Name: Bestimmung der hochaffine Antikörper-Antigen-Bindung Kinetics mit vier Biosensorplattformen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie hochaffine Antikörper-Antigen-Bindungskinetiken mit vier Biosensorplattformen messen. Diese Methoden helfen Forschern bei der Auswahl zuverlässiger Systeme für die Arzneimittelentwicklung.

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Die Autoren danken Noah Ditto und Adam Miles für technische Hilfe bei der IBIS MX96.

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Publikationsgebühren für diese Video-Artikel wurden von Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals bezahlt.

Unsere Kopf-an-Kopf-Vergleichsstudie zeigt, dass jede Biosensor-Plattform ihre eigenen Stärken und Schwächen hat. Auch wenn die Bindungsprofile der Antikörper sind ähnlich durch einen visuellen Vergleich (Abbildungen 3 bis 6) und die Rangordnung der erworbenen kinetischen Geschwindigkeitskonstanten sind sehr konsistent über die Instrumente (Abbildung 7), unsere Ergebnisse zeigen , dass SPR-basierte Instrumente mit kontinuierlicher Fluss Fluidik) besser an hochaffine Wechselwirkungen Lösung mit langsamen Dissoziationsraten. Aufwärtsdrift während der Dissoziationsphase wird in Datensatz beobachtet (beispielsweise mAb 2, mAb 5 und mAb 9; Figur 5) , die durch das BLI Fluidik freies Instrument. Diese Feststellung kann zum großen Teil auf Probenverdampfung im Laufe der Zeit in der Mikroplatte zugeschrieben werden, die eine primäre Begrenzung des Systems ist. Mit dieser inhärenten Einschränkung wird die Versuchszeit auch auf weniger als 12 h begrenzt; Experimente wurden daher mit sh programmiertOrter Zeiten (500 s Assoziation und Dissoziation 30 min) im Vergleich zu denen der anderen Plattformen (10 min und 45 min Assoziation Dissoziation). Allerdings hat die Versuchszeit verkürzt wird nicht angezeigt , um die Auswirkungen der Verdampfung auf der Datenqualität / Konsistenz zu mildern, als die Rate erzeugt Konstanten , die durch das BLI-basierte Instrument zeigt weniger Linearität infolge von Schwankungen in einige der off-Raten (8C ). Neben Probe Verdunstung, Unterschiede in den Fangreagenzien verwendet haben auch in den Ergebnissen der Unterschiede beigetragen. Während Protein-A / G in allen drei Fluidik-basierten Plattformen SPR verwendet wurde, wurden AHC-Sensoren in der nicht-Fluidik BLI Plattform verwendet. Da Protein A / G ist wahrscheinlich eine schwächere Affinität für den mAbs haben, als dies der AHC, ein Antikörper-basierte Biosensor-Oberfläche, als diejenigen, die off-Raten des mAb-Antigen-Komplexes aus dem Protein A / G Oberflächen künstlich schneller erscheinen von der AHC Oberfläche erhalten. Diese Möglichkeit wird unterstützt by die experimentellen Daten , die zeigen , dass die off-Rate von der Plattform BLI erzeugten Werte als die von den anderen Instrumenten (7, rote Linie) erhalten durchweg niedriger waren. Dennoch hat die BLI-Plattform verschiedene Vorteile gegenüber den anderen Plattformen. Zum Beispiel ist es sehr flexibel in Bezug auf Sensor Auswahl und Assaykonfiguration aufgrund der verschiedenen vorbeschichtet Sensoren für den sofortigen Gebrauch. Verwendung der AHC-Sensoren In unseren Experimenten eliminiert die Notwendigkeit für Ligand Immobilisierung Schritte, die Verringerung der Vorbereitungszeit. Darüber hinaus erfordert die BLI-Plattform viel weniger Wartung im Vergleich zu den anderen Fluidik SPR-Plattformen, die komplizierte Schläuche und Wert Switch-Konfigurationen verfügen. Diese Funktion ist ein Vorteil für Experimente mit rohen Proben, die Verstopfung und Verschmutzung Probleme verursachen kann. Da die Nachfrage nach effizienten, schnellen und genauen Identifizierung von therapeutischen Kandidaten erhöht, die Notwendigkeit biosensor Durchsatz steigt ebenfalls. Unter den vier Biosensorplattformen, der Durchsatz von dem Biosensor der Lage, 96-Liganden-Array-Druck ist am höchsten ist, durch den Biosensor gefolgt gekoppelt mit einem kreuz und quer durch 36-Liganden-Format und der BLI-basierten Biosensor mit 16-Kanal-Simultanauslese, die letztlich erhöhen die Anzahl der Wechselwirkungen in einem einzelnen Bindungszyklus gemessen auf 96, 36 bzw. 16. Diese Durchsatzkapazitäten sind deutlich höher als die der herkömmlichen SPR-Plattform, die sich durch nur vier Fließzellen begrenzt wird durch einen einzigen seriellen Fluss verbunden. Da unsere Experimente einen relativ kleinen Probensatz von 10 mAbs bewertet an mehreren Oberflächendichten mit langen Dissoziation Zeiten beteiligt, spielten die Instrumentaldurch eine moderate Rolle, die Effizienz der Versuche zu bestimmen. Es gab keine signifikanten Unterschiede in den experimentellen Zeiten der drei Hochdurchsatz-Plattformen und in allen Fällen wurden die Versuche in einem Tag abgeschlossen. Auf der anderen Seite sind die traditionellen seriellen Fluss SPR Experimente erforderlich 3 Tage in Anspruch nehmen, trotz der Walk-away Automatisierung der Datenerfassung nach dem Setup. In anderen Studien , die eine große Anzahl von Proben (dh in den Hunderten oder Tausenden), für die Off-Rate - Ranking / kinetischen Screening oder Epitop Binning Zwecke beinhalten, wird der Durchsatz ein kritischer Faktor. Obwohl der Durchsatz in der IBIS MX96 Größenordnungen höher ist als die der anderen Biosensoren und ist daher eine optimale Wahl für diese Zwecke hat es einige Mängel. Insbesondere zeigt das Array Drucken durch die CFM große Oberfläche Inkonsistenzen (Abbildung 1) und reduzierte Datenreproduzierbarkeit (8D und 8E). Für eine genaue kinetische Messungen wird die Menge an Liganden auf der Biosensoroberfläche ein kritischer Parameter, der gesteuert werden muss, um sicherzustellen, dass die Bindungsreaktionen nicht durch Sekundärfaktoren, wie beispielsweise gestörtMassentransfer oder sterische Hinderung. Für den Biacore T100 und PROTEON XPR36 wurden die optimalen Niveaus L R auf der Grundlage der Standardberechnung des Satzes R max - Werte bestimmt , wie 17 in der Forschung Artikel beschrieben. Auf der anderen Seite, für die die Oktett RED384 und IBIS MX96 Plattformen wurden die mAb capture Ebenen empirisch unter Verwendung einer Reihe von 2-fach seriell verdünnten Antikörper in konstanten Zeiten erreicht. Der Mangel an Wissen oder Steuerung des Einfangschritt führte zu einer hochdichten Oberfläche und hohen Bindungsantwortsignalen (Abbildung 2), die die Genauigkeit der kinetischen Geschwindigkeitskonstanten beeinträchtigt haben könnten. Darüber hinaus stellt die Trennung des Druckers aus dem SPR-Detektor auch eine Herausforderung, wenn mehrere Bindungszyklusmessungen die Regenerationen leiten. Der einzige Weg, um den Multi-cycle kinetics Setup durchzuführen war, durch direkte Kopplung des Amin mAbs, wie durch den mAb Fc durch das immobilisierte Protein A / G zu erfassen, im GegensatzOberfläche in den anderen drei Biosensorplattformen. Als Ergebnis wurde ein zusätzliches Regeneration Scouting Experiment erforderlich, um die optimalen Regenerationsbedingungen zu bestimmen. Das Ergebnis dieser Anordnung wurde auf eine ~ 90% niedriger beobachteten Oberflächenaktivität verknüpft verglichen mit dem Fc - Capture - Verfahren (Figur 9), zusätzlich zu einer längeren Versuchszeit. Zur Ausführung wurde die Fc-Capture-Methode ein alternativen Single-Cycle-kinetischer Ansatz angenommen. Dieser Ansatz beinhaltet die sequentielle Injektion von Analyten bei Konzentrationen ohne Regeneration zwischen jeder Injektion (Abbildung 2) zu erhöhen. Dieser sehr bequem, aber weniger häufig angewandt Ansatz nicht nur die Versuchszeit verkürzt und Reagenzienverbrauch reduziert, sondern auch die kinetischen Geschwindigkeitskonstanten sehr ähnlich zu denen von den anderen Biosensoren (Abbildung 7) hergestellt. Daher überwindet die inhärente Beschränkung Konfiguration dieses Single-Cycle-Kinetik Ansatz Anwendung des Instruments und stellt einMöglichkeit für die hochauflösende kinetische Geschwindigkeitskonstanten in einer Hochdurchsatz-Weise zu erhalten. Trotz des Durchsatz eine große Einschränkung in der Biacore T100 sein, unsere Ergebnisse zeigen gemeinsam, dass sie die meisten konsistenten Daten mit höchster Qualität erzeugt. Dies wurde von der PROTEON XPR36 gefolgt, das hat ~ 10-fach höheren Durchsatz. Ihre Fähigkeit, qualitativ hochwertige Daten zu erzeugen, wird ein Vorteil, wenn die Charakterisierung hochaffine Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen, die technisch anspruchsvoll sein können, wenn die Nachweisgrenzen der Instrumente erreicht werden. Während die systematischen Einschränkungen in Instrumentierung des Octet RED384 die genaue Messung der Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten hindern (dh kurz die Empfindlichkeit fällt bei langsamer Off-Raten ausreichenden Signalabfall zu lösen), die beide der Biacore T100 und PROTEON XPR36 kann empfindlich und zuverlässig liefern Nachweis für die Differenzierung.

