Neuronale Schaltungen neu verdrahten: Eine neue Methode zur schnellen Neuritenverlängerung und funktionellen neuronalen Verbindung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, neue Neuriten zu initiieren, sie schnell zu erweitern und präzise mit den Zielzellen zu verbinden. Dieses Verfahren ist nur möglich, indem Zellen verwendet werden, die in einer kontrollierten und reproduzierbaren Umgebung gezüchtet wurden. Diese Methode ermöglicht es uns, Schlüsselfragen der Neurowissenschaften zu beantworten.

Was schränkt die Wachstumsrate von Neuronen ein? Wie schnell können sie wachsen? Spielen mechanische Hinweise eine Rolle?

Wir können auch untersuchen, wie Synapsen gebildet werden, wie Neuronen eine Zielzelle finden? Wie altern, reifen Synapsen? Und drittens können wir damit beginnen, systematisch neuronale Netze aufzubauen und zu untersuchen, wie Neuronen rechnen.

Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie eine einfache Manipulation, experimentelle Reproduzierbarkeit und letztendlich ein hohes Maß an Kontrolle auf Einzelzellebene ermöglicht. Um diesen Vorgang zu starten, reinigen und bereiten Sie die gewünschte Anzahl steriler Deckgläser vor. Beschichten Sie anschließend jeden Deckglas mindestens zwei Stunden lang bei Raumtemperatur mit 0,5 bis 1 Milliliter 100 Mikrogramm pro Milliliter PDL.

Waschen Sie danach die Einbezugsbänder zweimal mit Wasser und entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit. Lassen Sie sie in einer sterilen Umgebung 5 bis 10 Minuten trocknen oder bis die Oberfläche vollständig trocken ist. Legen Sie dann die mikrofluidischen Geräte mit den Mustern nach oben für 10 Minuten unter das UV-Licht in eine Biosicherheitswerkbank.

Platzieren Sie nach 10 Minuten ein mikrofluidisches Gerät mit dem Muster nach unten in Kontakt mit dem sauberen Deckglas. Drücken Sie mit der Pinzette sanft auf das Gerät, damit es am Glas haftet. Um das Gerät mit einer einzelnen Population mit Medium zu füllen, geben Sie 50 Mikroliter vollständiges Zellmedium in die rechte obere Vertiefung.

Und dann fügen Sie weitere 50 Mikroliter vollständiges Zellmedium in die Vertiefung diagonal dazu hinzu. Um das Gerät mit mehreren Populationen mit Medium zu füllen, geben Sie 30 Mikroliter vollständiges NBM in eine Reihe von Vertiefungen. Stellen Sie sicher, dass das Medium zwischen den Vertiefungen fließt.

Geben Sie dann 50 Mikroliter Medium in jede der verbleibenden Vertiefungen. Legen Sie die Geräte in eine größere Platte mit einer offenen Schale mit autoklaviertem Wasser und stellen Sie die Schale für ein bis zwei Stunden in den Inkubator, während Sie die Zellkultur vorbereiten. Entfernen Sie nun das Medium aus den oberen Vertiefungen der mikrofluidischen Geräte, ohne die Vertiefungen zu entleeren.

Geben Sie dann 20 Mikroliter der konzentrierten Zelllösung in die obere rechte Vertiefung des mikrofluidischen Geräts und überprüfen Sie im Mikroskop, wie die Zellen in dem mikrofluidischen Gerät für eine einzelne Population fließen. Um Zellen in der Vorrichtung für mehrere Populationen zu plattieren, geben Sie 20 Mikroliter der konzentrierten Zelllösung in jede der oberen Vertiefungen. Prüfen Sie unter dem Mikroskop, ob sich die Zellen in den Kammern befinden.

Legen Sie die Geräte anschließend für 15 bis 30 Minuten in den Inkubator, um die Zellanhaftung an das Substrat zu fördern. Nachdem sich die Zellen an das Substrat anheften, geben Sie 40 Mikroliter NBM in die beiden oberen Vertiefungen des Geräts für eine einzelne Population. Dies hilft, die Luftblasen aus den Mikrokanälen zu entfernen.

Geben Sie 20 Mikroliter MBM in die oberen Vertiefungen des Geräts für mehrere Populationen, die gleichen Vertiefungen, in die die Zellen injiziert wurden. Das Medium sollte leicht hervorstehen, um einen positiven Meniskus zu bilden und den Vertiefungen ein Muffin-Aussehen zu verleihen. Ein bis zwei Tage vor der Entnahme des mikrofluidischen Geräts geben Sie zwei Milliliter vorgewärmtes NBM in jede Probenschale und fluten Sie die Kammern.

Bewahren Sie die Geräte dann im Inkubator auf. Verwenden Sie anschließend eine sterile Pinzette und eine Pipettenspitze, um die mikrofluidischen Geräte von den Deckgläsern zu entfernen, so dass eine gemusterte Konfiguration von Neuronen zurückbleibt. Bei diesem Verfahren werden 40 bis 60 Mikroliter der aufbereiteten PDL-beschichteten Kügelchen in die Zellkultur gegeben.

