Neonatal Murine Cochlear Explant Technik als

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Herstellung, Kultur, Behandlung und Immunfärbung neonataler muriner Cochleaauswucherungen, die als in-vitro-Screening-Tool in der Hörforschung verwendet werden sollen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Hörforschung zu beantworten, beispielsweise indem sie die gleichzeitige Untersuchung von Cochleahaarzellen, Synapsen, Neuriten und Neuronen in einem ex-vivo-Modell ermöglicht und Einblicke in die Wirkmechanismen von für die Cochlea neuen Molekülen liefert, einschließlich Faktoren, die in menschlichen Sekreten vorkommen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass der Screening-Prozess für potenzielle therapeutische Substanzen vor deren in-vivo-Testung beschleunigt werden kann.

Beginnen Sie mit einem frisch gesammelten Neugeborenenkopf, der in 70 % Ethanol in der Petrischalenabdeckung aufbewahrt wird. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um einen oberflächlichen Schnitt von der vorderen zur hinteren Seite des Schädels in die Haut einzubringen. Schneiden Sie anschließend beide äußeren Gehörgänge durch und klappen Sie die Haut nach vorne, um die gesamte Schädelkalotte freizulegen.

Öffnen Sie anschließend den Schädel entlang der Sagittalsymphese, indem Sie die Skalpellklinge vorsichtig von anterior nach posterior auf und ab bewegen, um eine Kompression der Cochlea zu vermeiden. Entfernen und entsorgen Sie den Rüssel, indem Sie einen vertikalen Schnitt direkt hinter den Orbitae durchführen. Der hintere Teil des Schädels sollte weiterhin das Gehirn und die Cochlea enthalten.

Verwenden Sie dann 4 Pinzetten, um das Vorderhirn, Kleinhirn und Hirnstamm stumpf zu dissezieren und zu entfernen. Legen Sie die beiden Hälften des Schädels in eine 60 Millimeter große Kunststoff-Petri-Schale, die mit kaltem HBSS gefüllt ist. Verwenden Sie anschließend 4 Pinzetten, um die Cochlea vollständig freizulegen, die neben der umgebenden stapedialen Arterie liegt, und trennen Sie das Organ stumpf vom Schläfenbein.

Übertragen Sie das Cochlea in eine 50 Millimeter durchmessende, durchsichtige Glasboden-Petri-Schale, die HBSS enthält, und stellen Sie die Schale unter das Mikroskop. Stellen Sie die 60 Millimeter durchmessende Kunststoff-Petri-Schale mit der anderen Hälfte des Schädels auf Eis. Entfernen Sie anschließend mit Hilfe von 4 Pinzetten vorsichtig die otische Kapsel des Cochlea.

Verwenden Sie nun ein Mikromesser oder zwei Pinzetten mit einer Kraft von 55, um das Spiralband, das am Corti-Organ befestigt ist, vorsichtig vom Rest der Cochlea und der Medialis zu trennen. Dies kann erreicht werden, indem man das Spiralband am basalsten Abschnitt erfasst und es vorsichtig entlang der apikalen Richtung abwickelt. Nachdem das Spiralband entfernt wurde, positionieren Sie die Probe so, dass eine sagittale Längsansicht der Cochlea erhalten wird.

Schneiden Sie danach die Cochlea mit dem Mikromesser in zwei oder drei Abschnitte und klassifizieren Sie diese als apikale und basale Windungen. Entfernen Sie das überliegende Gewebe des jeweils apikaleren Stückes und das darunterliegende Gewebe des basaleren Stückes bis hin zur eigentlichen Schicht der Haarzellen und Neuriten, damit das Cochlea-Explantat horizontal in der Petrischale liegen kann. Anschließend fassen Sie vorsichtig mit der Pinzette die Tektorialmembran an, eine sehr dünne, durchscheinende Schicht unmittelbar oberhalb des Corti-Organs, und lösen sie vorsichtig ab.

Der technisch anspruchsvollste Schritt ist vermutlich das Entfernen der dünnen, durchscheinenden Deckmembran, da man dabei leicht die darunterliegenden Haarzellen beschädigen kann. Indem man an den Rändern des Gewebes beginnt, bleiben die Haarzellen entlang der gesamten Länge des Explants erhalten, mit Ausnahme des äußersten Randbereichs, an dem das Ablösen der Deckmembran begann. Entfernen Sie abschließend die Membran von Reissner, die unmittelbar oberhalb der Spiralganglioneurone liegt, indem Sie sie mit der Pinzette an beiden Seiten berühren und abziehen.