Die Erfassung zuverlässiger kinetischer Parameter zur Charakterisierung von Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen ist ein wesentlicher Bestandteil des Prozesses der Arzneimittelforschung und -entwicklung1. Optische Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Biosensoren, der "Goldstandard" für die Echtzeit-Detektion dieser Wechselwirkungen, werden seit etwa zwei Jahrzehnten eingesetzt, um eine frühzeitige Auswahl von therapeutischen Antikörperkandidaten zu ermöglichen2,3. Neben der Bereitstellung einer Affinitätseinstufung von Antikörperkandidaten durch das schnelle Bindungsscreening von Rohüberständen4 und strenge kinetische Konstantenbestimmungen von gereinigten Präparaten5, können Biosensoren die funktionelle Aktivität von Leitkandidaten über Epitop-Binning-Studien weiter differenzieren6,7. 
Um der wachsenden Nachfrage nach Antikörper-basierten Produkten für verschiedene therapeutische Indikationen gerecht zu werden8, wurde in den letzten Jahren eine Vielzahl innovativer Biosensor-Instrumente entwickelt, die die Effizienz der Kandidatenidentifikation und -charakterisierung erhöhen9,10. Diese Instrumente unterscheiden sich in der mikrofluidischen Kanalkonfiguration, dem Design und/oder in den optischen Prinzipien, die bei der Detektion biomolekularer Wechselwirkungen zum Einsatz kommen. Konkret haben die Octet RED38411, ProteOn XPR3612 und IBIS MX967 die Anzahl der in einem einzigen Bindungszyklus gemessenen Interaktionen auf 16, 36 bzw. 96 erweitert, was eine erhebliche Durchsatzverbesserung gegenüber der herkömmlichen Biacore-Plattform darstellt. Obwohl diese verschiedenen Biosensorplattformen alle wesentliche kinetische Daten für die Charakterisierung von Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen liefern, unterscheiden sie sich im Versuchsaufbau und in den Betriebsverfahren aufgrund unterschiedlicher instrumenteller Konfigurationen. In der SPR-Imaging-Array-Plattform des IBIS MX96 wird beispielsweise der Schritt der Multiplex-Liganden-Immobilisierung in einem Offline-Modus in einem externen Druckgerät durchgeführt, das vom Detektor getrennt ist7,13; Im Gegensatz dazu verwenden die anderen drei Biosensorplattformen einen "All-in-One"-Aufbau, bei dem die Zugabe einer Komponente auf die Sensoroberfläche, sei es das Aktivierungsreagenz, der Ligand oder der Analyt, in Echtzeit und durch vorprogrammierte Befehle in sequenzieller Reihenfolge aufgezeichnet wird. Ein einzigartiges Merkmal dieser auf BioLayer-Interferometrie (BLI) basierenden Plattform im Octet RED384 ist die Verfügbarkeit von vorbeschichteten optischen Faser-Biosensoren für den sofortigen "Dip-and-Read"-Einsatz14, wodurch die Notwendigkeit der Vorbereitung der Ligandenoberfläche und der Initiations-/Konditionierungsschritte entfällt, die häufig für die Sensorchips in SPR-basierten Plattformen erforderlich sind. Das fluidikfreie Design dieses Instruments vereinfacht auch die Mechanik und vermeidet Verstopfungen und Kontaminationsprobleme beim Umgang mit Rohproben. Mit dem neuartigen 6 x 6 kreuzenden fluidischen Design im ProteOn XPR36 kann ein "One-Shot"-Kinetikansatz implementiert werden, indem die Strömungskanäle zwischen horizontaler und vertikaler Richtung umgeschaltet werden, um 36 Wechselwirkungspunkte zu erzeugen15. Anstatt die Bindungskinetik jeweils für einen Liganden oder Analyten zu bewerten, wie dies bei der traditionellen Biacore T100-Plattform mit seriellem Fluss der Fall ist, bietet dieser Ansatz die Möglichkeit, bis zu 36 verschiedene Wechselwirkungen gleichzeitig in einem einzigen Bindungszyklus zu überwachen. 
Trotz ihrer Unterschiede werden diese vier Biosensorplattformen alle von vielen Laboratorien weltweit eingesetzt. Für neue Benutzer mit wenig praktischer Erfahrung mit Biosensoren kann die Entscheidung, welches Instrument verwendet werden soll, angesichts der Unterschiede im instrumentellen Design eine schwierige Aufgabe sein. Um das am besten geeignete Instrument für ihre Forschungszwecke zu bestimmen, müssen Faktoren wie Datenqualität, Leistungskonsistenz, Durchsatz, Benutzerfreundlichkeit und Materialverbrauch zusammen betrachtet werden. Während mehrere Benchmark-Studien die Variabilität der kinetischen Geschwindigkeitskonstanten untersucht haben, die von mehreren Laboratorien und Biosensoren erhalten wurden5,16, befasst sich eine kürzlich veröffentlichte Kopf-an-Kopf-Vergleichsstudie weiter mit den systematischen Faktoren, die die Zuverlässigkeit der Daten aus Sicht der instrumentellen Leistung beeinflussen17,18. Die Protokolle, die in diesem Video vorgestellt werden, konzentrieren sich auf den Versuchsaufbau und die Verfahren im Detail und werden von dem Forschungsartikel mit dem Titel "Vergleich von Biosensorplattformen bei der Bewertung von Antikörper-Antigen-Bindungskinetiken mit hoher Affinität" begleitet17. Diese Protokolle sollen nicht nur neuen Biosensor-Anwendern helfen, diese Instrumente für ihre Forschungszwecke zu implementieren, sondern auch aktuellen Biosensor-Anwendern zusätzliche Einblicke in technische Herausforderungen und Überlegungen bei Versuchsdesigns zur Bewertung hochaffiner Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen liefern.

