Bestimmung der hochaffine Antikörper-Antigen-Bindung Kinetics mit vier Biosensorplattformen

Das Ziel dieser Biosensorstudie ist es, die Fähigkeit der vier routinemäßig verwendeten Biosensorplattformen zu vergleichen, qualitativ hochwertige kinetische Daten zu liefern und Einblicke in technische Herausforderungen und Überlegungen in Versuchsdesigns zur Bewertung hochaffiner Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen zu geben. Diese Studie beantwortet Schlüsselfragen im Bereich der Wirkstoffforschung für die Auswahl von Biosensorplattformen und Assay-Formaten, die die zuverlässigsten Ergebnisse bei der Bewertung therapeutischer Antikörperkandidaten ermöglichen. Der Hauptvorteil dieser Studie besteht darin, dass sie einen direkten und umfassenden Vergleich der verschiedenen Biosensorplattformen im Hinblick auf Datenkonsistenz, Qualität und Betriebseffizienz ermöglicht.

Eine Videodemonstration der vier Protokolle ist von entscheidender Bedeutung, da sie neuen Benutzern mit wenig praktischer Erfahrung hilft, zu lernen, wie sie Experimente auf diesen Instrumenten einrichten können. Für kinetische Messungen im Biacore T100 klicken Sie auf Datei, Neue Methode öffnen und öffnen Sie die Methodendatei. Überprüfen Sie die Parameter in der Methode.

Legen Sie unter Zyklustypen die Kontaktzeit auf 220 Sekunden für Erfassung 1 über Strömungsweg 2, 110 Sekunden für Erfassung 2 über Strömungsweg 3 und 55 Sekunden für Erfassung 3 über Strömungsweg 4 fest. Die Durchflussrate beträgt 10 Mikroliter pro Minute für alle Erfassungszyklen. Wählen Sie Probe 1 aus, und überprüfen Sie die Beispiellösung als Variable.

Stellen Sie dann die Kontaktzeit auf 600 Sekunden und die Dissoziationszeit auf 2.700 Sekunden über den Strömungsweg 1, 2, 3, 4 ein. Die Durchflussmenge ist auf 30 Mikroliter pro Minute eingestellt. Wählen Sie als Nächstes Regeneration 1 aus, geben Sie Glycin HCl pH 1,5 in das Lösungsfeld ein und stellen Sie die Kontaktzeit über den Durchflussweg 1, 2, 3, 4 auf 20 Sekunden ein.

Geben Sie in den Variableneinstellungen zweifache Titrationskonzentrationen von 100 Nanomolar bis 6,25 Nanomolar für den Zyklus 1-3, 50 Nanomolar bis 3,12 Nanomolar für den Zyklus 4-8 und 5 Nanomolar bis 0,323 Nanomolar für den Zyklus 9-10 ein. Wählen Sie unter Setup Run den Erkennungsablaufpfad 2-1, 3-1, 4-1 aus, und klicken Sie dann auf Weiter. Aktivieren Sie Prime vor dem Ausführen und klicken Sie dann erneut auf Weiter.

Wählen Sie Proben- und Reagenzienablage 1 aus und definieren Sie den Standort für die Reagenzien. Pipettieren Sie die Reagenzien entsprechend in die einzelnen Probenfläschchen und setzen Sie das Gestell in das Gerät ein. Klicken Sie auf Eject Rack, um die Klappe des Probenfachs zu öffnen, und setzen Sie dann das Probenrack in das Gerät ein.

Klicken Sie dann auf Start, und geben Sie einen Experimentnamen ein, der gespeichert werden soll, um den Lauf zu starten. Beginnen Sie für die kinetischen Messungen im ProteOn XPR36 mit der Immobilisierung, indem Sie Protokolle und dann Proben auswählen. Definieren Sie EDC/Sulfo-NHS als Aktivator in den Vertiefungen H1-H6, Protein A/G als Liganden in G1-G6, Ethanolamin als Deaktivator in F1-F6, Glycin als Regenerator in E1-E6, PBS-T-EDTA als Blindwert in D1-D6, monoklonale Antikörper-X-Probe als Ligand in C1-C6 und humanes PCSK9 als Analyt in den Vertiefungen B1-B6.

