Die Isolierung der Seiten Bevölkerung in Myc-induzierte T-Zell akute lymphatische Leukämie in Zebrabärbling

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Side-Population-Zellen aus einem Zebrafisch-Modell der myc-induzierten T-Zell-akuten lymphoblastischen Leukämie zu isolieren. Der Side-Population-Assay wurde bereits zur Identifizierung von Stamm- und Vorläuferzellpopulationen in zahlreichen normalen und tumorösen Geweben eingesetzt. Bisher wurde er jedoch noch auf kein Zebrafisch-Tumormodell angewandt.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die gezielte Isolierung einer Zellpopulation bei Zebrafisch-T-ALL ermöglicht, die möglicherweise angereichert an Aktivität von Krebsstammzellen ist. Obwohl die hier beschriebene Methode breite Anwendungsmöglichkeiten in der Leukämieforschung am Zebrafisch bietet, könnte sie auch auf andere maligne und nicht-maligne Zelltypen beim Zebrafisch anwendbar sein. Personen, die neu in dieser Methode sind, könnten Schwierigkeiten haben, da die Methode empfindlich gegenüber geringfügigen Änderungen ist.

Auch wenn die Methode unkompliziert erscheint, ist eine Optimierung für jeden verwendeten Zelltyp erforderlich. Bereiten Sie 20 Milliliter einer 10-prozentigen, hitzeinaktivierten FBS-Lösung in 0,9x PBS vor. Geben Sie ein Milliliter der FBS/PBS-Lösung zu einem Vial mit einem Natriumheparin-Salz, das 300 Einheiten des Antikoagulans enthält.

Danach mithilfe eines epifluoreszierenden Mikroskops Fische auswählen, bei denen Tumorzellen 50 Prozent des Körpers infiltriert haben, oder Fische, bei denen Schwierigkeiten beim Fressen oder Schwimmen festgestellt wurden. Das Tier durch Überführen in eine Lösung mit ein bis zwei Milligramm pro Milliliter Tricain in Fischwasser euthanisieren. Zum Bestätigen der Euthanasie Bewegungen der Kiemen und den Herzschlag des Tieres beobachten.

Nachdem der Kopf des Fisches entfernt wurde, 100 Mikroliter Heparinlösung mit einer Pipette in die Körperhöhle injizieren, um überschüssige rote Blutkörperchen zu entfernen. Alle austretenden Flüssigkeiten aufsaugen und in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren. Anschließend die Körperhöhle unter Verwendung frischer Pipettenspitzen zwei weitere Male spülen oder bis die Spüllösung kein Blut mehr enthält, und die bei allen Spülgängen gesammelte Flüssigkeit verwerfen.

Um Leukämiezellen zu sammeln, 100 Mikroliter FBS/PBS-Lösung in den vorgewaschenen Körperhohlraum injizieren. Unter einem Stereomikroskop mit der Pipettenspitze sanften Druck auf den Körper des Fisches ausüben, um die Tumorzellen herauszupressen. Die freigesetzte Flüssigkeit in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auffangen.

Wiederholen Sie die Isolierung, bis die meisten Tumorzellen gewonnen wurden. Sammeln Sie alle Zellen in dem gleichen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und bewahren Sie die erhaltene Suspension bei Raumtemperatur auf. Anschließend mischen Sie die isolierten Tumorzellen vorsichtig durch Pipettieren, um Zellklumpen aufzulösen.

Filtrieren Sie die Zellsuspension durch einen 40-Mikrometer-Mesh-Filter und waschen Sie den Filter ein- bis zweimal mit je 100 Mikrolitern FBS/PBS. Nach dem Filtrieren bewahren Sie die Zellen bei Raumtemperatur auf.

Schließlich werden in einem neuen Gefäß zwei Mikroliter der Zellsuspension mit 18 Mikrolitern einer 0,04-prozentigen sterilen Trypanblau-Lösung gemischt. Zehn Mikroliter der erhaltenen Suspension werden auf ein Hämozytometer aufgetragen, und die lebensfähigen fluoreszierenden Tumorzellen werden gezählt. Es ist wichtig, eine saubere Probe von T-ALL-Zellen zu gewinnen.

Die hier verwendete Konzentration von Hoechst 33342 basiert auf der Anzahl der gesammelten lebenden Tumorzellen. Zusätzliches zelluläres Material oder Nicht-Tumorzellen können die Analyse stören. Vor der Zellfärbung Hoechst-Farbstoff in nukleasefreiem Wasser verdünnen, um eine Arbeitslösung von einem Milligramm pro Milliliter zu erhalten.

