer besteht aus Poly (methylmethacrylat), um eine Mikroskopeinsatzstufe genau zu platzieren. Es enthält einen Einlass und Auslass ( Abbildung 1A - C ; 1, 2) sowie einen Vakuumanschluss ( Abbildung 1A und C ; 3). Eine kundenspezifische Silikonfolie ( Abbildung 1A und D ; 4) wird oben aufgesetzt. Zwei Ausschnitte bilden Vakuumkanäle ( Fig. 1A und D ; 5), um das Deckglas ( Fig. 1A ; 6) fest an der Kammer anzubringen. Eine zentrale Aussparung bildet den Strömungskanal ( Fig. 1A </strong&gt; Und D ; 7; 2,0 mm Breite und 0,125 mm Höhe). Der Einlass und der Auslass sind mit dem Strömungskanal verbunden und das Vakuum ist mit dem Vakuumkanal verbunden. <ol><li> Decken Sie die Oberseite der Durchflusskammer mit destilliertem Wasser ab und legen Sie die kundenspezifische Silikonfolie mit der glatten Seite nach unten auf das Wasser. Schwimmen Sie das Blatt in Position, indem Sie überschüssiges Wasser entfernen, während das Blatt in Position gehalten wird. HINWEIS: Diese Silikonfolie ist wiederverwendbar (Silikon ist bekannt für seine inerten Eigenschaften); In der Regel wurden Thrombozyten nicht beobachtet, um sie anzubringen. Die Blätter können mit Spülmittel gereinigt und wiederverwendet werden, bis das Material beschädigt wird ( dh das Reißen, insbesondere im Bereich zwischen den Kanälen). Im Allgemeinen kann ein Blatt für 20 Tage mit mehreren Experimenten pro Tag verwendet werden. </li><li> Die Strömungskammer für 1 h bei 60 ° C inkubieren, um das restliche Wasser zu verdampfen, um die Silikonfolie fest an der Strömungskammer zu haften. </li><li> Mit einer Plastik Pasteur Pipette, fügen Sie einen Tropfen vonHEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4, auf den Strömungskanal. Legen Sie das Deckglas (siehe Abschnitt 2) mit der beschichteten Seite nach unten auf den Strömungskanal. Befestigen Sie die Vakuumpumpe am Vakuumanschluss ( Abb. 1A und C ; 3). Tragen Sie ~ 10 kPa Druck auf. </li></ol> 6. Vorfärbung der Plättchen und Vorbereitung der Antikörper <ol><li> Plättchenfärbung <ol><li> Inkubieren der gewaschenen Plättchen mit 10 μg / ml DAPI für 30 min bei 37 ° C im Dunkeln. Um das ungebundene DAPI zu waschen und die Thrombozytenaktivierung zu verhindern, füge Prostacyclin bei einer Endkonzentration von 10 ng / mL hinzu und sofort 15 min bei 400 xg und RT ohne Bremse zentrifugieren. </li><li> Das Plättchenpellet in HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4, auf eine Plättchenkonzentration von 150.000 Thrombozyten / μL rekonstituieren. </li></ol></li><li> Vorbereitung von Antikörpern <ol><li> Mischen Sie Biotin-markierten Antikörper mit Alexa-markiertem StrepTavidin in einem Molverhältnis von 1: 1. Inkubieren für mindestens 10 min bei Raumtemperatur vor Gebrauch (Schritt 7.6). HINWEIS: Die Biotin-Markierungseffizienz kann zwischen verschiedenen Chargen variieren. Sollte es Probleme mit der Visualisierung von Zielmolekülen geben, sollten Kontrollexperimente durchgeführt werden, um die erfolgreiche Biotinylierung zu bestätigen, sowie die Target-Bindungseigenschaften des spezifischen biotinylierten Antikörpers. </li></ol></li></ol> 7. Perfusion <ol><li> Starten Sie das Fluoreszenzmikroskop sowie die Mikroskop-Software. Verwenden Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Mikroskopeinstellungen. HINWEIS: Das Mikroskop und die Aufzeichnungseinstellungen für die Live-Zell-Visualisierung und Aufzeichnung der Thrombozyten und der gewählten fluoreszenzmarkierten Antikörper und / oder Farbstoffe durch Laden eines geeigneten Experiments in die Mikroskop-Software einleiten. Fließversuche bei RT durchführen. </li><li> Blockieren Sie den Einlassschlauch, indem Sie eine 10-ml-Spritze an den Schlauch anschließen und 1% HSA-Block austretenKochen Puffer in den Einlass Schlauch. 15 min bei RT inkubieren. Spülen Sie den Einlassschlauch durch Ansaugen von HEPES Tyrode&#39;s Puffer, pH 7,4, in den Einlassschlauch. </li><li> Verbinden Sie den blockierten Einlassschlauch und den unbehandelten Auslassschlauch, beide mit einem Durchmesser von 1,02 mm und einer Länge von 20 bis 30 cm zum Einlass und Auslass der Kammer. Verbinden Sie eine 10-ml-Spritze (oder weniger Volumen für mehr Genauigkeit) mit dem Auslassschlauch. Schalten Sie die Spritzenpumpe ein. HINWEIS: Der Durchmesser der Spritze bestimmt in Kombination mit der an der Pumpe eingestellten Durchflussmenge den volumetrischen Durchfluss. Zusammen mit der Oberfläche des Strömungskanals kann die Schergeschwindigkeit nach der Formel 13 berechnet werden unten. Somit ist es möglich, die Scherrate durch Ändern der Strömungsgeschwindigkeit der Spritzenpumpe zu manipulieren oder die Abmessungen des Strömungskanals zu verändern. Eine Scherrate von 800-1.600 s -1 typischerweise für arterieller Blutfluss, während 25 - 100 s-1 Modelle für venöses Blutfließen. Für diesen Aufbau ergibt eine Durchflussrate von 7,5 μl / min eine Scherrate von 25 s -1 . Scherrate = 6Q / h 2 W in s -1 Wobei: Q = volumetrische Durchflussrate (mL / s), h = Höhenkanal (cm) (0,015 cm, dies ist die Dicke der Silikonfolie), w = Breite Kanal (cm) (0,2 cm in dieser Kammer). </li><li> Legen Sie einen Tropfen Tauchöl auf ein 100faches Objektiv (Gesamtverstärkung von 1.000X) und montieren Sie die Kammer auf dem Mikroskop mit der Glasoberfläche nach unten. </li><li> Setzen Sie den Einlassschlauch in ein Rohr mit HEPES Tyrode&#39;s Puffer, pH 7.4. Ziehen Sie den Kolben der Spritze manuell an den Auslaufschlauch und ziehen Sie die Lösung durch die Kammer, um die Luft aus dem System zu entfernen. Legen Sie die Spritze in die Spritzenpumpe ( Abbildung 1B und C ; 8) und führen Sie die Pumpe kurz, um den Kolben zu spannen und sorgen Sie für einen stabilen