Wählen Sie Schritte aus, und doppelklicken Sie dann im Protokolleditor auf Immobilisierung. Die Schritte umfassen drei aufeinanderfolgende horizontale Injektionen von EDC/Sulfo-NHS, Protein A/G und einem molaren Ethanolamin. Jede Injektion sollte eine Durchflussrate von 30 Mikrolitern pro Minute und eine Kontaktzeit von 300 Sekunden haben.

Klicken Sie anschließend auf Regenerieren. Injizieren Sie drei 18-Sekunden-Impulse Glycin mit 100 Mikrolitern pro Minute sowohl in horizontaler als auch in vertikaler Richtung. Anschließend folgen zwei 60-Sekunden-Impulse PBS-T-EDTA mit 25 Mikrolitern pro Minute, ebenfalls in beide Richtungen.

Klicken Sie dann auf Ligand und injizieren Sie den monoklonalen Antikörper 1, den monoklonalen Antikörper 2 in vertikaler Richtung mit einer Flussrate von 25 Mikrolitern pro Minute und einer Kontaktzeit von 160 Sekunden. Nachdem Sie auf Analyt geklickt haben, injizieren Sie gleichzeitig fünf Konzentrationen von humanem PCSK9 in einen Blankpuffer über sechs horizontale Kanäle. Verwenden Sie 40 Mikroliter pro Minute für 600 Sekunden Assoziationszeit, gefolgt von 2.700 Sekunden Dissoziationszeit.

Klicken Sie dann auf Regenerieren und injizieren Sie zwei 18-Sekunden-Impulse Glycin mit 100 Mikrolitern pro Minute sowohl in horizontaler als auch in vertikaler Richtung. Bereiten Sie anschließend die Proben und Reagenzien in einer 96-Well-Platte entsprechend den definierten Reagenzienpositionen vor. Übertragen Sie die Platte auf das Gerät und klicken Sie dann auf die Registerkarte Ausführen, wählen Sie das Protokoll aus und klicken Sie auf Start.

Die Sechs-Nadel-Parallelinjektion bei der Aufzeichnung von Live-Experimentaldaten wird demonstriert. Für die kinetischen Messungen im Octet RED384 richten Sie die experimentelle Methode ein, indem Sie zuerst auf Experiment, dann auf New Experiment Wizard, New Kinetics Experiment und dann Basic Kinetics in der Datenerfassungssoftware klicken. Klicken Sie dann auf Platten ändern, und ändern Sie 96 Wells in 384 Wells sowohl in Plate 1 als auch in Plate 2.

Definieren Sie die Probentypen und -positionen in der Platte, wie im Textprotokoll beschrieben. Navigieren Sie zur Assay-Definition, um den Versuchsaufbau zu definieren. Der Versuchsaufbau ist definiert als eine Basiszeit von 30 Sekunden, eine Regenerationszeit von 30 Sekunden, eine Äquilibrierungszeit von 18 Sekunden, eine Belastung mit einer Zeit von 200 Sekunden, eine Assoziationszeit von 500 Sekunden und eine Dissoziationszeit von 1.800 Sekunden.

Die Rüttelgeschwindigkeit ist auf 1.000 U/min eingestellt. Um die Schritte zur Liste der Assay-Schritte hinzuzufügen, klicken Sie zunächst auf einen Schritt und dann auf die Vertiefungen, die sich entweder in der Probe oder in der Reagenzplatte befinden. Geben Sie zunächst die Äquilibrierungsregenerationsanweisungen ein, um die Anti-Human-Fc-Erfassungssensoren durch drei Zyklen von 15-Sekunden-Einbrüchen von Glycin abwechselnd mit 15-Sekunden-Einbrüchen in 1XKB vorzukonditionieren.