<table><tbody><tr><td>Biacore T100 System</td><td>GE Healthcare</td><td>28975001</td><td>Das T100 System wurde auf den T200</td></tr><tr><td>CM5 Sensor Chip aufgerüstet&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100012</td><td></td></tr><tr><td>BIAbewertung&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Version 4.1</td></tr><tr><td>Biacore T100 Steuerungssoftware</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Die Steuerungssoftware T100 wurde auf das T200</td></tr><tr><td>Amine Coupling Kit</td> aktualisiert <td>GE Healthcare</td><td>BR100050&nbsp;</td><td>Es enthält: 750 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC), 115 mg N-Hydroxysuccinimid (NHS), 10,5 mL 1,0 M Ethanolamin-HCl pH 8,5&nbsp;</td></tr><tr><td>HBS-EP+ Puffer 10-fach;</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100669</td><td>Konzentrierte Stammlösung&nbsp;</td></tr><tr><td>Fläschchen aus Kunststoff, Außendurchmesser 7 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100212&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gummikappen, Typ 3</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100502</td><td></td></tr><tr><td>Kunststofffläschchen und -kappen, Außendurchmesser 11 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100214&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ProteOn XPR36 Protein-Interaktions-Array-System</td><td>Bio-Rad</td><td>1760100</td><td></td></tr><tr><td>ProteOn Manager Software&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1760200</td><td>Version 3.1.0.6</td></tr><tr><td>GLM Sensor Chip</td><td>Bio-Rad</td><td>1765012</td><td></td></tr><tr><td>Amine Coupling Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>1762410</td><td>Enthält EDAC (EDC), Sulfo-NHS, Ethanolamin HCl&nbsp;</td></tr><tr><td>Regenerations- und Konditionierungskit und Puffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1762210</td><td>Es enthält je 1 Glycinpuffer (pH 1,5, 2,0, 2,5, 3,0) und NaOH, SDS, HCl, Phosphorsäure, NaCl; 50 mL pro Lösung&nbsp;</td></tr><tr><td>2 L PBS/Tween/EDTA-Puffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1762730</td><td>Enthält Hosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, 0,005% Tween 20, 3 mM EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>Octet RED384 System</td><td>Fort&eacute; </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biodatenanalyse-Software</td><td>Fort&eacute; </td><td></td> Bio <td>Version 9.0.0.4</td></tr><tr><td>Eintauchen und Lesen von Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensoren</td><td>Fort&eacute; Bio</td><td>18-5060</td><td>Ein Tablett mit 96 Biosensoren&nbsp;</td></tr><tr><td>384-Well gekippte Bodenplatte&nbsp;</td><td>Fort&eacute; Bio</td><td>18-5080</td><td></td></tr><tr><td>Biosensor Spender</td><td>Fort&eacute; Bio</td><td>18-5016</td><td></td></tr><tr><td>Kinetics Puffer 10x</td><td>Fort&eacute; Bio</td><td>18-1092</td><td>10-fache Konzentration. Enthält ProClin 300.</td></tr><tr><td>IBIS MX96 SPRi System</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Drucker</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>Version 2.0</td></tr><tr><td>SensEye COOH-G Chip</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>1-09-04-004</td></tr><tr><td>Datenanalyse-Software</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>Version 6.19.3.17</td></tr><tr><td>SPRint Datenanalyse-Software</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>Version 6.15.2.1</td></tr><tr><td>Scrubber 2</td><td>BioLogic Software</td><td></td><td>Version 2</td></tr><tr><td>Pierce Rekombinantes Protein A/G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr></tbody></table>

bestimmung der hochaffine antikörper-antigen-bindung kinetics mit vier biosensorplattformen