Durchfluss. </li><li> Füge Antikörper und / oder Farbstoffe der Plättchen-Suspension oder PRP vorsichtig hinzuMit einer Plastikpipette vermischen und die Mischung auf ein 1,5-ml-Röhrchen überführen. HINWEIS: Für eine typische 30-minütige Perfusion bei einer Schergeschwindigkeit von 25 s-1 (7,5 μl / min) wird ein Minimum von 225 μl Plättchen-Suspension benötigt. Die für die repräsentativen Ergebnisse verwendeten Antikörper sind in Tabelle 2 gezeigt . </li><li> Bewegen Sie den Einlaßschlauch, während er aus dem HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4, in ein 1,5-ml-Röhrchen, das entweder PRP oder die gewaschenen Plättchen und die Antikörper und / oder Farbstoffe enthält ( Fig. 1B und C ; 9), gedrückt wird. HINWEIS: Es ist wichtig, dass beim Überführen des Schlauches der Schlauch gepresst wird (Druckluft), um zu verhindern, dass Luft in den Schlauch eindringt. Es ist möglich, adhärierende Plättchen mit einer Vielzahl von Reagenzien in einem nachfolgenden Schritt zu behandeln, indem man den Einlaßschlauch in ähnlicher Weise zu einem anderen Rohr bewegt. Eine Liste von potentiell nützlichen Reagenzien ist in Tabelle 3 angegeben . </li><li> Wähle die &quot;live visualizatio&quot;N &quot;-Option in der Software, fokussieren Sie das Mikroskop auf die Oberfläche des beschichteten Deckglases und starten Sie die Pumpe mit einer Schergeschwindigkeit von 1.600 s-1 (484 μl / min), bis die Plättchen in die Durchflusskammer gelangen. Verringern Sie die Schergeschwindigkeit auf 25 s-1, indem Sie die Einstellungen der Spritzenpumpe auf eine Durchflussrate von 7,5 μl / min ändern. </li><li> Überwachen Sie die Oberfläche der beschichteten Seite des Deckglases, warten Sie, bis das erste Plättchen anfängt zu haften, fokussieren Sie das Mikroskop auf dieses Plättchen und starten Sie die Aufnahme, indem Sie das Experiment in der Software initiieren. Siehe Tabelle 1 für die hier verwendeten Aufnahmeeinstellungen. </li><li> Folgen Sie der Liveaufnahme visuell. Nach 30 min die Spritzenpumpe stoppen. HINWEIS: Sicherstellen, dass die Plättchen im Laufe des Experiments im Fokus bleiben. Typischerweise befestigen 20-30 Thrombozyten im Gesichtsfeld bei einer Vergrößerung von 1.000X; Das sind etwa 2.000-3.000 Plättchen im ganzen Strömungskanal. </li><li> Fixierung mitDie Durchflusskammer (optional). <ol><li> Wenn die Strömung nach dem Stoppen der Spritzenpumpe gestoppt ist, den Einlassschlauch (luftfrei) in die Fixierlösung überführen. Starten Sie die Pumpe neu und füllen Sie den Fixierungspuffer durch den Kanal für mindestens 10 min mit der gleichen Durchflussrate wie in Schritt 7.8 beschrieben. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Kammer aus dem Mikroskop, reinigen Sie das Tauchöl aus dem Glas, trennen Sie das Vakuum und entfernen Sie das Deckglas vorsichtig mit einer 18 G-Nadel aus der Kammer. HINWEIS: Verhindern, dass das Deckglas brechen und das Silikonblech beschädigt. </li><li> Legen Sie den Deckel (mit den Zellen nach oben gerichtet) in eine 4-Well-Platte auf ein Gewebe, vorbestimmt mit destilliertem Wasser. HINWEIS: Dadurch wird verhindert, dass das Deckglas an der Wannenoberfläche haftet und das Trocknen verhindert. </li><li> 750 μl Fixierlösung auf das Deckglas pipettieren und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Falls die Proben nicht direkt analysiert werden können,Lagern sie in 0,5% PFA (verdünnt durch HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4) bei 4 ° C, um eine stabile Fixierung zu gewährleisten. Fahren Sie mit Abschnitt 8 fort, um das Deckglas für die Bildgebung zu verarbeiten. </li><li> Nach dem Gebrauch spülen Sie die Kammer, die Schläuche und die Platte mit destilliertem Wasser und inkubieren über Nacht in einer Waschmittellösung. Vor der Wiederverwendung der Kammer und anderer Komponenten mit destilliertem Wasser abspülen. </li><li> Speichern Sie die Mikroskop-Rohdatendateien, die alle Metadaten enthalten. Wenn nötig, exportiere die Filme in .MOV, h.264 komprimiert oder .AVI unkomprimiert. Speichern Sie einzelne Frames als JPEG- oder TIF-Dateien. </li></ol> 8. Probenvorbereitung für konfokale Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> Übertragen Sie die Deckgläser auf neue 4-Well-Platten und spülen Sie 5 mal mit 3 ml HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4. 3 ml / Vertiefung des Blockierungspuffers zugeben und 1 h bei RT inkubieren. </li><li> Entfernen Sie den Blockierpuffer. 3 ml / Vertiefung von 0,15% Glycin (M / V) in HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4; Und 15 min bei R inkubierenT. </li><li> Glycinlösung entfernen und 5 mal in 3 ml / Vertiefung des Blockierungspuffers waschen. Gegebenenfalls fügen Sie Fluorophor-konjugierte Antikörper hinzu, die in Blockierungspuffer für zusätzliche Färbung verdünnt sind. Inkubieren für 1 h bei RT im Dunkeln. </li><li> 5 mal mit Blockierungspuffer und 2 mal mit destilliertem Wasser waschen. Trocknen Sie das Glas, indem Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem Gewebe (von den Kanten nach innen) entfernen, ohne die Zellen zu berühren. </li><li> 25 μl Polyvinylalkohol-Lösung auf einen Objektträger pipettieren. Legen Sie das Deckglas mit den Zellen nach unten auf den Tropfen und lassen Sie den Polyvinylalkohol zwischen den beiden Flächen verteilen. Inkubieren über Nacht bei RT im Dunkeln. </li><li> Analysieren Sie die Zellen durch konfokale Mikroskopie 14 . </li><li> Speichern Sie die Rohdaten der aufgezeichneten Stapeldaten, die alle Metadaten enthalten. Wenn nötig, verarbeiten Sie die Rohdaten-Dateien in MOV, h.264 komprimiert oder .AVI unkomprimierte Dateien. Speichern Sie separate Stacks als JPEG- oder TIF-Dateien. </li></ol>