Geben Sie dann die Ladeanweisungen ein, um die monoklonalen Antikörperproben 200 Sekunden lang auf den Fc-Erfassungssensoren für den Menschen zu erfassen. Geben Sie als Nächstes die Basisanweisungen ein, um das Interferometriesignal der Bioschicht 60 Sekunden lang vor dem Assoziationsschritt zu ermitteln. Geben Sie den Assoziationsschritt ein, um die Sensoren für einen Assoziationszeitraum von 500 Sekunden in Vertiefungen mit unterschiedlichen Konzentrationen von humanem PCSK9 zu tauchen.

Geben Sie den Dissoziationsschritt ein, um die PCSK9-gebundenen Sensoren für einen Dissoziationszeitraum von 1.800 Sekunden in neue Wells von 1XKB einzutauchen. Tauchen Sie schließlich für den Regenerationsschritt die monoklonalen Antikörper-PCSK9-gebundenen Sensoren mit zwei 18-Sekunden-Impulsen zwischen jedem Bindungszyklus in Vertiefungen mit Glycin. Gehen Sie zu "Experimente überprüfen", gleiten Sie durch die Schritte und klicken Sie dann auf die grüne Schaltfläche "Öffnen", um das Probenfach zu öffnen.

Übertragen Sie die Probenplatten in das Gerät. Navigieren Sie zu "Experimente ausführen", geben Sie eine Verzögerungszeit von 60 Sekunden ein und schütteln Sie die Probenplatte, während Sie warten. Legen Sie die Plattentemperatur auf 25 Grad Celsius fest, geben Sie den Namen des Experimentlaufs ein, und drücken Sie dann Go.Live Datenerfassung wird hier angezeigt.

Für kinetische Messungen mit mehreren Zyklen im IBIS-MX96 installieren Sie den Sensorchip in den kontinuierlichen Durchfluss-Microspotter. Öffnen Sie die CFM2.0-Software und klicken Sie dann auf "Einstellungen laden" und dann auf "96 Amine Couple". Setzen Sie die beiden Proben- und Reagenzplatten in den CFM-Drucker ein.

Um das Antikörper-Array zu erstellen, klicken Sie auf Ausführen, um den Drucker zu starten, und geben Sie das EDC/Sulfo-NHS in der oberen Hälfte der Reagenzplatte mit 48 Mikrokanälen an den Sensor ab und lassen Sie es fünf Minuten lang über die Sensoroberfläche laufen. Geben Sie die monoklonalen Antikörperproben in der oberen Hälfte der Quellplatte an den Sensor und lassen Sie sie 10 Minuten lang über die aktivierten Oberflächen zirkulieren. Geben Sie dann den Immobilisierungspuffer aus einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen fünf Minuten lang über die Antikörperoberfläche.

Docken Sie den gedruckten Sensorchip an das Gerät an. Klicken Sie in der Steuerungssoftware auf Datei, Messung öffnen, Vorhandene Messung und wählen Sie die Methodendatei aus. Übertragen Sie den gedruckten Sensorchip in das Gerät.

Wählen Sie im Menü "Allgemein" unter "Volles Systemskript" die Option "G-System Prime" aus. Wählen Sie dann G-Quench, um die monoklonalen Antikörperoberflächen zu deaktivieren, indem Sie 150 Mikroliter eines molaren Ethanolamins injizieren. Wählen Sie im Analysezyklus unter IBIS-Skripte die Option A-AP Standard Run aus.

Legen Sie 1,0 Minuten für die Grundlinie, 10,0 Minuten für die Assoziation und 90 Schritte für die Dissoziation bei einer Geschwindigkeit von acht Mikrolitern pro Sekunde fest. Injizieren Sie innerhalb der Zyklen humanes PCSK9 in einer Konzentration nach der anderen, gefolgt von fünf Pufferinjektionen. Regenerieren Sie die monoklonalen Antikörperoberflächen mit Glycin zwischen den einzelnen Bindungszyklen.