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Markierungsfreie optische Biosensoren sind leistungsfähige Werkzeuge in der Wirkstoffforschung für die Charakterisierung von biomolekularen Wechselwirkungen. In dieser Studie beschreiben wir die Verwendung von vier routinemäßig verwendet Biosensorplattformen in unserem Labor die Bindungsaffinität und Kinetik von zehn hochaffine monoklonale Antikörper (mAb) gegen menschliche Proproteinkonvertase Subtilisin Kexin Typ 9 (PCSK9) zu bewerten. Während beiden Biacore T100 und PROTEON XPR36 vom etablierten Oberflächenplasmonresonanz (SPR) -Technologie abgeleitet werden, haben die erstere vier Strömungszellen durch Reihenströmungskonfiguration verbunden ist, während die letztere präsentieren 36 Reaktionsstellen parallel durch ein improvisiertes 6 x 6-Gewirr Mikrofluidik-Kanalkonfiguration. Die IBIS MX96 arbeitet auf der SPR-Sensortechnik, mit einem zusätzlichen Abbildungsmerkmal auch basiert, die Erkennung in der räumlichen Orientierung bietet. Diese Erfassungstechnik in Verbindung mit der Continuous Flow Microspotter (CFM) erweitert den Durchsatz signifikant durch enabling Multiplexreihendruck und der Nachweis von 96 Reaktionssport gleichzeitig. Im Gegensatz dazu ist das Oktett RED384 basierend auf der Bioschicht Interferometry (BLI) optische Prinzip, mit faseroptischen Sonden als Biosensor wirkende Interferenzmuster zu erfassen, wechselt auf Wechselwirkungen an der Spitzenoberfläche zu binden. Im Gegensatz zu den SPR-basierten Plattformen, das BLI-System beruht nicht auf kontinuierlichem Fluss Fluidik; Stattdessen sammeln die Sensorspitzen Lesungen, während sie in Analyt-Lösungen einer 384-Well-Mikroplatte während der umlaufenden Bewegung eingetaucht sind. Jede dieser Biosensorplattformen hat seine eigenen Vor- und Nachteile. Um eine Fähigkeit, einen direkten Vergleich dieser Instrumente Qualität kinetische Daten zur Verfügung zu stellen, die beschriebenen Protokolle zeigen Experimente, die das gleiche Assay-Format und die gleichen hochwertigen Reagenzien verwenden, um Antikörper-Antigen-Kinetik zu charakterisieren, die das einfache 1 passen: 1 molekulare Interaktionsmodell .