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<li>Tersteeg, C., de Maat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+cleavage+of+von+Willebrand+factor+as+an+emergency+bypass+for+ADAMTS13+deficiency+in+thrombotic+microangiopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy.</a> Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).</li>
<li>Basir, A., de Groot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Hemocompatibility+Testing+of+Dyneema+Purity+Fibers+in+Blood+Contact%5BTitle%5D)+AND+%22Innovations+%28Phila%29%22%5BJournal%5D)">In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact.</a> Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Weltweit ist Thrombose eine führende Todesursache und Morbidität, und Thrombozyten spielen eine zentrale Rolle bei der Entwicklung. Diese Arbeit beschreibt ein Verfahren zur lebenden Zellenabbildung von Thrombozyten-Degranulation unter Strömung. Es wird allgemein angenommen, dass bei der Aktivierung von Blutplättchen alle körnigen Inhalte direkt in Lösung gelangen. Die begleitenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass dies nicht unbedingt der Fall ist. Während der Adhäsion und Degranulation behalten die Plättchen eine sig...

Plättchen sind anucleare Zellen, die im Blutstrom zirkulieren. Ihre Hauptfunktion ist es, vaskuläre Brüche an Orten der Verletzung zu versiegeln und Blutverlust zu verhindern. An diesen Verletzungsorten werden subendotheliale Kollagenfasern exponiert und anschließend durch das multimere Protein, von Willebrand-Faktor (VWF) abgedeckt. VWF interagiert mit den Plättchen im Kreislauf in einem Mechanismus, der von dem Ibcoprotein Ibα-IX-V-Komplex auf der Zelloberfläche 1 abhängt, was die Geschwindigkeit der Thrombozyten verlangsamt. Dies ist besonders wichtig bei hohen Scherraten. Die Thrombozyten unterliegen anschließend morphologischen Veränderungen, während sie Aktivierungsimpulse aus Kollagen erhalten. Dies führt zu einer irreversiblen Ausbreitung und schließlich zu einer Blutplättchenaggregation. Beide Prozesse hängen von der Sekretion von Granulatinhalten ab, um das Plättchen-Plättchen-Übersprechen zu erleichtern. Unter anderem enthalten die Plättchen-α-Granulate Fibrinogen und VWF, um die Plättchenadhäsion zu unterstützen und zu überbrückenPlättchen zusammen in einer integrinabhängigen Weise. Die Thrombozyten-dichten Granulate enthalten anorganische Verbindungen 2 , einschließlich Calcium und Adenosindiphosphat (ADP), die zur Verstärkung der Thrombozytenaktivierung beitragen. Weiterhin enthalten die Blutplättchen Mediatoren von (allergischen) Entzündungen 3 , komplementkontrollierenden Proteinen 4 und Angiogenesefaktoren 5 , 6 , wobei die Frage aufgeworfen wird, ob und wie diese Inhalte unter verschiedenen Bedingungen unterschiedlich freigesetzt werden. Seit den 1980er Jahren ist die Untersuchung der Thrombozytenfunktion in Strömungsmodellen für die Untersuchung von thrombotischen Mechanismen wertvoll 7 . Seitdem wurden viel technischer Fortschritt gemacht, und Strömungsmodelle, die die Fibrinbildung einschließen, werden derzeit entwickelt, um das hämostatische Potential von therapeutischen Thrombozytenkonzentraten ex vivo 8 oder zu untersuchenUntersuchen den Einfluss von Störungen der Scherraten auf die Thrombusmorphologie 9 . Die Unterschiede in den molekularen und zellbiologischen Mechanismen, die eine stabile Adhäsion und physiologische Thrombusbildung (Hämostase) gegenüber der pathologischen Thrombusbildung (Thrombose) antreiben, können sehr subtil sein und die Entwicklung von Strömungsmodellen motivieren, die die Echtzeit-Visualisierung dieser Subzellulären ermöglichen Prozesse. Ein Beispiel für ein Verfahren, für das ein solches Setup wertvoll wäre, ist die (Re-) Verteilung von intrazellulärem Polyphosphat und die Rekrutierung von Gerinnungsfaktoren, um den zeitabhängigen Einfluss, den dies auf die Fibrin-Ultrastruktur 10 hat, aufzudecken. Studien sind oft auf Endpunktanalysen beschränkt. Das Hauptziel der beschriebenen Methode ist es, die visuelle visuelle Untersuchung von dynamischen subzellulären Prozessen zu ermöglichen, die während der Thrombozytenaktivierung unter Strömung stattfinden.

