Name: Neonatal Murine Cochlear Explant Technik als In vitro Screening-Tool in der Hörforschung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Lernen Sie die Präparation, Kultur und Immunfärbung neonataler muriner Cochlea-Explantate als In-vitro-Screening-Tool für die Hörforschung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Haarzellen, Synapsen und Neuronen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Institute of Deafness und anderen Kommunikationsstörungen Zuschüsse R01DC015824 (KMS) und T32DC00038 (Unterstützung SD), die Abteilung für Verteidigung gewähren W81XWH-15-1-0472 (KMS), die Bertarelli Foundation (KMS), die Nancy Sayles Day Foundation (KMS) und das Lauer Tinnitus Research Center (KMS). Wir danken Jessica E. Sagers, BA für aufschlussreiche Kommentare zum Manuskript.

Das Studienprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Massachusetts Eye und Ear genehmigt. Die Experimente wurden nach dem Ethikkodex der World Medical Association durchgeführt. 1. Vorbereitung der Dissektion <ol><li> Vorbereitung der chirurgischen Tabelle <ol><li> Verwenden Sie 70% Ethanol, um den chirurgischen Tisch zu desinfizieren. </li><li> Lege zwei unversöhnliche Vorbereitungspads neben dem Mikroskop auf. </li><li> Bereiten Sie das Instrumentenfach vor, einschließlich der hitze-sterilisierten Bedienschere, eines Skalpellgriffes, eines Mikromessers und einer Pinzette (jeweils zwei # 4 &amp; # 55). Legen Sie die Instrumententafel und eine 50 mm breitblättrige Petrischale auf eine nicht sterile Unterlage. </li><li> Erhalten Sie eine sterile # 15 Skalpell Klinge; Ein abdichtbarer Plastikbeutel oder -behälter (zur Entsorgung der Schlachtkörper im Einklang mit den institutionellen Richtlinien); Eis in einem Eimer; Und kalte, sterile Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS). Lege diese Gegenstände auf dieAndere nonsterile Pad </li><li> Übertragen Sie die HBSS in ein 50 ml Plastiklaborrohr und legen Sie es auf Eis. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Kultur <ol><li> Bereiten Sie alle Materialien in einer laminaren Strömungshaube vor. Für jede vier Exemplare, setzen vier autoklavierte 10 mm runde Glasabdeckungen in die vier Einlagen der 35 mm 4-well Petrischale. </li><li> Für jede 4 Exemplare wird ein Gesamtvolumen von 300 μl, bestehend aus folgendem in einem Mikrozentrifugenröhrchen, vermischt: 10 μl Gewebeklebstoff, 285 μl NaHCO 3 und 5 μl NaOH. </li><li> 40 μl der resultierenden Lösung auf jeden Deckzettel geben und dort mindestens 20 min bei RT ablassen; Diese Lösung kann für mehrere Stunden auf dem Deckglas belassen werden, kann aber nicht O / N bleiben. </li><li> Legen Sie eine oder zwei 35 mm 4-well Petrischale in einer 10 cm Petrischale, um zwei Barrieren gegen Verschmutzung zu schaffen. </li><li> Bereiten Sie Kulturmedium mit 98% Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), 1% N-2 und 1% Ampicillin (65 μl pro Vertiefung in einem (Mikro-) Zentrifugenröhrchen). Die Lösung vor 25 ° C auf 25 ° C erwärmen. </li></ol></li></ol> 2. Murine Cochlear Explant Dissection <ol><li> Enthauptung der neonatalen Maus <ol><li> Erhalten Sie eine 60-mm-Plastik-Petrischale und sprühen Sie 70% Ethanol in den Deckel, so dass die Oberfläche nass ist. </li><li> Gießen Sie kaltes HBSS aus dem Kunststoff-Laborrohr in den unteren Teil des 60-mm-Plastiks und die 50 mm klare Wand aus Glas-Petrischale. Lagern Sie das Plastiklaborrohr und beide Petrischalen auf Eis, um das Gewebe kalt zu halten, wann immer es nicht zerlegt wird. </li><li> Lege eine P3 - P5 - gealterte neonatale Maus auf Eis in einen Cutoff - Finger eines Latexhandschuhs und warte, bis die Hypothermie den Verlust des Bewusstseins (ca. 1-3 min) induziert. </li><li> Entkuppeln Sie die Maus schnell mit einer Arbeitsschere und entsorgen Sie den Körper in der versiegelbaren Plastiktüte. Setzen Sie den abgetrennten Neugeborenenkopf in die70% Ethanol im Deckel der 60 mm Plastik-Petrischale. </li></ol></li><li> Makroskopische Dissektion des Schläfenbeins <ol><li> Entfernen Sie die Haut des Schädels, indem Sie einen oberflächlichen Schnitt vom vorderen bis zum hinteren Ende (direkt über die Sagittalnaht) mit dem Skalpellblatt machen. </li><li> Schneiden Sie beide äußeren Gehörgänge mit dem Skalpellblatt und falten Sie die Haut nach vorne, um den ganzen Schädel