Ganzzellige Patch-Clamp Aufnahmen von isolierten primären Epithelzellen aus dem Epididymis

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Epithelzellen aus den Nebenhoden der Ratte zu isolieren und die elektrischen Eigenschaften an diesen primär dissoziierten Zellen mit Hilfe der Ganzzell-Patch-Clamp-Methode zu messen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Reproduktionsbiologie zu beantworten, wie z. B. die Funktion der Nebenhoden, die für die Spermienreifung und die Vererbung väterlicher Merkmale wichtig ist. Diese Technik ermöglicht es dem Anwender, die elektrischen Eigenschaften isolierter Nebenhoden-Epithelzellen zu kauterisieren, so dass dann eine unbekannte physiologische Funktion dieser Zellen dargestellt werden kann.

Das Verfahren wird von Bao Li Zhang, einem Doktoranden aus meinem Labor, vorgeführt. Um den Vorgang zu beginnen, desinfizieren Sie die Sezierwerkzeuge durch Eintauchen in 70%iges Ethanol. Lassen Sie sie dann an der Luft trocknen.

Bereiten Sie als Nächstes das vollständige IMDM vor. Anschließend 50 ml Aliquots unter aseptischen Bedingungen herstellen, mit Parafilm versiegeln und bei vier Grad Celsius lagern. Bereiten Sie anschließend eine kollagene Enzymverdauungslösung vor, indem Sie Kollagenase Typ I und Kollagenase Typ II in RPMI auflösen, was zu einem Milligramm pro Milliliter jeder Kollagenase in der Lösung führt.

Filtrieren Sie die Lösung durch eine 0,22 Mikrometer große Membran. Kennzeichnen Sie es dann als Kollagenase-Lösung und bewahren Sie die Lösung bis zur Verwendung bei Raumtemperatur auf. Passen Sie als Nächstes das Volumen der Enzymlösung basierend auf dem Gewicht des Enzyms an.

Das minimale Volumen, das für beide Cauda-Nebenhoden von einer einzigen Ratte benötigt wird, beträgt zwei Milliliter. Um die Cauda epididymides der Ratte zu präparieren, töten Sie das Tier entweder durch Verwendung von Natrium-Pentobarbital durch IP-Injektion oder durch Verwendung einer Isofluran-Kammer, bis das Tier nicht auf die Stimulation des Schwanzkneifens anspricht, gefolgt von einer Zervixluxation. Desinfizieren Sie anschließend den Unterbauch, indem Sie ihn mit 70% Ethanol abwischen.

Schiebe die beiden Hoden sanft nach unten bis zum Unterbauch und öffne dann den Unterbauch in der Nähe des Hodensacks. Entfernen Sie anschließend das Nebenhodenfett und präparieren Sie alle Fortpflanzungsorgane. Übertragen Sie sie anschließend mit RPMI in die Schüssel.

In einem sauberen, luftstromgesteuerten Arbeitsplatz werden die Cauda Epididymides aus dem Binde- und Fettgewebe und der Nebenhodenkapsel herauspräpariert. Geben Sie einen Nebenhoden mit 0,2 Millilitern Kollagenaselösung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Um einzelne Zellen von den Cauda Nebenhoden zu trennen, schneidet man die Nebenhoden in der Kollagenaselösung mit einer feinen Schere ein, bis das Gewebe zu einer pastösen Flüssigkeit wird.

Spülen Sie dann die Schere vorsichtig mit dem Rest der Enzymlösung in der Tube ab. Legen Sie das Rohr anschließend für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und einer Schütteldrehzahl von 1.000 U/min auf einen Metall-Thermomischer. Zentrifugieren Sie dann das Enzymgewebegemisch drei Minuten lang bei Raumtemperatur.

Danach dekantieren Sie den klebrigen Überstand, der hauptsächlich das Sperma enthält. Als nächstes resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter vollem IMDM, um die gesamte enzymatische Aktivität zu löschen. Übertragen Sie anschließend die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 49 Millilitern RPMI.