<table><tbody><tr><td>4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck KGaA</td><td>1,05886</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Merck KGaA</td><td>1,04074</td><td></td></tr><tr><td>Prostacyclin&nbsp;</td><td>Cayman Chemical</td><td>18220</td><td></td></tr><tr><td>Trinatriumcitrat</td><td>Merck KGaA</td><td>1.06448</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Merck KGaA</td><td>1.00244</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>BBAD02400500#A</td><td>24 x 50 mm, Nr. 1 = 0,13 - 0,16 mm Dicke.</td></tr><tr><td>Chromschwefelsäure (2% CrO3)</td><td>Riedel de Haen</td><td>07404</td><td>CAS [65272-70-0].</td></tr><tr><td>Von-Willebrand-Faktor (VWF)</td><td>hauseigene gereinigte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen-Enzym-Forschungslaboratorien</td><td></td><td>FIB3L</td><td></td></tr><tr><td>4-Well-Schale, unbehandelt</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td></td></tr><tr><td>Humanserumalbuminfraktion V</td><td>Haem Technologies Inc.</td><td></td><td></td>823022</tr><tr><td>Blutentnahmeröhrchen, 9 ml, 9NC Gerinnungsnatriumcitrat 3,2%</td><td>Greiner Bio-One</td><td>455322</td><td></td></tr><tr><td>Zellanalysator&nbsp;</td><td>Abbott Diagnostics</td><td>CELL-DYN Hämatologie-Analysator</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>30525-89-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td><td>Harvard apparatus 22</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Spritze mit 14,5 mm Durchmesser</td><td>BD biosciences</td><td>305959</td><td>Luer-Lok Spritze</td></tr><tr><td>Anti-CD63-biotin</td><td>Abcam&nbsp;</td><td></td><td></td>AB134331</tr><tr><td>Anti-CD62P-Biotin</td><td>Forschung & Forschung D Systems</td><td>Dy137</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI)</td><td>Polysciences Inc.&nbsp;</td><td>9224</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 Konjugat</td><td>Thermo Scientific</td><td>S11223&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Immersionsöl</td><td>Zeiss</td><td>444963-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Waschmittellösung</td><td>Unilever, Biotex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>56-40-6&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylalkohol</td><td>Sigma</td><td>9002-89-5</td><td>Mowiol 40-88.</td></tr><tr><td>Trishydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>1185-53-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan (DABCO)</td><td>Sigma</td><td>280-57-9</td><td></td></tr><tr><td>Schafe Anti-hVWF pAb</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>AB9378</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15523-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Parafinn Folie</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>4 Zoll x 125 Fuß Rolle.</td></tr><tr><td>Silikonplatte unverstärkt</td><td>Nagor</td><td>NA 500-1</td><td>200 mm x 150 mm x 0,125 mm.</td></tr><tr><td>Individuell zugeschnittene Silikonplatte mit Perfusions- und Vakuumkanälen</td><td>im eigenen Haus</td><td></td><td>hergestellt Hergestellt aus Silikonfolie unverstärkt (Nagor, NA 500-1)</td></tr><tr><td>1,5 mL Röhrchen</td><td>Eppendorf AG</td><td>T9661-1000AE</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss Observer Z1&nbsp;</td><td></td><td>Ausgestattet mit LED-Erregerlichtern.</td></tr><tr><td>Mikroskop-Software</td><td>Zeiss ZEN 2</td><td>blue edition</td><td></td></tr><tr><td>18 G Nadel (18 G x 1 1/2")</td><td>BD biosciences</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Riedel de Haen</td><td>31248375</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roche</td><td>10708976</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoff-Pasteurpipette</td><td>VWR</td><td>612-1681</td><td>&nbsp; 7 mL unsteril, graduiert bis zu 3 mL.</td></tr><tr><td>Silikonschlauch</td><td>VWR</td><td>228-0656</td><td>Innendurchmesser x Außendurchmesser x Wandstärke = 1,02 x 2,16 x 0,57 mm.</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Thermo Scientific</td><td>ABAA000001##12E</td><td>76 x 26 x 1 mm, geschliffene Kanten 45 Grad, mattiertes Ende.</td></tr></tbody></table>