auszusetzen. HINWEIS: Obwohl für dieses Schritt kein Dissektionsmikroskop benötigt wird, kann es für eine verbesserte Visualisierung verwendet werden. </li><li> Öffnen Sie den Schädel entlang der Sagittal Naht mit dem # 15 Skalpell Klinge. Achten Sie darauf, den Schädel zu schneiden, indem Sie die Klinge vorsichtig von vorne nach hinten nach oben bewegen und die Kompression der Cochleae vermeiden. HINWEIS: Der Schädel sollte in diesem Alter nicht verknöchert werden und sollte leicht schneiden. </li><li> Entfernen und verwerfen Sie die Schnauze, indem Sie einen vertikalen Schnitt direkt hinter den Umlaufbahnen mit dem # 15 Skalpell machenKlinge. HINWEIS: Der hintere Teil des Schädels sollte noch das Gehirn und die Cochleae enthalten. </li><li> Entsorgen Sie das Vorderhirn, Kleinhirn und Hirnstamm durch stumpfe Dissektion mit # 4 Pinzette. </li></ol></li><li> Mikroskopische Extraktion der Cochleae <ol><li> Stellen Sie das Mikroskop (6,5fache Vergrößerung) und die Lichtquelle ein, indem Sie die Pinzette unter den Geltungsbereich stellen und die Beleuchtung und den Fokus optimieren. </li><li> Legen Sie die beiden Hälften des Schädels in die 60 mm Plastik-Petrischale, die mit kaltem HBSS gefüllt ist. </li><li> Vollständig die Cochlea / e ausstellen, die als angrenzend an die umgebende Stapedialarterie (eine gewundene Arterie innerhalb des Schläfenbeins) identifizierbar ist, und das Orgel aus dem Schläfenbein mit Hilfe der # 4 Pinzette unverblümt trennen. </li><li> Übertragen Sie die Cochlea in die 50 mm, klarwandige, Petrischale mit Glasboden und legen Sie die Schale unter das Mikroskop. </li><li> Legen Sie die 60 mm Plastik Petrischale mit der anderen Hälfte des Schädels auf Eis. </Li&gt; <li> Entfernen Sie die Cochlea aus dem Vestibularsystem und zerlegen Sie sorgfältig die Cochlear-Otic-Kapsel (typisch knorpelig in diesem Alter) mit # 4 Pinzette. Verwenden Sie # 55 Pinzette für alle weiteren Schritte. </li></ol></li><li> Endschritte der Gewebeverarbeitung <ol><li> Weiter mit der Verarbeitung des Innenohrgewebes durch sorgfältiges Trennen des Spiralbandes an das Orgel von Corti aus dem Rest der Cochlea und dem Modiolus mit dem Mikromesser oder zwei Pinzetten. <ol><li> In den dunkleren, lichtdurchlässigen Bereich an der Felsspalte zwischen dem Spiralband und dem Haarzellenbereich schneiden und mit dem darauffolgenden Entfernen des Spiralbandes fortfahren, indem man ihn am grundsätzlichsten anfängt und ihn bei gleichzeitiger Verschiebung sanft abwickelt. </li></ol></li><li> Positionieren Sie die Probe, um eine längliche, sagittale Ansicht der Cochlea zu erhalten und die Cochlea in zwei bis drei Abschnitte unter Verwendung des Mikromessers zu schneiden, wobei diese Abschnitte als die apikale (mittlere) und b klassifiziert werdenAsal dreht sich Entfernen Sie das Gewebe überlegen und unterhalb der tatsächlichen Schicht von Haarzellen und Neuriten, um ein Cochlea-Explantatstück zu erreichen, das horizontal auf der Petrischale liegen kann. HINWEIS: Eine angemessene Größe für eine stabile Haftung an der Kulturschale ist etwa die Hälfte einer Cochlear-Umdrehung. </li><li> Entfernen Sie die Tectorialmembran, eine sehr dünne lichtdurchlässige Schicht, die dem Organ des Corti unmittelbar überlegen ist, indem Sie sie sanft mit einer Pinzette abschälen. </li><li> Entfernen Sie die Membran von Reissner, die den SGNs überlegen ist, indem Sie sie mit einer Pinzette auf beiden Seiten berühren und sie abschälen. HINWEIS: Entfernen Sie alle seitlich angeordneten beschädigten Haarzellen, indem Sie sie mit dem Mikromesser abschneiden. </li></ol></li></ol> 3. Übertragen von Exemplaren auf die Kulturplatten <ol><li> Entfernen Sie die 45 μl Gewebeklebstofflösung aus den vier Deckgläschen. Waschen Sie jeden Deckel mit 50 μl sterilem H 2 O. Aspirieren Sie das Wasser. </li><li> Hebe die 1-ml-Pipette auf. Die Pipettenspitze mit ca. 120 μl DMEM benetzen, um zu verhindern, dass die Probe an der Innenseite der Spitze anhaftet. </li><li> Übertragen Sie die Proben einzeln mit der 1-ml-Pipette. Pipettieren Sie maximal 70 μl aus der HBSS-gefüllten, kleinen, klarwandigen, mit Petritornen versehenen Petrischale und legen Sie die Probe zusammen mit der Flüssigkeit auf eine der 4 Inlays (vorbereitet mit Deckgläschen) in die 4-Well-Petrischale . </li><li> Überprüfen Sie unter