Geben Sie die Probe dann für eine Stunde in den Inkubator zurück, um die Bildung von synaptischen Kontakten zu fördern. Anschließend wird die Probe so in einen Versuchsaufbau eingebaut, dass die Zellen von oben mit zwei Mikropipetten beurteilt und auch optisch zugänglich sind. In dieser Konfiguration befindet sich eine CCD-Kamera an der Seitenöffnung des Mikroskops für die Bildaufnahme.

Verbinden Sie jede mit Kochsalzlösung gefüllte Pipette mit einer Ein-Milliliter-Spritze und perfundieren Sie die Probe dann mit physiologischer Kochsalzlösung. Überprüfen Sie als Nächstes unter dem Mikroskop die Lücke zwischen den beiden isolierten neuronalen Populationen, um sicherzustellen, dass die beiden Populationen nicht auf natürliche Weise miteinander verbunden sind. Wählen Sie im Sichtfeld eine PDL-Perle aus, die nicht an das Neuron gebunden ist.

Richten Sie die Perle mit einer Mikropipettenspitze aus, indem Sie sich auf die Perle und dann auf die Mikropipette konzentrieren. Bringen Sie anschließend die Spitze so nah wie möglich an die Perle, indem Sie sie durch das Mikroskop überwachen. Üben Sie dann Unterdruck auf die Pipette aus, um die Perle aufzunehmen, und halten Sie den Unterdruck während des gesamten Experiments aufrecht.

Wählen Sie nun eine PDL-Perle aus, die an einem Neuron im Sichtfeld befestigt ist, und befestigen Sie sie durch Saugen an der zweiten Mikropipette. Ziehen Sie den PDL-Kügelchen-Neuronenkomplex, indem Sie entweder den Mikromanipulator oder den Probentisch langsam mit 0,5 Mikrometern pro Minute für 1 Mikrometer bewegen und fünf Minuten lang pausieren, um die Neuriteninitiierung zu ermöglichen. Ziehen Sie den PDL-Kügelchen-Neuronenkomplex, indem Sie ihn langsam mit 0,5 Mikrometern pro Minute über zwei Mikrometer seitlich bewegen, und pausieren Sie dann fünf Minuten lang, um eine Neuritendehnung zu ermöglichen.

Nach erfolgreicher Initiierung und Neuritenverlängerung für die ersten fünf Mikrometer ziehen Sie den Neurit kontinuierlich mit 20 Mikrometern pro Minute. Um die Neuronen zu verbinden, wählen Sie eine Region aus, die reich an Neuriten ist. Verwenden Sie andere Kügelchen, um die Höhe der Pipettenspitze über dem Deckglas zu messen, und senken Sie den PDL-Perlenneuritenkomplex so ab, dass er physisch mit den Neuriten in Kontakt kommt.

Lassen Sie den PDL-Kügelchen-Neuritenkomplex in Kontakt mit dem Zielneuriten, während Sie die zweite Mikropipette manipulieren. Senken Sie dann die zweite Pipette mit der zweiten PDL-Kugel etwa 20 Mikrometer von der ersten Kugel entfernt auf den neu gebildeten Neurit ab und schieben Sie mit der zweiten PDL-Kugel das neue Neuritenfilament in Richtung der Zielzelle. Halten Sie dann beide Perlen mindestens eine Stunde lang an Ort und Stelle.

Überprüfen Sie mit dem Mikroskop, ob es keine fokale Schwellung gibt, d. h. eine Verdickung der Neuriten, die mit der Kügelchen in Kontakt kommen. Während dieser Zeit wird das Medium der Probe langsam von physiologischer Kochsalzlösung auf vorgewärmtes Kohlendioxid-Äquilibriertes NBM umgestellt. Lösen Sie die Perle von der zweiten Pipette, indem Sie den Sog loslassen.

Wenn der neue Neurit anhaftet, löse auch die erste Perle. Legen Sie die Probe anschließend vorsichtig zurück in den Inkubator, um die neuronale Verbindung für zukünftige Experimente zu stärken. Sie können Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen verwenden, um die elektrische Funktionalität der mikromanipulierten Verbindung zu untersuchen.

Hier sind die isolierten neuronalen Populationen dargestellt, die durch eine Lücke von 100 Mikrometern in PDMS-Mikrogeräten getrennt sind. Pair-to-Patch-Clamp-Aufzeichnungen wurden in Ganzzellkonfiguration durchgeführt, und die mechanisch induzierten Verbindungen wurden analysiert und mit denen in natürlich verbundenen neuronalen Populationen und nicht verbundenen Populationen verglichen. Die elektrischen Reaktionen nach präsynaptischem Aktionspotential, die von den Neuronen aufgezeichnet wurden, die auf natürliche Weise und durch Mikromanipulation verbunden waren, sind signifikant höher und korrelieren vorübergehend mit der präsynaptischen Aktivität.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in acht Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird, und beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, gesunde und gut strukturierte Langzeitzellkulturen zu haben, um schnelle und reproduzierbare Ergebnisse zu garantieren. Nach diesem Verfahren können verschiedene Methoden verwendet werden, um die elektrische Funktionalität der mikromanipulierten Verbindung zu überprüfen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellpopulationen in mikrofluidischen Kammern züchtet und Pipettenmanipulationen verwendet, um Neuriten zu initiieren, zu verlängern und zu verbinden.