Abbildung 1 zeigt die Antikörperarray Bild aus dem CFM und das beschmutzte mAb Ebenen durch die beiden Immobilisierungsverfahren, und Abbildung 2 zeigt die entsprechenden Bindungssensorgramme, die in dem MX96 aus dem Mehrzyklus kinetischen und der Einzelzyklus kinetische Messungen an diesem mAb - Arrays . Die Echtzeit - Bindung und kinetisch angepaßte Kurven von verschiedenen Antikörpern-beschichteten Oberflächen in den vier Biosensorplattformen erzeugt werden , in den Figuren 3 bis 6. Abbildung 7 zeigt den Vergleich der endgültigen kinetischen Raten und Gleichgewichtsbindungskonstanten von der globalen Analyse dieser Bindungskurven erhalten. Die einzelne Association (k a), Dissoziation (k d), und das Gleichgewicht (K D) Bindungskonstanten ist in Tabelle 1 dargestellt. die Variabilität der Datensätze innerhalb des gleichen Instrument erzeugt Um zu demonstrieren, <stRong&gt; 8 zeigt Diagramme von k a, k d, K und D bei Dichten verschiedener mAb Oberfläche, und Figur 9 vergleicht weiter die berechneten Bindungsaktivitäten der mAb Oberflächen über die Biosensor - Plattformen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig1.jpg" /> Abbildung 1. Multiplex Ligand Arrays von Amin-gekoppelte (A) und Fc-erfasst (B) Antikörper Surfaces von CFM Drucken im IBIS MX96. Bilder der gedruckten Arrays werden in den linken Tafeln gezeigt, wo die grauen Bereiche von roten Quadrate zeigen die Anwesenheit von Antikörper eingeschlossen. Die dunkleren interspots zwischen den aktiven Antikörperstellen befinden Referenz Subtraktion verwendet. Jede Spalte enthält einen Antikörper, an den Titration Konzentrationen unterhalb und links von dem Bild identifiziert gedruckt. Die Mengen der gedruckten Antikörper quantitativ bestimmt, indem die Berechnung difference in bulk Verschiebungen zwischen den aktiven und Referenzstellen sind in den rechten Platten gezeigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig2.jpg" /> Abbildung 2. Vergleich von Echtzeit - Bindung Sensogramme von Multi-Zyklus (A) und Einzelzyklus (B) Kinetische Experimente im IBIS MX96. Die aufeinanderfolgenden Injektionen von menschlichen PCSK9 bei Konzentrationen über den 10 x 8-Antikörper-Arrays erhöht, sind oberhalb jedem entsprechenden Sensorgramm Segment festgestellt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig3.jpg" /> <stRong&gt; Figure 3. Bindung Sensorgramme der aufgenommenen Antibodies Interagieren mit Menschen PCSK9 und 1: 1 kinetisches Modell Fit Overlays in dem Biacore T100. Die Interaktionen werden über Hoch- (Toppanels) bewertet, Mittel- (mittlere Felder) und Low- (Bodenplatten) Dichte Oberflächen. Die überlagerten glatten schwarzen Linien stellen die kinetische Passung der Bindungsantwortsignale bei verschiedenen menschlichen PCSK9 Konzentrationen (farbige Linien) zu einem 1: 1-Interaktionsmodell. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig4.jpg" /> Abbildung 4. Bindung Sensorgramme der aufgenommenen Antibodies Interagieren mit Menschen PCSK9 und 1: 1 kinetisches Modell Fit Overlays in der PROTEON XPR36. Die Wechselwirkungen werden über Hoch- (Toppanels) ausgewertet, mediUm- (mittlere Felder) und Low- (Bodenplatten) Dichte Oberflächen. Die überlagerten glatten schwarzen Linien stellen die kinetische Passung der Bindungsantwortsignale bei verschiedenen menschlichen PCSK9 Konzentrationen (farbige Linien) zu einem 1: 1-Interaktionsmodell. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig5.jpg" /> Abbildung 5 : Bindung der aufgenommenen Sensorgramme Antibodies Interagieren mit Menschen PCSK9 und 1: 1 kinetisches Modell Fit Overlays in dem Octet RED384. Die Interaktionen werden über Hoch- (Toppanels) bewertet, Mittel- (mittlere Felder) und Low- (Bodenplatten) Dichte Oberflächen. Die überlagerten roten Linien stellen die kinetische Passung der Bindungsantwortsignale bei verschiedenen menschlichen PCSK9 Konzentrationen (farbige Linien) zu einem 1:<html> 1 Interaktionsmodell. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig6.jpg" /> Abbildung 6. Die Bindung Sensorgramme der Amingekoppelten (A) und Fc-erfasst (B) Antikörper Interagieren mit Menschen PCSK9 und 1: 1 kinetisches Modell Fit Overlays im IBIS MX96. Die Bindungsprofile als 10 x 8 organisiert Platten, die die Anordnungsplatte Karte in Abbildung 1 folgen. Die schwarzen Linien stellen die aufgezeichneten Bindungsantwortsignale bei verschiedenen menschlichen PCSK9 Konzentrationen, und die überlagerten roten Linien stellen die angepaßten Kurven. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 7&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg&quot; /&gt; Abbildung 7 : Vergleich des Verbandes k a (A), Dissociation k d (B) und Equilibrium K D (C) Bindungskonstanten , die durch die vier Biosensorplattformen. Die kinetischen Parameter werden von den globalen Analyse der Bindungskurven in den Fig abgeleitet von 3 bis 6. Die Instrumente werden wie folgt dargestellt: Biacore T100 (blau), PROTEON XPR36 (grün), Octet RED384 (rot), IBIS MX96, Amin-gekoppelt (lila) und IBIS MX96, Fc-erfasst (orange). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig8.jpg" /> Abbildung 8. Vergleich der Konsistenz von Geschwindigkeitskonstanten über mehr Antikörper Oberflächendichten in der Biac<html> ore T100 (A), PROTEON XPR36 (B), Octet RED384 (C), IBIS MX96, Amin-gekoppelt (D), und IBIS MX96, Fc-erfasst (E). Die kinetischen Parameter k a (oben-Subfelder), k d (mittlere Teilplatten) und K D (untere Teilplatten) aus Gruppenanalyse an einzelnen Antikörperoberflächendichte abgeleitet. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="9" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig9.jpg" /> Abbildung 9. Bindungsaktivitäten der Antikörper Oberflächen und deren Standardabweichungen (Fehlerbalken) in den vier Biosensorplattformen. Die Werte werden unter Verwendung der Gleichungen in dem Forschungs Artikel 17 beschrieben , berechnet.large.jpg“target =‚_ blank‘&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td> k a </td><td> Kd </td><td> K D </td></tr><tr><td> (M -1 s -1) </td><td> (s -1) </td><td> (nM) </td></tr><tr><td> mAb 1 </td><td> 11,7 (7,8) x 10 5 </td><td> 4,89 (4,18) x 10 -5 </td><td> 0,052 (0,05) </td></tr><tr><td> mAb 2 </td><td> 1,53 (0,28) x 10 5 </td><td> 1,30 (1,54) x 10 -5 </td><td> 0,092 (0,12) </td></tr><tr><td> mAb 3 </td><td> 11,4 (8,3) x 10 5 </td><td> 27,6 (11,0) x 10 -5 </td><td> 0,333 (0,20) </td></tr><tr><td> mAb 4 </td><td> 3,61 (1,6) x 10 5 </td><td> 20,1 (12,3) x 10 -5 </td><td> 0,659 (0,54) </td></tr><tr><td> mAb 5 </td><td> 0,59 (0,21) x 10 5 </td><td> 3,46 (2,50) x 10 -5 </td><td> 0,663 (0,46) </td></tr><tr><td> mAb 6 </td><td> 1,19 (0,78) x 10 5 </td><td> 7,21 (3,83) x 10 -5 </td><td> 0,894 (0,64) </td></tr><tr><td> mAb 7 </td><td> 1,29 (0,53) x 10 5 </td><td> 16,4 (5,63) x 10 -5 </td><td> 1,57 (1,02) </td></tr><tr><td> mAb 8 </td><td> 4,02 (2,23) x 10 5 </td><td> 22,8 (10,7) x 10 -5 </td><td> 0,768 (0,68) </td></tr><tr><td> mAb 9 </td><td> 4,20 (2,13) x 10 5 </td><td> 6,67 (4,3) x 10 -5 </td><td> 0,197 (0,16) </td></tr><tr><td> mAb 10 </td><td> 1,20 (0,49) x 10 5 </td><td> 12,5 (7,64) x 10 -5 </td><td> 1,27 (0,80) </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Kinetische Preise und Equilibrium Bindungskonstanten von 10 mAbs Erhalten von Global Einbau von Bindungskurven von vier Biosensor Instruments zum 1: 1 - Interaktionsmodell.

Wir beschreiben hier Protokolle zur Messung der Antikörper-Antigen-Bindungsaffinität und Kinetik vier häufig verwendete Biosensor-Plattformen.