dem Mikroskop (50fache Vergrößerung), dass sich die Probe in der richtigen Ausrichtung befindet. Stellen Sie sicher, dass der Bereich der Haarzellen, von dem die Tectorialmembran entfernt wurde, nach oben zeigt. Sicherstellen, dass die Basilarmembran zusammen mit dem beschnittenen, basalen Teil des Modiolus nach unten weist und an dem Deckglas haftet. <ol><li> Wenn die Probe bei der Inspektion umgedreht wird, legen Sie die HBSS ab, die in der Pipettenspitze in die Einlage verbleibt, und positionieren Sie das Stück, bis es richtig ausgerichtet ist. NEINTE: Dies verhindert, dass Haarzellen in Kulturmedium ohne strukturelle Unterstützung aus dem Deckglas schweben, was zu Degeneration führen könnte. </li></ol></li><li> Setzen Sie überschüssiges HBSS mit der 1-ml-Pipette ein. Warten auf 15 s. </li><li> 25 μl des vorbereiteten warmen Kulturmediums (98% DMEM, 1% N-2 und 1% Ampicillin) direkt auf die Probe pipettieren. Achten Sie darauf, das Exemplar nicht mit der Pipette zu berühren. Ersetzen Sie die inneren und äußeren Petrischalenabdeckungen und inkubieren Sie O / N bei 37 ° C. </li><li> Setzen Sie alle Lagerlösungen an ihre richtigen Stellen zurück, entsorgen Sie Schlachtkörper und Restmüll, dekontaminieren Sie den chirurgischen Tisch nach institutionellen Richtlinien ( z. B. mit Ethanol oder Hypochlorit), reinigen und autoklavieren Sie die Instrumente und entsorgen Sie die Scharfe im entsprechenden Behälter . </li></ol> 4. Hinzufügen von endgültigen Kulturmedien und Substanzen von Interesse ANMERKUNG: Cochlea-Explantate sind für 10-16 Stunden später bereit. <ol><li> Vorbereitung einer MischungVon 97% DMEM, 1% fötalem Rinderserum (FBS), 1% N-2 und 1% Ampicillin (65 μl pro Vertiefung in einem Mikrozentrifugenröhrchen, Erwärmen der Lösung auf 25 ° C vor Gebrauch). </li><li> Fügen Sie andere Substanzen für die Lösungen für die jeweiligen Behandlungsgruppen hinzu. Wenn fluoreszierende Substanzen zugegeben werden ( zB grün fluoreszierende Proteine ​​(GFP) -exprimierende Viren, wurde in einer neueren Publikation eine Konzentration von 10 10 GC Adeno-assoziierten Viren (AAVs) für 48 h in 50 μl) verwendet Licht. </li><li> Übertragen Sie die Cochlea-Explantat-haltigen Petrischalen aus dem Inkubator und legen Sie sie unter die laminare Strömungshaube. </li><li> Aspirieren Sie das alte Kulturmedium (ohne FBS) mit der Pipette aus den Inlays. </li><li> Fügen Sie 60 μl pro Vertiefung des vorbereiteten Warmkultur- (Behandlungs-) Mediums (97% DMEM, 1% FBS, 1% N-2, 1% Ampicillin und die interessierenden Stoffe) hinzu. </li><li> Legen Sie die Petrischale wieder in den Inkubator (37 ° C). </li><li> Ansicht rEgal unter dem Mikroskop, um Anzeichen einer Kontamination, zelluläre Migration oder Ablösung des Cochlea-Explantats zu identifizieren und Färbung nach maximal 7 Tagen durchzuführen. </li></ol> 5. Immunfluoreszenz - Tag 1 <ol><li> Vorbereitung der Blockierungslösung (94% Phosphat-gepufferte Saline (PBS), 5% normales Ziegen- oder Pferdeserum (NGS / NHS, abhängig von den sekundären Antikörpern) und 1% nichtionisches Tensid (siehe Tabelle der Materialien )) und Bestand Antikörper-Lösung (98,6% PBS, 1% NHS und 0,4% nichtionisches Tensid mit den jeweiligen Antikörpern). ANMERKUNG: Antikörper umfassen Kaninchen anti-Myo7A bei einer Konzentration von 1: 400+ (Myosin 7A, für innere und äußere Haarzellen) und Maus anti-TuJ1 1: 200+ (β-Tubulin, für SGNs) ODER Maus (IgG1) anti -CtBP2 1: 200+ (C-terminales Bindungsprotein, für Presynapse), Maus (IgG2a) anti-PSD95 1: 50+ (postsynaptische Dichte, für postsynapse) und Hühner anti-NF-H 1: 1000+ (Neurofilament, Für SGNs und Nervenfasern). &quot;+&quot; MeaNs &quot;oder höher&quot;. </li><li> Das Kulturmedium mit einer Pipette ausspülen. Achten Sie darauf, das Exemplar nicht zu berühren. </li><li> Unter der Laminar-Flow-Kapuze spülen Sie die Cochlea-Explantate zweimal mit sterilem PBS aus und legen die Exemplare für 5 min nach jeder Wäsche auf einen Shaker. </li><li> Fixieren Sie das Gewebe in 4% Paraformaldehyd (PFA - VORSICHT) für 20 min auf dem Shaker (unter der Kapuze). Aspirieren Sie die PFA. </li><li> Tragen Sie 60 μl PBS auf die Cochlea-Explantate und legen Sie die Petrischale auf einen Shaker für 5 min. Aspirieren Sie die PBS. Wiederholen Sie 3x. </li><li> Legen Sie die Cochlea-Explantate in eine präparierte Sperrlösung (94% PBS, 5% NHS und 1% nichtionisches Tensid) für 30 min auf Shaker. </li><li> Legen Sie die Cochlea-Explantate in eine vorbereitete Antikörper-Lösung (98,6% PBS, 1% NHS und 0,4% nichtionisches Tensid) mit den jeweiligen primären Antikörpern (Vortex vor Gebrauch) O / N auf einem Zähler bei RT. HINWEIS: Wickeln Sie die Petrischalen mit feuchten Papiertüchern ein, die in Plastikfolie eingeschlossen sind (oder Aluminiumfolie, wenn das hinzugefügte SolutIon enthält fluoreszierende Materialien wie GFP-exprimierende Viren), um das Geschirr feucht zu halten und die Verdampfung der Antikörperlösung O / N zu verhindern. </li></ol> 6. Immunfluoreszenz - Tag 2 <ol><li> Bereiten Sie den 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) -Färbung (300 nM) vor und verwenden Sie die Stamm-Antikörper-Lösung, um die richtigen sekundären Antikörper-Mischungen zu erhalten, die komplementär zu den primären Antikörpern in Schritt 5.1 sind. (IgG1) 488 1: 200+ und Ziegen-Anti-Maus 568 1: 200+ ODER Ziegen-Anti-Maus (IgG1) 568 1: 1000+, Ziegen-Anti-Maus (IgG2a) 488 1: Und Ziegen-Anti-Huhn 647 1: 200+ ODER Phalloidin 568 1: 200+ (für innere und äußere Haarzellen)). </li><li> Ansaugen der primären Antikörperlösung. </li><li> Tragen Sie 60 μl PBS auf die Cochlea-Explantate und legen Sie die Petrischale auf einen Shaker für 5 min. Aspirieren Sie die PBS. Wiederholen Sie 3x. </li><li> Legen Sie die Cochlea-Explantate in die vorbereitete Antikörper-Lösung (98,6% PBS, 1% NHS und 0,4% nichtionisches Tensid) mit der ResPektive sekundäre Antikörper (Vortex vor Gebrauch) für 1,5 h auf einem Theke und vor Licht schützen. </li><li> Aspirieren Sie die sekundäre Antikörperlösung und spülen Sie die Cochlea-Explantate mit einem DAPI-Fleck aus (Platzieren auf einem Shaker für 1 Minute und dann aspirieren). </li><li> Tragen Sie 60 μl PBS auf die Cochlea-Explantate und legen Sie die Petrischale auf einen Shaker für 5 min. Aspirieren Sie die PBS. Wiederholen Sie 3x. </li><li> Verwenden Sie Pinzetten, um Deckgläser mit Proben aus der 4-Well-Platte zu entfernen, tauchen Sie sie in einen mit destilliertem H 2 O gefüllten Empfänger und trocknen Sie die Deckgläser, indem Sie sie vertikal mit Papiertüchern in Berührung bringen. </li><li> Legen Sie einen Tropfen Antifade-Montagemedium auf den Objektträger und umdrehen Sie die Deckgläser, um das nach unten gerichtete Gewebe in das Medium einzutauchen. </li><li> Dichtung des Deckglases mit klarem Nagellack, der den Rand umgibt (ohne die Probe unter dem Glas zu zerkleinern). Lassen Sie die Rutschen flach in einem überdachten Bereich weg von Licht für 15 - 20 min bis trocken und thSie in eine Schachtel legen oder unter dem konfokalen Mikroskop untersuchen. HINWEIS: Die Fluoreszenzfärbung wird am besten durch die Aufbewahrung der Objektträger bei 4 oder -20 ° C erhalten. </li></ol> 7. Konfokale Bildgebung <ol><li> Erhalten Sie einen Überblick und gezoomte Bilder für die Orgel der Region Corti, einschließlich Neuriten und SGNs. HINWEIS: Standardeinstellungen für den Imaging-Prozess: Format von 1.024 x 1.024 Pixeln, Geschwindigkeit von 400 Hz, Frame-Durchschnitt von 3, 20% Gesamt-Laserintensität und meist 20X und 63X Objektiv mit Öleintritt (potentiell kombiniert mit 2fachem Digitalzoom). Die Kanaleinstellungen für das DAPI-, Myo7A- und TuJ1-Färbeprotokoll sind oben skizziert: 405 5% DAPI, &quot;Smart Gain&quot; 766.8V, &quot;Smart Offset&quot; 0,0% - 488 15% Fluoresceinisothiocyanat (FITC), &quot;Smart Gain&quot; 622.2V , &quot;Smart Offset&quot; 0,0% - 561 13% Tetramethylrhomadinisothiocyanat (TRITC), &quot;Smart Gain&quot; 562.4V, &quot;Smart Offset&quot; 0,0%. </li><li> Fügen Sie die Bilder in einem Z-Stack mit demSoftware, um eine z-Achsenprojektion zu erhalten. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Forscher müssen die Dissektionstechnik perfektionieren, bevor sie Experimente mit Cochlea-Explantaten durchführen. Haarzellen werden häufig während der Sezierungen, die früh in der Lernkurve durchgeführt wurden, beschädigt, und ein besonders problematisches Moment für ihre Integrität ist die Entfernung der tectorialen Membran, die ständige Hände, richtige Werkzeuge und Erfahrung erfordert. Um Zeit und Ressourcen zu sparen, sollte eine visuelle Kontrolle unter dem Sektionsmikroskop durchgeführt werden und möglicherwe...