Die Cochlea-Probe ist nun bereit zur Kultivierung, nachdem beschädigte Bereiche an den Rändern entfernt wurden. Beginnen Sie das Kultivierungsverfahren, indem Sie die Spitze einer Ein-Milliliter-Pipette mit etwa 120 Mikrolitern DMEM benetzen, um zu verhindern, dass das Gewebestück an der Innenseite der Spitze haften bleibt. Verwenden Sie dann die vorbenetzte Spitze, um maximal 70 Mikroliter aus der Petrischale mit Glasboden abzusaugen, und übertragen Sie die Probe zusammen mit der Flüssigkeit auf eines der vier Einlegestücke in der Vier-Vertiefungs-Petrischale.

Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob das Explant in der korrekten Orientierung liegt. Stellen Sie sicher, dass der Bereich der Haarzellen, von dem die Deckmembran entfernt wurde, nach oben weist, und dass die Basilarmembran zusammen mit dem beschnittenen basalen Teil der Medialis nach unten zeigt und an der Deckglas-Einlage haftet. Falls das Präparat bei der Kontrolle verkehrt herum liegt, wie hier gezeigt, geben Sie HBSS von der Pipettenspitze hinzu und positionieren Sie das Stück so lange neu, bis es richtig orientiert ist.

Wenn das Explant korrekt ausgerichtet ist, saugen Sie überschüssiges HBSS ab und warten Sie dann 15 Sekunden. Geben Sie nun 60 Mikroliter warmes Kulturmedium direkt auf die Probe, wobei darauf zu achten ist, die Probe mit der Pipette nicht zu berühren. Setzen Sie die inneren und äußeren Petrischalen-Deckel wieder auf und inkubieren Sie die Probe über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Am nächsten Tag überführen Sie das kochleäre Gewebestück in den Petrischalen aus dem Inkubator in die sterilen Arbeitsbank. Aspirieren Sie das alte Kulturmedium, das kein FBS enthält, aus der Kultur. Geben Sie 60 Mikroliter pro Vertiefung des vorbereiteten warmen Behandlungsmediums hinzu.

Stellen Sie die Petrischale zurück in den Inkubator, bis die Färbung der Kulturen nach maximal sieben Tagen erfolgt. Wie in diesem konfokalen Bild zu sehen ist, erhält diese Technik die Anatomie der gesamten Cochleakoche einschließlich der Spiralganglion-Neurone oder SGNs, wodurch die Analyse von Behandlungseffekten an Neuriten und Somata der SGNs zusätzlich zum Corti-Organ ermöglicht wird. Wie hier gezeigt, können diese Explantate verwendet werden, um simultan die Wirkung einer Behandlung an apikalen und basalen Windungen nach immunfluoreszenzbasierter Färbung zu vergleichen.

Haarzellen sind grün dargestellt und neuronale Strukturen erscheinen rot. Intakte Synapsen können durch die Markierung präsynaptischer Proteine in Rot und postsynaptischer Proteine in Grün sowie die Färbung neuronaler Strukturen in Blau beurteilt werden. Diese Abbildung zeigt repräsentative Bilder von apikalen und basalen Cochleaauswüchsen nach sieben Tagen im Kulturmedium entweder mit 3 % FBS (links) oder 1 % FBS (rechts).

Zellen, die in 3 % FBS inkubiert werden, beginnen zwischen Tag vier und fünf zu migrieren, wie durch die hellgrauen Pfeile für Haarzellen und die roten Pfeile für Neuriten gezeigt. Explantate in 1 % FBS bewahren ihre organisatorische Integrität bis zum siebten Tag. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, visuell die strukturelle Integrität und Orientierung des Cochleagewebes zu überprüfen, bevor das endgültige Kulturmedium und die Substanzen von Interesse hinzugefügt werden.

Nach Durchführung dieses Verfahrens kann eine 3D-Rekonstruktion durchgeführt werden, um die zelltypspezifische Lokalisation von GFP-exprimierenden Zellen innerhalb des Medialis zu bestätigen.