Bestimmung der hochaffine Antikörper-Antigen-Bindung Kinetics mit vier Biosensorplattformen

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Das Ziel dieser Biosensorstudie ist es, die Fähigkeit der vier routinemäßig verwendeten Biosensorplattformen zu vergleichen, qualitativ hochwertige kinetische Daten bereitzustellen, und Einblicke in technische Herausforderungen sowie Überlegungen bei der experimentellen Gestaltung zur Bewertung von Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen mit hoher Affinität zu geben. Diese Studie beantwortet zentrale Fragen im Bereich der Wirkstoffforschung zur Auswahl von Biosensorplattformen und Assayformaten, die zuverlässigste Ergebnisse bei der Evaluierung therapeutischer Antikörperkandidaten ermöglichen. Der Hauptvorteil dieser Studie liegt darin, dass sie einen direkten und umfassenden Vergleich der verschiedenen Biosensorplattformen hinsichtlich Datenkonsistenz, -qualität und betrieblicher Effizienz bietet.Videodemonstration der vier Protokolle ist entscheidend, da sie neuen Anwendern mit wenig praktischer Erfahrung hilft, zu lernen, wie Experimente an diesen Geräten eingerichtet werden. Für kinetische Messungen im Biacore T100 klicken Sie auf Datei, Neues Methode öffnen, und öffnen Sie die Methodendatei. Überprüfen Sie die Parameter in der Methode.Legen Sie bei Zyklustypen die Kontaktzeit für Erfassung 1 über den Durchflussweg 2 auf 220 Sekunden, für Erfassung 2 über den Durchflussweg 3 auf 110 Sekunden und für Erfassung 3 über den Durchflussweg 4 auf 55 Sekunden fest. Die Durchflussgeschwindigkeit beträgt für alle Erfassungszyklen 10 Mikroliter pro Minute. Wählen Sie Probe 1 aus und markieren Sie Probelösung als Variable.Danach die Kontaktzeit auf 600 Sekunden und die Dissoziationszeit über den Flussweg 1, 2, 3, 4 auf 2.700 Sekunden einstellen. Die Flussrate wird auf 30 Mikroliter pro Minute eingestellt. Anschließend Regeneration 1 auswählen, Glycin-HCl, pH 1,5, im Lösungsfeld eingeben und die Kontaktzeit über den Flussweg 1, 2, 3, 4 auf 20 Sekunden einstellen.Geben Sie in den Variableneinstellungen verdünnte Konzentrationen im Verhältnis 1:2 von 100 Nanomolar bis 6,25 Nanomolar für Zyklus 1–3, von 50 Nanomolar bis 3,12 Nanomolar für Zyklus 4–8 und von 5 Nanomolar bis 0,323 Nanomolar für Zyklus 9–10 ein. Wählen Sie im Setup-Lauf den Detektionsflusspfad 2-1, 3-1, 4-1 und klicken Sie dann auf Weiter. Aktivieren Sie die Option „vor dem Lauf spülen“ und klicken Sie erneut auf Weiter.Wählen Sie die Proben- und Reagenzienhalterung 1 aus und definieren Sie die Positionen für die Reagenzien. Pipettieren Sie die Reagenzien entsprechend in die einzelnen Probengefäße und setzen Sie die Halterung in das Gerät ein. Klicken Sie auf Halterung auswerfen, um die Tür des Probentrays zu öffnen, und setzen Sie anschließend die Probengestelle in das Gerät ein.Klicken Sie dann auf „Start“ und geben Sie einen Experimentnamen zum Speichern ein, um den Durchlauf zu starten. Für die kinetischen Messungen im ProteOn XPR36 beginnen Sie die Immobilisierung, indem Sie „Protokolle“ und anschließend „Proben“ auswählen. Definieren Sie EDC/Sulfo-NHS als Aktivator in den Vertiefungen H1–H6, Protein A/G als Ligand in G1–G6, Ethanolamin als Deaktivator in F1–F6, Glycin als Regenerator in E1–E6, PBS-T-EDTA als Leerprobe in D1–D6, die monoklonale Antikörper-X-Probe als Ligand in C1–C6 und humanes PCSK9 als Analyt in den Vertiefungen B1–B6.Wählen Sie Schritte aus und doppelklicken Sie dann im Protokoll-Editor auf Immobilisierung. Die Schritte umfassen drei aufeinanderfolgende horizontale Injektionen von EDC/Sulfo-NHS, Protein A/G und einer molaren Ethanolamin-Lösung. Jede Injektion sollte eine Flussrate von 30 µL/min und eine Kontaktzeit von 300 Sekunden aufweisen.Klicken Sie anschließend auf „Regenerieren“. Geben Sie drei 18-Sekunden-Impulse von Glycin mit 100 Mikrolitern pro Minute in horizontaler und vertikaler Richtung ab. Darauf folgen zwei 60-Sekunden-Impulse von PBS-T-EDTA mit 25 Mikrolitern pro Minute, ebenfalls in beiden Richtungen.Klicken Sie anschließend auf Ligand und injizieren Sie monoklonalen Antikörper 1, monoklonalen Antikörper 2 in vertikaler Richtung mit einer Flussrate von 25 µL/min und einer Kontaktzeit von 160 Sekunden. Nachdem Sie auf Analyt geklickt haben, injizieren Sie fünf Konzentrationen von humanem PCSK9 in einem blanken Puffer gleichzeitig über sechs horizontale Kanäle. Verwenden Sie 40 µL/min für eine Assoziationszeit von 600 Sekunden, gefolgt von einer Dissoziationszeit von 2.700 Sekunden.Klicken Sie anschließend auf „Regenerieren“ und geben Sie zwei 18-Sekunden-Impulse von Glycin mit 100 Mikrolitern pro Minute in horizontaler und vertikaler Richtung ab. Bereiten Sie danach die Proben und Reagenzien in einer 96-Well-Platte gemäß den festgelegten Reagenzienpositionen vor. Stellen Sie die Platte in das Gerät und klicken Sie dann auf den Reiter „Ausführen“, wählen Sie das Protokoll aus und klicken Sie auf „Start“.Die sechs-Nadel-Parallelinjektion bei der Aufzeichnung von Live-Experimentaldaten wird demonstriert. Für kinetische Messungen im Octet RED384 richten Sie die experimentelle Methode ein, indem Sie zunächst Experiment, dann New Experiment Wizard, New Kinetics Experiment und anschließend Basic Kinetics in der Datenerfassungssoftware auswählen. Klicken Sie danach auf Modify Plates und ändern Sie 96 Wells in 384 Wells sowohl in Plate 1 als auch in Plate 2.Definieren Sie die Probenarten und -positionen in der Platte, wie im Textprotokoll beschrieben. Navigieren Sie zur Assay-Definition, um den experimentellen Aufbau festzulegen. Der experimentelle Aufbau wird definiert als eine Baseline-Zeit von 30 Sekunden, eine Regenerationszeit von 30 Sekunden, eine Equilibrierungszeit von 18 Sekunden, eine Ladezeit von 200 Sekunden, eine Assoziationszeit von 500 Sekunden und eine Dissoziationszeit von 1.800 Sekunden.Die Schüttelgeschwindigkeit wird auf 1.000 U/min eingestellt. Um die Schritte der Assayschrittlis­te hinzuzufügen, klicken Sie zuerst auf einen Schritt und danach auf die Vertiefungen in der Probe- oder Reagenzienplatte. Geben Sie zunächst die Anweisungen für die Gleichgewichtseinstellung und Regeneration ein, um die Anti-human-Fc-Capturesensoren durch drei Zyklen mit 15-sekündigen Eintauchungen in Glycin abwechselnd mit 15-sekündigen Eintauchungen in 1XKB vorzubereiten.Danach geben Sie die Ladeanweisungen ein, um die monoklonalen Antikörpersonden mithilfe von Anti-human-Fc-Erfassungssensoren für 200 Sekunden zu binden. Anschließend geben Sie die Basislinienanweisungen ein, um das Bioreflexionsinterferenzsignal über einen Zeitraum von 60 Sekunden vor dem Assoziationsabschnitt zu etablieren. Geben Sie den Assoziationsabschnitt ein, bei dem die Sensoren in Vertiefungen mit unterschiedlichen Konzentrationen an humanem PCSK9 für einen Assoziationszeitraum von 500 Sekunden eingetaucht werden.Geben Sie den Dissoziations-Schritt ein, indem Sie die PCSK9-gebundenen Sensoren für einen Dissoziationszeitraum von 1.800 Sekunden in neue Mulden mit 1XKB tauchen. Abschließend tauchen Sie für den Regenerations-Schritt die mit monoklonalen Antikörpern gegen PCSK9 beladenen Sensoren in Mulden mit Glycin und führen zwischen jedem Bindungszyklus zwei 18-Sekunden-Impulse durch. Gehen Sie zu „Experimente überprüfen“, blättern Sie durch die Schritte und klicken Sie dann auf die grüne Schaltfläche „Öffnen“, um das Probenfach zu öffnen.