Sensorineural Hörverlust (SNHL) spiegelt Schäden am Innenohr oder aufsteigender Gehörgang. Während Hörverlust das häufigste sensorische Defizit bei Menschen 1 ist , existieren heilende Therapien noch nicht 2 . Obgleich Cochlear- oder auditorische Hirnstammimplantate ein gewisses Maß an Hörvermögen für Patienten mit schwerer bis tiefgehender SNHL wiederherstellen können, ist das Hören, das von diesen Geräten zur Verfügung gestellt wird, immer noch sehr verschieden von dem &quot;natürlichen&quot; Gehör, vor allem bei Versuchen, die Sprache im Lärm zu verstehen oder Musik zu hören. Während die Haarzelldegeneration seit langem als die primäre Konsequenz traumatischer auditorischer Ereignisse ( z. B. Exposition gegenüber lautem Rauschen) angesehen wird, gibt es wachsende Hinweise darauf, dass die Synapsen, die Informationen von Haarzellen zum Hörnerv übermitteln, mindestens ebenso anfällig für akustisches Trauma 3 sind , 4 , 5 </sup<html> &gt; , 6 Da menschliche audiometrische Schwellenwerte, der aktuelle Goldstandard für die Auswertung der Hörfunktion, keine spezifische Zellschädigung im Innenohr vorhersagen, sind so bald wie möglich raffinierte Werkzeuge erforderlich, um die zelluläre Degeneration so schnell wie möglich zu erkennen und eine adäquate Behandlung einzuleiten 7 . Vielversprechende pharmazeutische Behandlungen für Hörverlust werden oft in homogenen Zellkulturen in vitro getestet, aber solche Systeme präzisieren die Cochlea-Mikroumgebung nicht genau. Cochlear-Zellen sind bekannt, um trophische Faktoren zu sezern, die andere Zelltypen innerhalb der Cochlea 8 , 9 beeinflussen, ein entscheidendes in vivo- Verfahren, das verloren geht, wenn das Organ von Corti 10 , 11 oder Spiral-Ganglion-Neuronen (SGNs) 12 isoliert oder kultiviert wird Molekulare Marker werden analysiertEf &quot;&gt; 13. In vivo- Studien, die für die Validierung von In-vitro- Daten notwendig sind, um neue, personalisierte Behandlungen für Hörverlust bei der Verfolgung von&quot; Präzisionsmedizin &quot;zu schaffen, erfordern erhebliche Ressourcen und Zeit. Dies ist besonders wichtig bei der Betrachtung Wie viel Aufwand für die Vervollkommnung und Durchführung von Mittelohr- oder Rundfenster-Membran-Injektionen mit Hörtests und die anschließende Zerlegung von Cochlear-Vollmontagen erforderlich ist. Das effiziente Screening von vielversprechenden Verbindungen in organotypischen Ex-vivo- Kulturen, die als Cochlea-Explantate bekannt sind, bietet eine wirtschaftliche und zuverlässige Alternative 14 , 15 , 16 , 17 . Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, mit dem bearbeitete Cochlea-Explantate erzeugt, gepflegt und ausgewertet werden können. Spezielle Anwendungen für dieses Modell werden unterstrichen, einschließlich seiner Verwendung in der ScreeningVon potentiell therapeutischen Verbindungen und der vergleichenden Bewertung von Virusvektoren für die Gentherapie. Ein Ex-vivo- Explantat-Ansatz ermöglicht es Forschern, die Effekte einer gegebenen Behandlung auf verschiedene Zellpopulationen in situ zu visualisieren, die Identifizierung von zelltypspezifischen Mechanismen und die anschließende Verfeinerung von zielgerichteten Therapeutika zu erleichtern. Insgesamt bietet diese Technik ein Modell, um die Cochlea ex vivo zu studieren, während sie ein vitales Übersprechen zwischen den sehr unterschiedlichen Zelltypen, die in der Cochlea koexistieren, bewahrt werden.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin, Natriumsalz</td><td>Invitrogen</td><td>11593-027</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CtBP2-Antikörper, Maus (IgG1)</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>612044</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myo7A-Antikörper, Kaninchen</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NF-H-Antikörper, Huhn</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5539</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PSD95 Antikörper, Maus (IgG2a)</td> <td>Antikörper Inc.</td><td>75-028</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TuJ1 Antikörper, Maus</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak Zell- und Gewebekleber, 5 mg</td><td>Corning</td><td>354241</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 15 mL Zentrifugenröhrchen, konischer Boden, Graduierung, steril</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188161</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Zellkulturschale, 100 x 20 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Zellkulturschale, 35 x 10 mm, 4 Innenringe</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627170</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Zellkulturschale, 60 x 15 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 50 mL Zentrifugenröhrchen, konischer Boden, Graduierung, steril</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Klarlack</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Klarwand-Schalen mit Glasboden (Glas 40 mm), PELCO&reg;, Hülse/20, 50 x 7 mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14027-20</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser, rund, Glas, 10 mm Durchmesser, Dicke #1, 0,13 - 0,16 mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td></td><td></td>260368</tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15230-162&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), hoher Glukosegehalt, Pyruvat, kein Glutamin, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Pinzetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Pinzette (Dumostar)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalkohol (EtOH), rein, 200 Proof, wasserfrei, &ge; 99,5 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>459836-1 l</td><td></td></tr><tr><td>fötales Kälberserum (FBS), qualifiziert, USDA-zugelassene Regionen, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437-028</td><td>Aliquot in 50 mL Röhrchen und Lagerung in -20 ° G; C Gefrierschrank</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Chicken-647 Sekundärantikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21469</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus (IgG)-568 Sekundärantikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus (IgG1)-568 Sekundärantikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21124</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus (IgG2a)-488 Sekundärantikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-488 Sekundärantikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37116</td><td></td></tr><tr><td>H2O, steril, EmbryoMax Reinstwasser, 500 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>TMS-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), Calcium, Magnesium, kein Phenolrot, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Instrumententablett mit Deckel Edelstahl</td><td>Mountainside Medical</td><td>TechMedMed4255</td><td></td></tr><tr><td>Mikromesser (Präpariermesser) &ndash; abgewinkelt 30°;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger, VistaVision, farbcodiert, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm dick, weiß, 72 Stück</td><td>VWR</td><td>16004-382</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X), 5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3, Natriumbicarbonat 7,5% Lösung, 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>NaOH, Natronlauge, 1 L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Normales Pferdeserum (NHS)</td><td>Invitrogen</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Operationsschere</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6806</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA), Reagenzqualität, kristallines</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Vor der Verwendung: Festlegung von Standardarbeitsanweisungen auf der Grundlage online verfügbarer Protokolle</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023&nbsp;</td><td>Autoklav vor dem Gebrauch</td></tr><tr><td>Phalloidin, Alexa Fluor 568&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>Vorbereitungspad, unsteril&nbsp;</td><td>Medline</td><td>05136CS</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen, Polypropylen, 0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363719</td><td>Autoklav vor dem Gebrauch</td></tr><tr><td>Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen, Polypropylen, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td>Autoklav vor dem Gebrauch</td></tr><tr><td>Skalpellklingen - #15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff - #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000-C Stereomikroskop</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5 Konfokalmikroskop</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X (nichtionisches Tensid)</td><td>Integra</td><td>T756.30.30</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield Antifading-Eindeckmedium für Fluoreszenz</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Reißverschlusstasche, wiederverschließbar, 4 x 6'' - 2 mm stark</td><td>Zipline</td><td>0609132541599</td><td></td></tr></tbody></table>