Das Zellgemisch zentrifugieren und den Überstand dekantieren. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter voller IMDM mit sanfter Verreibung für mindestens fünf Minuten, um einzelne Zellen von der enzymatisch behandelten Nebenhodengewebsmischung zu dissoziieren. Trennen Sie die Epithelzellen unter aseptischen Bedingungen von anderen Zellen und kultivieren Sie die Zellsuspension auf einer 10 Zentimeter großen Petrischale mit vollem IMDM für mindestens acht Stunden oder über Nacht in einem Inkubator bei 32 Grad Celsius.

Am nächsten Morgen bereiten Sie die sterilen Deckgläser durch Eintauchen in 100%igen Alkohol vor. Trocknen Sie sie an der Luft und tauchen Sie sie dann in eine kleine Menge Kulturmedium. Legen Sie dann die Deckgläser in sechs Zentimeter große Kulturschalen oder in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte.

Ernten Sie nun die dissoziierten Epithelzellen, indem Sie die Zellsuspension vorsichtig aus der Petrischale sammeln, die hauptsächlich aus Epithelzellen besteht. Die Zellsuspension wird fünf Minuten lang bei 30-facher G bei Raumtemperatur zentrifugiert und anschließend der Überstand dekantiert. Anschließend resuspendieren Sie das Zellpellet in zwei Millilitern vollem IMDM.

0,2 Milliliter der geernteten Zellsuspension auf die Mitte jedes sterilen Deckglases aussäen. Lassen Sie die Zellsuspension mindestens 10 Minuten lang im Flüssigkeitströpfchen absetzen, damit die Zellen locker an den Glasabdeckungsrutschen haften können. Geben Sie dann vorsichtig einen Milliliter volles IMDM am Rand einer Sechs-Zentimeter-Schale oder 0,3 Milliliter volles IMDM in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte, ohne die Zellen zu stören.

Halten Sie die isolierten Einzelzellen auf Deckgläsern im Inkubator bei 32 Grad Celsius, bis die Patch-Clamp-Experimente beginnen. Am Tag des Patch-Clamp-Experiments wird ein Aliquot der intrazellulären Lösung auf Eis aufgetaut und während des Patch-Clamp-Experiments gekühlt, um eine Degradation zu verhindern. Übertragen Sie anschließend die Kultivierungsepithelzellen auf dem gläsernen Deckglas in die Aufzeichnungskammer, die mit Standard-PSS bei Raumtemperatur gefüllt ist.

Wechseln Sie das Bade-PSS vorsichtig mindestens zweimal mit einer Pipette, bevor Sie mit einer Patch-Clamp experimentieren. Um die Ganzzellkonfiguration zu bestimmen, tauchen Sie die Pipette mit der höchsten Geschwindigkeit des Mikromanipulators in die Badlösung. Suchen Sie die Pipettenspitze auf dem Bildschirm, der mit der Digitalkamera verbunden ist.

Verlangsamen Sie dann die Geschwindigkeit des Mikromanipulators auf den mittleren bis hohen Modus. Überprüfen Sie schnell den Widerstand der Mikropipette mit dem Befehl der Datenerfassungsschnittstelle, indem Sie einen vom computergesteuerten Verstärker erzeugten Spannungsschritt anlegen. Wechseln Sie zu einer neuen Mikropipette, wenn der Widerstand deutlich außerhalb dieses Bereichs liegt.

Und setzen Sie das Flüssigkeitsübergangspotenzial zwischen der Pipette und der Badlösung auf Null, indem Sie den Pipetten-Offset-Befehl in der Commander-Oberfläche der Software verwenden. Überwachen Sie den Widerstand mit dem Membrantest. Wenn der Widerstand größer als 500 Megaohm, aber kleiner als ein Gigaohm ist, legen Sie ein negatives Potential an, um die Bildung des Gigaseal zu unterstützen.