Die zubereitete Lösung abgedeckt mit Aluminiumfolie bei vier Grad Celsius lagern. Anschließend 49,1 Milligramm Verapamil in einem Milliliter DMSO lösen, um eine 100-Mikromolar-Inhibitorenlösung zu erhalten. Danach die Probe herstellen, indem FBS/PBS, 2,5 Mikroliter DMSO, 15 Mikroliter einer einen Milligramm pro Milliliter betragenden Hoechst-Färbelösung und 106 Tumorzellen in ein FACS-Röhrchen gegeben werden, sodass ein Endvolumen von einem Milliliter erreicht wird.

Zur Herstellung der Kontrolle FBS/PBS, 2,5 Mikroliter einer 100 Millionen molaren Verapamil-Lösung und 15 Mikroliter eines Hoechst-Farbstoffs mit einer Konzentration von 1 Milligramm pro Milliliter hinzufügen und auf 106 Tumorzellen eine Endvolumina von einem Milliliter einstellen. Die Probe und die Kontrolle 120 Minuten im Dunkeln in einem 28 Grad Celsius warmen Wasserbad inkubieren. Nach der Inkubation die Zellen unverzüglich auf Eis stellen und im Dunkeln aufbewahren.

Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 × g und 4 °C für sechs Minuten. Anschließend entfernen Sie den Überstand und waschen die Zellen mit einem Milliliter FBS/PBS. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut bei 300 × g und 4 °C für sechs Minuten.

Nachdem die Zellen pelletiert sind, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen in einem Milliliter FBS/PBS. Bewahren Sie die Proben bei vier Grad Celsius auf, bis zur Zellsortierung. Fügen Sie 15 Minuten vor der Zellsortierung je ein Milliliter Zellsuspension zwei Mikroliter einer Propidiumiodid-Stammlösung mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter hinzu.

Anschließend die Proben gründlich vortexen. Analysieren Sie die angefärbten Zellsuspensionen von Zebrafisch-T-ALL-Zellen mithilfe eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierers. Erregen Sie die Proben mit einem UV-Laser zur Analyse des Hoechst-Farbstoffs und mit einem 488 Nanometer Laser zur Detektion von Propidiumiodid- oder GFP-positiven T-ALL-Zellen.

Die Anzahl der Zellen, die Farbstoffkonzentration, die Inkubationstemperatur und die Inkubationsdauer müssen möglicherweise für jeden verwendeten Zelltyp optimiert werden. Änderungen an diesen Bedingungen können die Ergebnisse des Assays erheblich verändern. Um die Side-Population unter aus Zebrafischen isolierten T-ALL-Zellen zu identifizieren, werden zunächst zellulärer Debris und Zellklumpen ausgeschlossen.

Die Aufnahme von Propidiumiodid und die GFP-Expression in einer einzelnen Zellpopulation werden anschließend analysiert, um lebende Tumorzellen zu identifizieren. Zur Visualisierung der Side-Population werden anschließend die blaue und rote Emission des Hoechst-Farbstoffs verglichen. Die Side-Population erscheint als schwacher Zellenschwanz, der sich von der linken Seite der Hauptzellpopulation in Richtung der blauen Fluoreszenzachse erstreckt.

Hier werden Ergebnisse der Side-Population-Analyse für zwei verschiedene Tumor-Zellproben vorgestellt. Eine Side Population wurde in beiden Proben identifiziert. Allerdings enthielten unterschiedliche Tumorproben jeweils unterschiedliche Zahlen an Side-Population-Zellen.

Unabhängig von der analysierten Tumorprobe führte die Behandlung der Probe mit dem Effluxinhibitor Verapamil zum Verschwinden des Signals, das für die zuvor identifizierten Zellen beobachtet wurde, wodurch das Side-Population-Phänotyp weiter bestätigt wurde. Wenn die Methode einmal beherrscht ist, kann die Side-Population-Technik an einem Zebrafisch-T-ALL in weniger als vier Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß und wie hier dargestellt durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die für den Zebrafisch-T-ALL optimierten Schritte wie Inkubationstemperatur und -dauer, Farbstoffkonzentration und Effluxinhibitor zu beachten.

Diese müssen möglicherweise für unterschiedliche experimentelle Systeme angepasst werden. Nach diesem Verfahren können andere Methoden, wie die RNA-Isolierung oder In-vivo-Transplantationsassays, mit sortierten Side-Population-Zellen durchgeführt werden, um Fragen zur Funktionalität und Genregulation der Side-Population-Zellen zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Side Population von Zellen aus einem T-Zell-akuten lymphoblastischen Leukämie-Modell des Zebrafisches isoliert.