neonatal murine cochlear explant technik als<em&gt; in vitro</em&gt; screening-tool in der hörforschung

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Während es in den vergangenen Jahrzehnten bemerkenswerte Fortschritte in der Hörforschung gegeben hat, gibt es noch keine Heilung für den sensorineuralen Hörverlust (SNHL), eine Bedingung, die typischerweise eine Beschädigung oder einen Verlust der empfindlichen mechanosensorischen Strukturen des Innenohrs beinhaltet. Ausgefeilte In-vitro- und Ex-vivo- Assays haben sich in den letzten Jahren entwickelt, was es ermöglicht, eine zunehmende Anzahl von potentiell therapeutischen Verbindungen zu screenen und gleichzeitig die Ressourcen zu minimieren und die Bemühungen um die Entwicklung von Kuren für SNHL zu beschleunigen. Obwohl homogene Kulturen bestimmter Zelltypen weiterhin eine wichtige Rolle in der aktuellen Forschung spielen, verlassen sich viele Wissenschaftler nun auf komplexere organotypische Kulturen von murinen inneren Ohren, die auch als Cochlea-Explantate bekannt sind. Die Erhaltung organisierter Zellstrukturen im Innenohr erleichtert die in situ- Bewertung verschiedener Komponenten der Cochlea-Infrastruktur, einschließlich innerer und äußerer Haarzellen, Spiralganglion-Neuronen, NeurItes und unterstützende Zellen. Hier präsentieren wir die Vorbereitung, Kultur, Behandlung und Immunfärbung von neonatalen murinen Cochlea-Explantaten. Die sorgfältige Vorbereitung dieser Explantate erleichtert die Identifizierung von Mechanismen, die zu SNHL beitragen und ein wertvolles Instrument für die Hörforschungsgemeinschaft darstellen.