Kompensieren Sie in der Zwischenzeit den transienten kapazitiven Strom der Mikropipette. Wenden Sie in diesem Moment einen 10-Millivolt-Hyperpolarisationsschritt von einem Haltepotential von null Millivolt für die Bestimmung des Dichtungswiderstands an. Unmittelbar nach Erreichen einer erfolgreichen Ganzzellenkonfiguration wenden Sie einen Hyperpolarisationsschritt von 10 Millivolt von einem Haltepotential von minus 60 Millivolt an.

Schalten Sie den Spannungsmodus in den Nullstrommodus und führen Sie eine 10-sekündige lückenlose Aufzeichnung durch, um das Ruhemembranpotential der Zelle zu messen. Schalten Sie anschließend schnell wieder in den Spannungsmodus um und bleiben Sie im Spannungsmodus. Wenden Sie die Spannungsprotokolle entsprechend den geplanten Experimenten an und messen Sie die Stromantworten.

Hier sind die Beispiele der Epithelzellen, die vor und nach der Wiederernte der Übernachtkultur auf der Schale vor den Patch-Clamp-Experimenten aus den Cauda Epididymides der Ratte isoliert wurden. Diese Abbildung zeigt die typischen Ganzzellströme, die von einzelnen Nebenhodenepithelzellen mit Hilfe eines pulsauslösenden Protokolls aufgezeichnet wurden. Die gestrichelte Linie zeigte die Nullstrompegel an.

Hier ist das Verhältnis der Stromspannung der zu den angegebenen Zeitpunkten gemessenen Stromantworten. Dies sind die repräsentativen Spuren des Ruhemembranpotentials der Hauptzellen, die mit einer Pipettenlösung dialysiert wurden, entweder mit ATP oder ohne ATP. Und dieses Balkendiagramm zeigt keinen signifikanten Unterschied zwischen dem anfänglichen Ruhemembranpotential von plus ATP und minus ATP.

Die Zahlen in Klammern innerhalb der Balken geben die Anzahl der getesteten Zellen von mindestens drei Tieren an. Und hier sind die Korrelationsanalysen des Dichtungswiderstands und des Eingangswiderstands aller Zellen oder nur der Hauptzellen im Vergleich zu den Ruhepotentialen, die an der Nullstromklemme kurz nach der Etablierung der gesamten Zelle gemessen wurden, und den Stromgrößen, die an der Hyperpolarisationsstufe gemessen wurden, auf minus 100 Millivolt vom Haltepotential. Einmal gemeistert, kann diese Technik in neun Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, den enzymatischen Verdau sofort während der Zellisolierungsschritte zu stoppen. Andernfalls kann es zu einer Überverdauung kommen, die zu einer schwierigen Bildung einer Gigaohm-Dichtung und zum Scheitern von Patch-Clamp-Experimenten führen kann. Um die Gesundheit der Kultur zu erhalten, ist es wichtig, das enzymatisch dissoziierte Zellgemisch in der niedrigen Geschwindigkeit von 30 G zwei bis drei Minuten lang herunterzuschleudern und dann den klebrigen Überstand, der hauptsächlich Spermien enthält, zu dekantieren.

Im Anschluss an diese Verfahren können weitere Methoden wie die Bildgebung lebender Zellen und eine Einzellkulturtechnik durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. das Ruhemembranpotential in naiven Epithelzellen, das extrazelluläre Verhalten unter kontrollierten Bedingungen regulieren könnte. Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Reproduktionsbiologie den Weg, um die elektrophysiologischen Eigenschaften von Epithelzellen der Nebenhoden für die Regulierung der Spermienreifung und der Vererbung väterlich erworbener Merkmale zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Epithelzellen aus Rattennebenhoden isoliert und wie man die elektrischen Eigenschaften dieser Zellen mit der Ganzzell-Patch-Clamp-Methode misst.