live-zelle bildgebung von platelet degranulation und sekretion unter flow

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Blutplättchen sind wesentliche Akteure in der Hämostase, die Bildung von Thromben, um vaskuläre Brüche zu versiegeln. Sie sind auch an Thrombose beteiligt, die Bildung von Thromben, die das Gefäßsystem verschlingen und Organe verletzen, mit lebensbedrohlichen Konsequenzen. Dies motiviert die wissenschaftliche Forschung zur Thrombozytenfunktion und die Entwicklung von Methoden zur Verfolgung zellbiologischer Prozesse, wie sie unter Strömungsbedingungen auftreten. Für die Untersuchung der Thrombozytenadhäsion und -aggregation stehen eine Vielzahl von Strömungsmodellen zur Verfügung, zwei Schlüsselphänomene in der Thrombozytenbiologie. Diese Arbeit beschreibt eine Methode, um die Vollendung der Plättchendegranulation unter der Strömung während der Aktivierung zu untersuchen. Das Verfahren nutzt eine Strömungskammer, die mit einem Spritzenpumpenaufbau gekoppelt ist, der unter einem Weitfeld-, invertierten LED-basierten Fluoreszenzmikroskop angeordnet ist. Der hier beschriebene Aufbau ermöglicht die gleichzeitige Erregung von mehreren Fluorophoren, die von fluoreszenzmarkierten Antikörpern oder Fluoreszenzen abgegeben werdenEntfärbt. Nach Live-Zell-Imaging-Experimenten können die Deckgläser mit statischer Mikroskopie ( dh konfokale Mikroskopie oder Rasterelektronenmikroskopie) weiterverarbeitet und analysiert werden.

Fig. 1 zeigt Bilder der Strömungskammer und des experimentellen Aufbaus; Die Lage und die Abmessungen des Siliziumblechs; Und Schlauchverbindungen. Abbildung 2 gibt Auskunft über die Abmessungen der Durchflusskammer. Abbildung 3 und Film 1 zeigen eine Zeitreihe von Bildern der Plättchenadhäsion und Ausbreitung auf immobilisiertem VWF. CD63 ist ein Transmembranprotein, das in die Mem...

Diese Arbeit beschreibt eine Fluoreszenzmikroskopie-basierte Methode für die Untersuchung von Thrombozytenadhäsion, -ausbreitung und -sekretion unter Strömung. Diese vielseitige Plattform ermöglicht die Untersuchung der Thrombozytenfunktion für die mechanistische Forschung auf Thrombose und Hämostase.