Während viele Protokolle auf Orgel von Corti explants konzentrieren, versucht diese Technik, die Anatomie der gesamten Cochlear-Umdrehung zu bewahren, einschließlich der SGNs. Dies gibt den Forschern die Möglichkeit, die Auswirkungen einer gegebenen Behandlung auf Neuriten und Somata von SGNs zusätzlich zu dem Organ von Corti zu analysieren. Die Durchführung einer Sektion, die einen Teil des Modiolus bewahrt, wie hier beschrieben, ist technisch anspruchsvoller, als das Organ von Corti al...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Vorbereitung, Kultur, Behandlung und Immunfärbung von neonatalen murinen Cochlea-Explantaten zu demonstrieren. Die Technik kann als In-vitro- Screening-Tool in der Hörforschung genutzt werden.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technik als<em&gt; In vitro</em&gt; Screening-Tool in der Hörforschung

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Herstellung, Kultur, Behandlung und Immunfärbung neonataler muriner Cochleaauswucherungen, die als in-vitro-Screening-Tool in der Hörforschung verwendet werden sollen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Hörforschung zu beantworten, beispielsweise indem sie die gleichzeitige Untersuchung von Cochleahaarzellen, Synapsen, Neuriten und Neuronen in einem ex-vivo-Modell ermöglicht und Einblicke in die Wirkmechanismen von für die Cochlea neuen Molekülen liefert, einschließlich Faktoren, die in menschlichen Sekreten vorkommen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass der Screening-Prozess für potenzielle therapeutische Substanzen vor deren in-vivo-Testung beschleunigt werden kann.Beginnen Sie mit einem frisch gesammelten Neugeborenenkopf, der in 70 % Ethanol in der Petrischalenabdeckung aufbewahrt wird. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um einen oberflächlichen Schnitt von der vorderen zur hinteren Seite des Schädels in die Haut einzubringen. Schneiden Sie anschließend beide äußeren Gehörgänge durch und klappen Sie die Haut nach vorne, um die gesamte Schädelkalotte freizulegen.Öffnen Sie anschließend den Schädel entlang der Sagittalsymphese, indem Sie die Skalpellklinge vorsichtig von anterior nach posterior auf und ab bewegen, um eine Kompression der Cochlea zu vermeiden. Entfernen und entsorgen Sie den Rüssel, indem Sie einen vertikalen Schnitt direkt hinter den Orbitae durchführen. Der hintere Teil des Schädels sollte weiterhin das Gehirn und die Cochlea enthalten.Verwenden Sie dann 4 Pinzetten, um das Vorderhirn, Kleinhirn und Hirnstamm stumpf zu dissezieren und zu entfernen. Legen Sie die beiden Hälften des Schädels in eine 60 Millimeter große Kunststoff-Petri-Schale, die mit kaltem HBSS gefüllt ist. Verwenden Sie anschließend 4 Pinzetten, um die Cochlea vollständig freizulegen, die neben der umgebenden stapedialen Arterie liegt, und trennen Sie das Organ stumpf vom Schläfenbein.Übertragen Sie das Cochlea in eine 50 Millimeter durchmessende, durchsichtige Glasboden-Petri-Schale, die HBSS enthält, und stellen Sie die Schale unter das Mikroskop. Stellen Sie die 60 Millimeter durchmessende Kunststoff-Petri-Schale mit der anderen Hälfte des Schädels auf Eis. Entfernen Sie anschließend mit Hilfe von 4 Pinzetten vorsichtig die otische Kapsel des Cochlea.Verwenden Sie nun ein Mikromesser oder zwei Pinzetten mit einer Kraft von 55, um das Spiralband, das am Corti-Organ befestigt ist, vorsichtig vom Rest der Cochlea und der Medialis zu trennen. Dies kann erreicht werden, indem man das Spiralband am basalsten Abschnitt erfasst und es vorsichtig entlang der apikalen Richtung abwickelt. Nachdem das Spiralband entfernt wurde, positionieren Sie die Probe so, dass eine sagittale Längsansicht der Cochlea erhalten wird.Schneiden Sie danach die Cochlea mit dem Mikromesser in zwei oder drei Abschnitte und klassifizieren Sie diese als apikale und basale Windungen. Entfernen Sie das überliegende Gewebe des jeweils apikaleren Stückes und das darunterliegende Gewebe des basaleren Stückes bis hin zur eigentlichen Schicht der Haarzellen und Neuriten, damit das Cochlea-Explantat horizontal in der Petrischale liegen kann. Anschließend fassen Sie vorsichtig mit der Pinzette die Tektorialmembran an, eine sehr dünne, durchscheinende Schicht unmittelbar oberhalb des Corti-Organs, und lösen sie vorsichtig ab.Der technisch anspruchsvollste Schritt ist vermutlich das Entfernen der dünnen, durchscheinenden Deckmembran, da man dabei leicht die darunterliegenden Haarzellen beschädigen kann. Indem man an den Rändern des Gewebes beginnt, bleiben die Haarzellen entlang der gesamten Länge des Explants erhalten, mit Ausnahme des äußersten Randbereichs, an dem das Ablösen der Deckmembran begann. Entfernen Sie abschließend die Membran von Reissner, die unmittelbar oberhalb der Spiralganglioneurone liegt, indem Sie sie mit der Pinzette an beiden Seiten berühren und abziehen.Die Cochlea-Probe ist nun bereit zur Kultivierung, nachdem beschädigte Bereiche an den Rändern entfernt wurden. Beginnen Sie das Kultivierungsverfahren, indem Sie die Spitze einer Ein-Milliliter-Pipette mit etwa 120 Mikrolitern DMEM benetzen, um zu verhindern, dass das Gewebestück an der Innenseite der Spitze haften bleibt. Verwenden Sie dann die vorbenetzte Spitze, um maximal 70 Mikroliter aus der Petrischale mit Glasboden abzusaugen, und übertragen Sie die Probe zusammen mit der Flüssigkeit auf eines der vier Einlegestücke in der Vier-Vertiefungs-Petrischale.Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob das Explant in der korrekten Orientierung liegt. Stellen Sie sicher, dass der Bereich der Haarzellen, von dem die Deckmembran entfernt wurde, nach oben weist, und dass die Basilarmembran zusammen mit dem beschnittenen basalen Teil der Medialis nach unten zeigt und an der Deckglas-Einlage haftet. Falls das Präparat bei der Kontrolle verkehrt herum liegt, wie hier gezeigt, geben Sie HBSS von der Pipettenspitze hinzu und positionieren Sie das Stück so lange neu, bis es richtig orientiert ist.Wenn das Explant korrekt ausgerichtet ist, saugen Sie überschüssiges HBSS ab und warten Sie dann 15 Sekunden. Geben Sie nun 60 Mikroliter warmes Kulturmedium direkt auf die Probe, wobei darauf zu achten ist, die Probe mit der Pipette nicht zu berühren. Setzen Sie die inneren und äußeren Petrischalen-Deckel wieder auf und inkubieren Sie die Probe über Nacht bei 37 Grad Celsius.Am nächsten Tag überführen Sie das kochleäre Gewebestück in den Petrischalen aus dem Inkubator in die sterilen Arbeitsbank. Aspirieren Sie das alte Kulturmedium, das kein FBS enthält, aus der Kultur. Geben Sie 60 Mikroliter pro Vertiefung des vorbereiteten warmen Behandlungsmediums hinzu.Stellen Sie die Petrischale zurück in den Inkubator, bis die Färbung der Kulturen nach maximal sieben Tagen erfolgt. Wie in diesem konfokalen Bild zu sehen ist, erhält diese Technik die Anatomie der gesamten Cochleakoche einschließlich der Spiralganglion-Neurone oder SGNs, wodurch die Analyse von Behandlungseffekten an Neuriten und Somata der SGNs zusätzlich zum Corti-Organ ermöglicht wird. Wie hier gezeigt, können diese Explantate verwendet werden, um simultan die Wirkung einer Behandlung an apikalen und basalen Windungen nach immunfluoreszenzbasierter Färbung zu vergleichen.Haarzellen sind grün dargestellt und neuronale Strukturen erscheinen rot. Intakte Synapsen können durch die Markierung präsynaptischer Proteine in Rot und postsynaptischer Proteine in Grün sowie die Färbung neuronaler Strukturen in Blau beurteilt werden. Diese Abbildung zeigt repräsentative Bilder von apikalen und basalen Cochleaauswüchsen nach sieben Tagen im Kulturmedium entweder mit 3 % FBS (links) oder 1 % FBS (rechts).Zellen, die in 3 % FBS inkubiert werden, beginnen zwischen Tag vier und fünf zu migrieren, wie durch die hellgrauen Pfeile für Haarzellen und die roten Pfeile für Neuriten gezeigt. Explantate in 1 % FBS bewahren ihre organisatorische Integrität bis zum siebten Tag. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, visuell die strukturelle Integrität und Orientierung des Cochleagewebes zu überprüfen, bevor das endgültige Kulturmedium und die Substanzen von Interesse hinzugefügt werden.Nach Durchführung dieses Verfahrens kann eine 3D-Rekonstruktion durchgeführt werden, um die zelltypspezifische Lokalisation von GFP-exprimierenden Zellen innerhalb des Medialis zu bestätigen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Verfahren beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung der murinen Corti-Organ mit oder ohne die Spirale Limbus und Spiralganglions Neuronen. Wir zeigen auch ein Verfahren zur Expression eines exogenen Reporter-Gen in das Corti-Organ Explantat durch Elektroporation.

Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

Die Maus ist eine Innenohr-derived Plakode Sinnesorgan, dessen Entwicklungs-Programm wird während der Schwangerschaft erarbeitet. Wir definieren...

Gentransfer an sich entwickelnden Maus Innenohr<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Elektroporation

Echtzeit-Bildgebung des embryonalen Säugetier Cochlea ist eine Herausforderung, weil die Entwicklungsprozesse bei der Hand arbeiten auf einem zeitlichen Gradienten über zehn Tage. Hier präsentieren wir eine Methode zur Kultivierung und dann Abbilden embryonalen Cochlea Explantatgewebe von einem fluoreszierenden Reporter Maus über fünf Tage.

Langfristige Zeitraffer-Imaging von Maus Cochlear Explantate

Wir stellen eine Methode vor, die die Isolierung und Kultur von Cochlea-Explantaten aus embryonalen Maus-Innenohren beschreibt.  Wir demonstrieren auch eine Methode für den Gentransfer in Cochlea-Explantate mittels Rechteck-Elektroporation. Die In-vitro-Explantatkultur in Verbindung mit der Gentransfertechnik ermöglicht es den Forschern, die Auswirkungen einer Veränderung der Genexpression während der Entwicklung zu untersuchen.

Kultur von embryonalen Maus Cochlear Explantate und Gentransfer durch Elektroporation

Es gibt verschiedene Methoden, um ototoxische Wirkstoffe in die Cochleae von Tiermodellen einzuführen. Vorgestellt wird ein chirurgisches Protokoll zur Verabreichung von ototoxischen Wirkstoffen an die runde Fensternische. Das Verfahren ist zuverlässig, erzeugt gezielte intracochleäre Läsionen und vermeidet mechanische Schäden an der Mikroarchitektur. Eine Untersuchung der Selbstreparatur/Regeneration der Cochlea ist möglich.

Die Maus Round-Fenster-Ansatz für Ototoxische Agent-Lieferung: eine schnelle und zuverlässige Technik zur Induktion Cochlear Zelldegeneration

In dieser Studie beschreiben wir den hinteren Semicircular Kanal-Ansatz als eine zuverlässige Methode für Innenohr-gen Lieferung bei neugeborenen Mäusen. Wir zeigen, dass gen-Lieferung durch den hinteren Semicircular Kanal in der Lage, das gesamte Innenohr durchspülen.

Posterior Semicircular Canal Ansatz für Innenohr-gen Lieferung in Neugeborenen Maus

Tiermodelle der Cochlea-Implantate können Kenntnisse über die technologischen Grundlagen für die Behandlung von permanenten Schallempfindungs-Schwerhörigkeit mit elektrischer Stimulation voraus. Diese Studie bietet eine chirurgische Protokoll für akute ohrenbetäubend und Cochlea-Implantation von Elektroden-Array in Mäusen als auch die funktionale Bewertung mit auditory Brainstem Response.

Cochlea-Implantat-Chirurgie und elektrisch evozierten Auditory Brainstem Response Aufnahmen bei C57BL/6 Mäusen

Dieser Artikel stellt eine modifizierte Cochlea-Oberflächenvorbereitungsmethode vor, die eine Entkalkung und Verwendung eines Zell- und Gewebeklebers erfordert, um die Stücke der Cochlea-Epithel an 10 mm runden Abdeckungsscheinen für die Immunhistochemie bei erwachsenen Mauscochleae zu haften.

Cochlea-Oberflächenvorbereitung in der Erwachsenenmaus

Das Küken ist ein kostengünstiger, zugänglicher und weit verbreiteter Modellorganismus für eine Vielzahl von Studien. Hier wird eine Reihe von Protokollen detailliert beschrieben, um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Entwicklung und Regeneration des Vogelinnenohrs zugrunde liegen.

In Ovo und Ex Ovo Methoden zur Untersuchung der Entwicklung des Vogelinnenohrs

Das aktuelle Protokoll aktualisiert frühere Protokolle und enthält relativ einfache Ansätze für die Kultivierung hochwertiger Cochlea-Explantate. Dies ermöglicht eine zuverlässige Datenerfassung und hochauflösende Bildgebung in lebenden und fixierten Zellen. Dieses Protokoll unterstützt den anhaltenden Trend zur Untersuchung von Innenohrzellen.

Ganze neonatale Cochlea-Explantate als In-vitro-Modell

In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von primären Cochlea-Haarzellen von Mäusen vor. Zunächst wurde das Corti-Organ aus neonatalen (3-5 Tage alten) murinen Cochleae unter dem Mikroskop präpariert. Anschließend wurden die Zellen enzymatisch zu einer Einzelzellsuspension verdaut und nach mehreren Tagen in Kultur mittels Immunfluoreszenz identifiziert.

Isolierung und Kultivierung von primären Cochlea-Haarzellen aus neugeborenen Mäusen

Lernen Sie die Präparation, Kultur und Immunfärbung neonataler muriner Cochlea-Explantate als In-vitro-Screening-Tool für die Hörforschung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Haarzellen, Synapsen und Neuronen.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technik als

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