Überführen Sie die Probenplatten in das Gerät. Navigieren Sie zu „Experimente ausführen“, geben Sie eine Verzögerungszeit von 60 Sekunden ein und schütteln Sie die Probenplatte während des Wartens. Stellen Sie die Plattentemperatur auf 25 Grad Celsius ein, geben Sie den Namen des Experimentlaufs ein und drücken Sie dann auf „Go“. Die Echtzeit-Datenerfassung wird hier angezeigt.Installieren Sie für kinetische Messungen über mehrere Zyklen im IBIS-MX96 den Sensorchip in den Continuous Flow Microspotter. Öffnen Sie die CFM2.0-Software, klicken Sie dann auf „Load Settings“ und „96 Amine Couple“. Platzieren Sie die beiden Proben- und Reagenzienplatten in den CFM-Drucker.Um den Antikörper-Array herzustellen, drücken Sie „Run“, um den Drucker zu starten, und geben Sie das EDC/Sulfo-NHS aus der oberen Hälfte der Reagenzienplatte mithilfe von 48 Mikrokanälen auf den Sensor ab, wobei Sie es fünf Minuten lang über die Sensoroberfläche zirkulieren lassen. Geben Sie die monoklonalen Antikörperproben aus der oberen Hälfte der Quellplatte auf den Sensor ab und zirkulieren Sie sie 10 Minuten lang über die aktivierten Oberflächen. Anschließend leiten Sie den Immobilisierungspuffer aus einem 50-Milliliter-Kegelröhrchen fünf Minuten lang über die Antikörperoberfläche.Setzen Sie den bedruckten Sensorchip in das Gerät ein. Klicken Sie in der Steuerungssoftware auf Datei, Messung öffnen, Vorhandene Messung, und wählen Sie die Methodendatei aus. Übertragen Sie den bedruckten Sensorchip in das Gerät.Wählen Sie im Hauptmenü G-System Prime unter Vollsystem-Skript aus. Danach wählen Sie G-Quench, um die monoklonalen Antikörperformen durch Injektion von 150 Mikrolitern einer einmolarigen Ethanolaminlösung zu deaktivieren. Wählen Sie im Analysezyklus A-AP Standard Run unter IBIS-Skripten aus.Stellen Sie 1,0 Minute für die Basislinie, 10,0 Minuten für die Assoziation und 90 Schritte für die Dissoziation bei einer Geschwindigkeit von acht Mikrolitern pro Sekunde ein. In den Zyklen injizieren Sie menschliches PCSK9 nacheinander jeweils eine Konzentration, nachdem fünf Pufferinjektionen durchgeführt wurden. Regenerieren Sie die Oberflächen mit monoklonalen Antikörpern zwischen jedem Bindungszyklus mit Glycin.Die aufgezeichneten Bindungssensorgramme, dargestellt als Überlagerungen der Anpassung an ein eins-zu-eins-Kinetikmodell, werden für die Antikörper gezeigt, die mit humanem PCSK9 auf vier Instrumenten interagieren. Die Bindungsprofile der Antikörper bei mehreren Dichten sind über die Instrumente hinweg ähnlich. Obwohl die Geschwindigkeitskonstanten, die mit jedem der Antikörper verbunden sind, zwischen den Instrumenten variierten, blieben ihre Rangfolgen größtenteils gleich.Die Reproduzierbarkeit und Konsistenz von Affinitäten in kinetischen Raten über mehrere Antikörperoberflächen hinweg wurde untersucht. Wie hier gezeigt, wurde für alle mit dem Biacore T100 und ProteOn XPR36 erzeugten Geschwindigkeitskonstanten eine starke Linearität beobachtet. Die mit dem Octet RED384 erzeugten Geschwindigkeitskonstanten wiesen hingegen eine geringere Linearität auf, bedingt durch Schwankungen in einigen der Dissoziationsraten.Dies wurde möglicherweise durch zeitabhängige Verdunstung der Proben in der Mikrotiterplatte verursacht. Die von dem IBIS-MX96 erzeugten Geschwindigkeitskonstanten waren aufgrund von Schwankungen in der Oberflächenheterogenität ebenfalls weniger linear. Die mit den meisten Systemen assoziierten Antikörper-Bindungsaktivitäten waren konsistent, wohingegen für die Amin-Kopplungsmethode am IBIS-MX96 eine etwa zehnfach geringere Aktivität beobachtet wurde.Dies lag möglicherweise an einer Antikörper-Inaktivierung oder an der Bildung von Antikörper-Orientierungen, die einer Antigenbindung nicht förderlich waren. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Experimente in jeder der vier Biosensorplattformen eingerichtet werden und wie geeignete Biosensortechnologien für Ihre eigene Forschung ausgewählt werden. Unsere direkte Vergleichsstudie zeigt, dass jede Biosensorplattform ihre eigenen Vor- und Nachteile besitzt.Trotz bestimmter inhärenter systematischer Einschränkungen der Instrumente bestand eine hohe Korrelation zwischen diesen Geräten hinsichtlich der direkten Reihenfolge sowohl der Assoziations- als auch der Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten. Für die Rangfolge von Kandidaten, unter der Annahme, dass die Anzahl der Proben und die Menge der Materialien keine begrenzenden Faktoren darstellen, kann jedes dieser Instrumente verwendet werden, da sie die Antikörper vergleichbar unterscheiden können, unabhängig vom verwendeten Instrument. Es besteht ein Kompromiss zwischen Datenzuverlässigkeit und Probendurchsatz.Der Biacore T100, gefolgt vom ProteOn XPR36R, zeigte die beste Datenqualität und Konsistenz. Dagegen bieten der Octet RED384 und der IBIS-MX96 eine hohe Flexibilität und Durchsatzleistung, jedoch mit Einbußen bei der Datenaccuracy und Konsistenz. Für Studien, die eine empfindliche und zuverlässige Detektion erfordern, eignet sich entweder der Biacore T100 oder der ProteOn XPR36 am besten.Für Studien, bei denen Geschwindigkeit ein entscheidender Faktor ist und eine große Anzahl von Proben vorliegt, wird entweder Octet Red384 oder IBIS-MX96 bevorzugt. Geräte mit kontinuierlichem Flüssigkeitsfluss X liefern hochwertige Daten zur Auflösung von Wechselwirkungen mit langsamen Dissoziationsraten. Die wesentliche Einschränkung des BRI-Fluid-ex-a-fray-Geräts ist die Probenevaporation im Mikrotiterplatte über die Zeit, die zu einem Anstieg der Messwerte führen und somit die Datenaccuracy beeinträchtigen kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Video zeigt einen konduktimetrischen Biosensor-Assay, um die Interaktion eines Antikörpers mit einem Zielantigen zu untersuchen, das auf einem Schallkopfchip immobilisiert ist. Der Biosensor ist so konstruiert, dass er ein bifunktionelles chimäres Protein enthält – ein β-Lactamase-Enzym mit einer funktionellen katalytischen Stelle, die mit einem Nanobody fusioniert ist, um an das immobilisierte Zielantigen zu binden. Bei der Bindung erzeugt die katalytische Hydrolyse eines...