Live-Zelle Bildgebung von Platelet Degranulation und Sekretion unter Flow

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Thrombozytendegranulation und -sekretion unter Flussbedingungen mittels Live-Cell-Imaging zu verfolgen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Thrombozytenbiologie zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine vielseitige Untersuchung der Thrombozyteninhalte auf subzellulärer Ebene in lebenden Zellen ermöglicht.Obwohl diese Methode Einblicke in die Thrombozytenfunktion ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere Zelltypen wie Mastzellen anwenden. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode neu beginnen, Schwierigkeiten aufgrund von Problemen bei der Thrombozytenisolierung in Form einer Präaktivierung. Wir hatten die ursprüngliche Idee für diese Methode, als uns bewusst wurde, dass die Thrombozytensekretion nur in Endpunktsituationen bewertet werden konnte.Echtzeitbilder liefern Informationen über die Freisetzungs­kinetik der thrombozytären Granula. Das Verfahren zur Thrombozyten­isolation wird von Silvia Pignatelli, einer Studentin an unserem Institut, demonstriert. Anschließend wird Arjan Barendrecht die Echtzeit­bildgebungs­experimente vorführen.Um zu beginnen, entfetten Sie Deckgläser, indem Sie sie über Nacht in unverdünnter Chromschwefelsäure inkubieren. Am nächsten Tag spülen Sie sie mit destilliertem Wasser ab. Anschließend trocknen Sie sie über Nacht bei 60 Grad Celsius im Ofen.Als Nächstes einen Wassertropfen auf eine Laborfläche geben und einen 10 Zentimeter mal 15 Zentimeter großen Streifen Paraffinfolie auf den Tropfen legen, wobei die Luft zwischen der Oberfläche und der Folie entfernt wird. Anschließend 80-Mikroliter-Tropfen einer Lösung mit 10 Mikrogramm pro Milliliter von-Willebrand-Faktor oder 100 Mikrogramm pro Milliliter Fibrinogen mittels Pipette auf die Paraffinfolie auftragen. Die trockenen Deckgläser auf die Tropfen legen und eineinhalb Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.Fügen Sie anschließend drei Milliliter Blockierpuffer in jede Vertiefung einer Vier-Vertiefungs-Platte hinzu. Überführen Sie die Deckgläser mit der beschichteten Seite nach oben in einzelne Vertiefungen der Platte. Inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius.Zentrifugieren Sie neun Milliliter citriertes Vollblut 15 Minuten lang bei 160 × g ohne Bremse. Sammeln Sie anschließend mit einer plastischen Pasteur-Pipette den Überstand, der das thrombozytenreiche Plasma enthält. Geben Sie zur Verhinderung einer präemptiven Thrombozytenaktivierung ein Teil ACD (Acid Citrate Dextrose) auf neun Teile Thrombozyten bezogen auf das Volumen hinzu.Anschließend zentrifugieren Sie die Thrombozyten 15 Minuten lang mit 400 × g ohne Bremse. Entfernen Sie danach vorsichtig den Überstand, sodass ein Thrombozytenpellet zurückbleibt. Resuspendieren Sie das Pellet anschließend vorsichtig im HEPES-Tyrode-Puffer bei einem pH-Wert von 6,5 auf das ursprüngliche Volumen der Thrombozytenprobe. Fügen Sie anschließend Prostazyklin zu den resuspendierten Thrombozyten hinzu. Zentrifugieren Sie die Probe sofort und entfernen Sie danach den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in HEPES-Tyrode-Puffer bei einem pH-Wert von 7,4.Als Nächstes die gewaschenen Thrombozyten in einen Zellanalysator geben und die Anzahl der Thrombozyten bestimmen. Die Anzahl der Thrombozyten in der Probe mit HEPES-Tyrode-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 auf eine Konzentration von 150.000 Thrombozyten pro Mikroliter einstellen. Nach der Resuspension die Thrombozyten vor dem Experiment 30 Minuten bei Raumtemperatur zur Erholung ruhen lassen.Bedecken Sie die Oberseite der Flusskammer mit destilliertem Wasser und legen Sie ein maßgeschneidertes Silikonblatt mit der glatten Seite nach unten auf das Wasser. Bringen Sie das Blatt durch Entfernen von überschüssigem Wasser in Position, wobei Sie das Blatt an Ort und Stelle halten. Inkubieren Sie die Flusskammer eine Stunde lang bei 60 Grad Celsius, um das restliche Wasser zu verdampfen und das Silikonblatt fest mit der Flusskammer zu verbinden.Mit der Kunststoff-Pasteurpipette einen Tropfen HEPES-Tyrode-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 auf den Flusskanal geben. Anschließend das vorbereitete Deckglas mit der beschichteten Seite nach unten auf den Flusskanal legen. Die Vakuumpumpe einschalten und auf einen Druck von etwa 10 Kilopascal einstellen, dann die Vakuumpumpe mit der Vakuumanschlussstelle der Durchflusskammer verbinden.Fügen Sie 10 Mikrogramm pro Milliliter DAPI-Färbemittel zu den gewaschenen Thrombozyten hinzu und wickeln Sie das Röhrchen mit den Thrombozyten in Aluminiumfolie ein. Inkubieren Sie anschließend 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Um eine Thrombozytenaktivierung zu verhindern, geben Sie Prostazyklin mit einer Endkonzentration von 10 Nanogramm pro Milliliter hinzu und zentrifugieren Sie die Thrombozyten unverzüglich 15 Minuten bei 400 × g, ohne die Bremse zu verwenden, um nicht gebundenes DAPI zu entfernen.Rekonstituieren Sie das Thrombozyten-Pellet in HEPES-Tyrode-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 bis zum ursprünglichen Volumen mit einer Konzentration von 150.000 Thrombozyten pro Mikroliter. Schalten Sie dann das Fluoreszenzmikroskop ein und laden Sie die Mikroskop-Software. Richten Sie die Bildgebungsparameter gemäß Tabelle 1 des begleitenden Textprotokolls ein.Blockieren Sie die Zulaufschlauchleitung, indem Sie eine 10-Milliliter-Spritze anschließen und Blockierpuffer in die Zulaufschlauchleitung ansaugen. Blockieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur und spülen Sie anschließend die Zulaufschlauchleitung, indem Sie HEPES-Tyrode-Puffer 7,4 in die Zulaufschlauchleitung ansaugen. Schließen Sie die blockierte Zulauf- und die unbehandelte Ablaufschlauchleitung an den Einlass und Auslass der Kammer an.Verbinden Sie dann die 10-Milliliter-Spritze mit dem Auslassschlauch. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf ein 100-fach-Objektiv und montieren Sie die Kammer mit der Glasoberfläche nach unten am Mikroskop. Anschließend führen Sie den Einlassschlauch in ein Gefäß mit HEPES-Tyrode-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 ein.Ziehen Sie manuell den Kolben der mit dem Auslassschlauch verbundenen Spritze, um die Lösung durch die Kammer zu ziehen und die Luft aus dem System zu entfernen. Danach setzen Sie die Spritze in die Spritzenpumpe ein und betreiben die Pumpe kurzzeitig, um den Kolben festzuziehen und einen stabilen Fluss zu gewährleisten. Sobald das Flusssystem bereit ist, geben Sie die Antikörper und/oder Farbstoffe zur Thrombozytensuspension hinzu und mischen vorsichtig.Drücken Sie dann die Zulaufschlauch ab und bewegen Sie ihn vom Puffer in das Röhrchen mit den markierten Thrombozyten. Wählen Sie die Live-Visualisierung in der Software aus. Fokussieren Sie das Mikroskop auf die Deckglasoberfläche und starten Sie die Pumpe mit 484 Mikrolitern pro Minute.Schalten Sie die Pumpe ein, bis die Thrombozyten die Durchflusskammer erreichen. Verringern Sie anschließend die Durchflussrate auf 7,5 Mikroliter pro Minute. Überwachen Sie die Oberfläche des Deckglases.Sobald sich das erste Thrombozyt zu haften beginnt, fokussieren Sie das Mikroskop auf dieses Thrombozyt und starten Sie die Aufnahme, indem Sie das Experiment in der Software initiieren. Nehmen Sie 30 Minuten lang auf und stoppen Sie dann die Spritzenpumpe. Speichern Sie die Rohdatendateien des Mikroskops, die alle Metadaten enthalten.Exportieren Sie die Filme bei Bedarf im MOV H 264-komprimierten oder AVI-unkomprimierten Format. Speichern Sie einzelne Bilder als JPEG- oder TIF-Dateien. Entfernen Sie nach Beendigung der Aufnahme die Kammer vom Mikroskop, reinigen Sie das Immersionsöl vom Glas, trennen Sie das Vakuum ab und nehmen Sie vorsichtig das Deckglas mit einer 18-Gauge-Nadel aus der Kammer heraus.Legen Sie den Deckel mit den Zellen, die nach oben zeigen, in eine neue Vier-Well-Platte auf ein mit destilliertem Wasser vorbenetztes Tuch. Pipettieren Sie dann 750 Mikroliter einer Fixierungslösung auf das Deckglas und inkubieren Sie es eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Falls die Proben nicht direkt analysiert werden können, lagern Sie sie bei vier Grad Celsius in 0,5 % Paraformaldehyd, um eine stabile Fixierung zu gewährleisten.Dies zeigt die Zeitreihe der Thrombozytenadhäsion und -ausbreitung auf Glasobjektträgern, die mit immobilisiertem von-Willebrand-Faktor beschichtet sind. In Grün dargestellt ist CD63, ein Transmembranprotein, das zeitabhängig auf die Thrombozytenoberfläche mobilisiert wird. Ebenfalls in Orange dargestellt, ist P-Selektin ein weiteres Transmembranprotein, das in die Membran intrazellulärer α-Granula eingelagert ist und Thrombozyten anheftet.Nach einem Durchflussexperiment kann die konfokale Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um eine Kippreihe der Thrombozytenadhäsion aufzunehmen. Hier ist zu sehen, dass CD63 hauptsächlich im zentralen Granulomer lokalisiert ist, während P-Selektin über den gesamten Zellkörper verteilt ist und an den Rändern angereichert zu erscheinen scheint. In diesen Experimenten wurden Thrombozyten, die keine nukleäre DNA besitzen, zuvor mit DAPI inkubiert, das blau erscheint.In diesem Fall f&auml;rbt DAPI die Polyphosphate und dichten Granula. Die sp&auml;ter als gr&uuml;ne F&auml;rbung erscheinende Markierung zeigt die zeitabh&auml;ngige Mobilisierung von CD63 auf die Thrombozytenoberfl&auml;che. Trotz deutlicher Anzeichen f&uuml;r die Freisetzung dichter Granula zeigt die Einzelzellanalyse, dass Polyphosphat innerhalb oder au&szlig;erhalb dieser Thrombozyten zur&uuml;ckgehalten wird.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie für vier einzelne Durchflussexperimente innerhalb von sechs Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, eine präaktivierte Thrombozytenaktivierung zu vermeiden. Dies kann durch eine sorgfältige Handhabung der Zellsuspension erreicht werden.Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie die konfokale Mikroskopie verwendet werden, um zusätzliche Einblicke in die dreidimensionale Verteilung von Zielmolekülen zu erhalten. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Thrombozytenfunktion unter Flussbedingungen auf Einzelzell-Ebene untersucht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Plättchenadhäsion Kaskade erfolgt in Gegenwart von Scherströmung, ein Faktor, nicht entfielen in konventionellen (statischen) Well-Platte-Assays. Dieser Artikel berichtet über eine Thrombozyten-Aggregation-Assay unter Verwendung eines mikrofluidischen Well-Platte-Format auf physiologische Scherströmung Bedingungen zu emulieren.