Aufgezeichnete Bindungssensorgramme in Eins-zu-Eins-Überlagerungen der kinetischen Modellanpassung werden für die Antikörper gezeigt, die mit humanem PCSK9 in vier Instrumenten interagieren. Die Bindungsprofile der Antikörper bei mehreren Dichten sind bei allen Instrumenten ähnlich. Obwohl die Geschwindigkeitskonstanten, die mit jedem der Antikörper verbunden waren, zwischen den Instrumenten variierten, blieben ihre Rangordnungen größtenteils gleich.

Es wurde die Reproduzierbarkeit und Konsistenz von Affinitäten in den kinetischen Raten über mehrere Antikörperoberflächen untersucht. Wie hier gezeigt, wurde für alle Gangkonstanten, die mit dem Biacore T100 und ProteOn XPR36 erzeugt wurden, eine starke Linearität beobachtet. Die von Octet RED384 erzeugten Ratenkonstanten waren jedoch aufgrund von Schwankungen in einigen der Off-Raten weniger linear.

Dies wurde möglicherweise durch Probenverdunstungen im Laufe der Zeit in der Mikroplatte verursacht. Die vom IBIS-MX96 erzeugten Geschwindigkeitskonstanten waren aufgrund von Schwankungen in der Oberflächenheterogenität ebenfalls weniger linear. Die Antikörperbindungsaktivitäten der meisten Systeme waren konsistent, während für die amingekoppelte Methode aus dem IBIS-MX96 eine etwa zehnfach geringere Aktivität beobachtet wurde.

Dies war möglicherweise auf die Inaktivierung von Antikörpern oder die Erzeugung von Antikörperorientierungen zurückzuführen, die für die Antigenbindung nicht leitfähig waren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Experimente auf jeder der vier Biosensorplattformen einrichten und wie Sie die geeignete Biosensortechnologie für Ihren eigenen Forschungszweck auswählen. Unsere Kopf-an-Kopf-Vergleichsstudie zeigt, dass jede Biosensor-Plattform ihre eigenen Vor- und Nachteile hat.

Trotz gewisser inhärenter systematischer Einschränkungen in der Instrumentierung war die direkte Reihenfolge sowohl der Assoziations- als auch der Dissoziationsratenkonstanten zwischen diesen Instrumenten stark korreliert. Für die Zwecke der Kandidateneinstufung kann unter der Annahme, dass die Anzahl der Proben und die Menge des Materials keine begrenzenden Faktoren sind, jedes dieser Instrumente verwendet werden, da sie die Antikörper unabhängig vom Importinstrument vergleichbar differenzieren können. Es gibt einen Kompromiss zwischen der Zuverlässigkeit der Daten und dem Probendurchsatz.

Der Biacore T100, gefolgt vom ProteOn XPR36R, wies die beste Datenqualität und -konsistenz auf. Octet RED384 und IBIS-MX96 hingegen weisen eine hohe Flexibilität und einen hohen Durchsatz auf, bei denen Kompromisse bei der Datengenauigkeit und -konsistenz eingegangen sind. Für Studien, die eine empfindliche und zuverlässige Detektion erfordern, ist entweder Biacore T100 oder ProteOn XPR36 am besten geeignet.

Für Studien, bei denen die Geschwindigkeit ein kritischer Faktor ist und eine große Anzahl von Proben beteiligt ist, wird entweder Octet Red384 oder IBIS-MX96 bevorzugt. Geräte mit kontinuierlicher Strömung X liefern qualitativ hochwertige Daten zur Auflösung von Wechselwirkungen mit langsamen Dissoziationsraten. Die größte Einschränkung für das BRI-Fluid-ex-a-fray-Instrument ist die Probenverdampfung im Laufe der Zeit in der Mikroplatte, die zu einer Aufwärtsdrift führen kann, die die Datengenauigkeit beeinträchtigt.