β-Laktamase-basierter konduktimetrischer Biosensor-Assay für Protein-Protein-Wechselwirkungen

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Bio-Schicht-Interferometrie zur Messung der Kinetik der Protein-Protein-Interaktionen und allosterische Ligandeneffekte

Dabei berichten wir über eine neue Methode, um Protein-Protein-Interaktionen mit Hilfe eines conductimetric Biosensors basierend auf die β-Lactamase-Hybridtechnologie zu studieren. Diese Methode beruht auf der Freisetzung von Protonen bei der Hydrolyse des β--Lactame.

Die Verwendung eines β-Lactamase-basierte Conductimetric Biosensor-Assays, biomolekulare Wechselwirkungen zu erkennen

Hier präsentieren wir ein Protokoll um die Entwicklung und Validierung eines einzelnen Moleküls Array digitale ELISA Assays, ermöglicht ultra-sensitive Detektion von allen IFN-α-Subtypen in humanen Proben zu beschreiben.

Entwicklung und Validierung eines empfindsamen Einzelmolekül Array digitale Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay für menschliche Interferon-α

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Montage und Demontage der Biolayer Interferometrie (BLI) mit Milzbrand-Toxin zu überwachen. Nach Montage/Demontage auf der Biosensor-Oberfläche sind von der Oberfläche zur Visualisierung und Identifikation von Komponenten der komplexe mit Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie, bzw. die große Proteinkomplexe veröffentlicht.

Analyse dynamischer Proteinkomplexe montiert auf und befreit Biolayer Interferometrie Biosensor mit Massenspektrometrie und Elektronenmikroskopie

Wir beschreiben einen einmolekularen Ansatz für Antigen-Antikörper-Affinitätsmessungen mit Massenphotometrie (MP). Das MP-basierte Protokoll ist schnell, genau, verwendet eine sehr geringe Menge an Material und erfordert keine Proteinmodifikation.

Schnelle Bestimmung der Antikörper-Antigen-Affinität durch Massenphotometrie

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Field-Effect Biosensing (FEB) ist eine markierungsfreie Technik zum Nachweis biomolekularer Wechselwirkungen. Es misst den elektrischen Strom durch den Graphen-Biosensor, an den die Bindungsziele immobilisiert werden. Die FEB-Technologie wurde verwendet, um biomolekulare Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und Cdc37 zu bewerten und eine starke Wechselwirkung zwischen den beiden Proteinen wurde nachgewiesen.

Erforschung der biomolekularen Interaktion zwischen dem molekularen Chaperon Hsp90 und seiner Client-Proteinkinase Cdc37 unter Verwendung der Feldeffekt-Biosensortechnologie

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Untersuchung von DNA-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung eines Streptavidin-basierten Biolayer-Interferometrie-Systems (BLI). Es werden die wesentlichen Schritte und Überlegungen zur Verwendung grundlegender oder fortgeschrittener Bindungskinetik zur Bestimmung der Gleichgewichtsbindungsaffinität (KD) der Wechselwirkung beschrieben.

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