Adhäsion und Aggregation unter Fluss mit Mikrofluidik-Flow-Cells

Hier berichten wir über eine experimentelle Technik der Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündungen und Thrombusbildung in lebenden Mäusen sichtbar zu machen. Diese mikroskopische Technik wird wertvoll sein, um die molekularen Mechanismen der vaskulären Erkrankungen zu studieren und pharmakologische Mittel unter pathophysiologischen Bedingungen zu testen.

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Leukozyten überqueren die endothelialen Monolayer mit Hilfe der parazellulären oder transzelluläre Route. Wir haben einen einfachen Test zu folgen die Verteilung endogener junctional VE-Cadherin und PECAM-1 während Leukozyten transendotheliale Migration unter physiologischen Fluss zwischen den beiden Seelenwege unterscheiden.

Echtzeit-Bildgebung von Zell-Zell-Endothelial Junctions Während Neutrophile Transmigration unter physiologischen Fluss

Die Thrombozytentransfusion und Hämostase wurde unter Verwendung von Blutrekonstitution und mikrofluidischen Flusskammern modelliert, um die Funktion von Blutbankplättchen zu untersuchen. Die Daten zeigen die Auswirkungen einer Thrombozytenspeicherung auf die Blutstillung in vitro.

Mikrofluidik-Strömungskammern Mit Rekonstituierte Blut Hämostaseologie und Transfusions Platelet zu Modell<em&gt; In Vitro</em

Dieses Dokument beschreibt ein experimentelles Modell der Hämostase, die Thrombozytenfunktion und Koagulation gleichzeitig misst. Blutplättchen- und Fibrin- Fluoreszenz wird in Echtzeit gemessen und die Plättchenadhäsion Rate, Gerinnungsrate und Einsetzen der Gerinnung bestimmt. Das Modell wird verwendet, um die Thrombozyten Prokoagulanz-Eigenschaften unter Strömung in Konzentraten für Transfusions bestimmen.

Ein Mikrofluidik-Flow-Kammer-Modell für Platelet Transfusions und Hämostase Maßnahmen Platelet Deposition und Fibrinbildung in Echtzeit

Leukozyten Interaktion eifrig mit vaskulären Zellen und Blutplättchen nach Schiff Wand Unfall oder während einer Entzündung. Hier beschreiben wir einen unkomplizierten Laminar-Flow-based Assay zur Charakterisierung der molekularen Mechanismen, die die Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und ihre zellulären Partner zugrunde liegen.

Laminar-Flow-based Assays, Rekrutierung von Leukozyten auf kultivierten vaskuläre Zellen und adhärenten Thrombozyten zu untersuchen

Wir beschreiben eine In-Solation-Methode, mit der mittels der Vonenplattenviskometrie einheitliche Schere auf Plattenoberflächen aufgetragen werden kann. Diese Methode kann auch breiter verwendet werden, um Schere auf andere Zelltypen und Zellfragmente aufzutragen und muss nicht auf ein bestimmtes Liga-Rezeptor-Paar zielen.

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Wir beschreiben hier die Methode zur Abbildung von Megakaryozyten und Blutplättchen im Knochenmark des Schädelknochens lebender Mäuse mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie.

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Die Bildung von prokoagulanzien Blutplättchen wurde mit einem erhöhten Thromboserisiko korreliert. Hier wird ein präzises Protokoll zur Isolierung von gewaschenen Blutplättchen aus menschlichem Blut vorgestellt, das dazu bestimmt ist, die Exposition von Phosphatidylserin und Mikrovesikelfreisetzung zu quantifizieren, die charakteristische Merkmale von Prokoagulanzienthrombozyten sind.

Charakterisierung von Prokoagulanzien-Thrombozyten durch Messung der Phosphatidylserin-Exposition und der Mikrovesikelfreisetzung aus humanen gereinigten Blutplättchen

Die Thrombozytenfunktion unter Fluss kann beurteilt und eine simulierte hämostatische Wiederbelebung mit einem mikrofluidischen Gerät modelliert werden, das in der Trauma- und Transfusionsmedizin Anwendung findet.

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Die Mehrfarben-Durchflusszytometrie für Blutplättchen kann neue Thrombozyten-Subtypen innerhalb klassischer Thrombozyten-Subpopulationen identifizieren, wie z. B. ruhende, aggregierte, prokoagulanzielle und apoptotische Thrombozyten. Dies ermöglicht den Vergleich verschiedener Subpopulationsmuster, die durch verschiedene Thrombozytenagonisten induziert werden. Hier wird ein Verfahren zur Etablierung eines mehrfarbigen Durchflusszytometrie-Panels ausführlich beschrieben.

Analyse von Thrombozyten-Subpopulationen durch Mehrfarben-Durchflusszytometrie

Lernen Sie eine Fluoreszenzmikroskopie-basierte Methode zur Untersuchung von Thrombozytenadhäsion, -spreizung und -sekretion unter Flussbedingungen. Diese vielseitige Plattform ermöglicht mechanistische Forschung zu Thrombose und Hämostase.

Live-Zelle Bildgebung von Platelet Degranulation und Sekretion unter Flow

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