Die Isolierung der Seiten Bevölkerung in Myc-induzierte T-Zell akute lymphatische Leukämie in Zebrabärbling

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Zellen der Seitenpopulation aus einem Zebrafischmodell der myc-induzierten akuten lymmphoblastischen T-Zell-Leukämie zu isolieren. Der Seitenpopulationsassay wurde zur Identifizierung von Stamm- und Vorläuferzellpopulationen in vielen Normal- und Krebsgeweben verwendet. Aber es wurde noch nicht auf Zebrafisch-Krebsmodelle angewendet.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die prospektive Isolierung einer Population von Zellen in Zebrafisch-T-ALL ermöglicht, die für die Aktivität von Krebsstammzellen angereichert werden können. Obwohl die hier beschriebene Methode breite Anwendungen in der Zebrafisch-Leukämieforschung hat, kann sie auch auf andere bösartige und nicht-maligne Zebrafischzelltypen anwendbar sein. Personen, die neu in dieser Methode sind, können Schwierigkeiten haben, da die Methode empfindlich auf subtile Veränderungen reagiert.

Auch wenn die Methode einfach erscheint, ist für jeden getesteten Zelltyp eine Optimierung erforderlich. Bereiten Sie 20 Milliliter 10 Prozent hitzeinaktiviertes FBS in 0,9x PBS vor. Geben Sie einen Milliliter der FBS/PBS-Lösung in eine Durchstechflasche mit einem Heparin-Natriumsalz, das 300 Einheiten des Antikoagulans enthält.

Wählen Sie dann mit einem Epifluoreszenzmikroskop Fische aus, bei denen Tumorzellen in 50 Prozent des Körpers eingedrungen sind, oder Fische, bei denen festgestellt wurde, dass sie Schwierigkeiten beim Fressen oder Schwimmen haben. Euthanasieren Sie den Fisch, indem Sie ihn in eine Lösung von ein bis zwei Milligramm pro Milliliter Tricain in Fischwasser überführen. Beobachten Sie das Tier auf Kiemenbewegungen und Herzschlag, um die Euthanasie zu bestätigen.

Nachdem Sie den Kopf des Fisches entfernt haben, injizieren Sie mit einer Pipette 100 Mikroliter Heparinlösung in seine Körperhöhle, um überschüssige rote Blutkörperchen zu entfernen. Saugen Sie die gesamte austretende Flüssigkeit ab und pipettieren Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Waschen Sie dann die Körperhöhle mit frischen Pipettenspitzen noch zwei Mal oder bis die Waschlösung kein Blut mehr enthält, und entsorgen Sie die bei allen Wäschen gesammelte Flüssigkeit.

Um Leukämiezellen zu sammeln, injizieren Sie 100 Mikroliter FBS/PBS-Lösung in die vorgewaschene Körperhöhle. Unter einem Präpariermikroskop üben Sie mit einer Pipettenspitze leichten Druck auf den Körper des Fisches aus, um die Tumorzellen herauszudrücken. Sammeln Sie die freigesetzte Flüssigkeit in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Wiederholen Sie die Isolierung, bis die meisten Tumorzellen entnommen sind. Sammeln Sie alle Zellen im selben 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und bewahren Sie die erhaltene Suspension bei Raumtemperatur auf. Mischen Sie dann die isolierten Tumorzellen durch vorsichtiges Pipettieren, um Zellklumpen zu dissoziieren.

Filtern Sie die Zellsuspension durch einen 40-Mikrometer-Maschenfilter. Und waschen Sie den Filter ein- bis zweimal mit 100 Mikrolitern FBS/PBS. Bewahren Sie die Zellen nach dem Filtern bei Raumtemperatur auf.

Mischen Sie schließlich in einem neuen Röhrchen zwei Mikroliter der Zellsuspension mit 18 Mikrolitern 0,04-prozentiger steriler Trypanblau-Lösung. Laden Sie 10 Mikroliter der erhaltenen Suspension auf ein Hämozytometer und zählen Sie die lebensfähigen fluoreszierenden Tumorzellen. Es ist wichtig, eine saubere Probe von T-ALL-Zellen zu entnehmen.

Die Konzentration von Hoechst, drei, drei, drei, vier, zwei, die hier verwendet wird, basiert auf der Anzahl der entnommenen lebenden Tumorzellen. Zusätzliche Zelltrümmer oder Nicht-Tumorzellen können den Assay beeinträchtigen. Vor der Zellfärbung den Hoechst-Farbstoff in einem nukleasefreien Wasser verdünnen, um ein Milligramm pro Milliliter Arbeitslösung zu erhalten.

Lagern Sie die vorbereitete Lösung abgedeckt mit Alufolie bei vier Grad Celsius. Löse dann 49,1 Milligramm Verapamil in einem Milliliter DMSO auf, um eine 100-Mikromolar-Inhibitorlösung zu erhalten. Als nächstes bereiten Sie die Probe vor, indem Sie FBS/PBS, 2,5 Mikroliter DMSO, 15 Mikroliter eines Milligramms pro Milliliter Hoechst-Farbstoff und 10 zu den sechs Tumorzellen in ein Faxrohr mit einem Endvolumen von einem Milliliter geben.

Zur Vorbereitung der Kontrolle werden durch Zugabe von FBS/PBS 2,5 Mikroliter 100 Millionen molare Verapamil und 15 Mikroliter eines Milligramms pro Milliliter Hoechst-Farbstoff zu den sechs Tumorzellen mit einem Endvolumen von einem Milliliter 10 hinzugefügt. Inkubieren Sie die Probe und die Kontrolle in einem 28 Grad Celsius warmen Wasserbad im Dunkeln für 120 Minuten. Legen Sie die Zellen nach der Inkubation sofort auf Eis und bewahren Sie sie im Dunkeln auf.

Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 mal G vier Grad Celsius für sechs Minuten. Entfernen Sie dann die Supernatintierung und waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter FBS/PBS. Drehen Sie die Zellen noch einmal sechs Minuten lang bei 300 mal G vier Grad Celsius.

Sobald die Zellen pelletiert sind, entfernen Sie das Supernativ und suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter FBS/PBS erneut. Bewahren Sie die Proben bis zur Zellsortierung bei vier Grad Celsius auf. 15 Minuten vor der Zellsortierung zwei Mikroliter eines Milligramms pro Milliliter Propidiumjod-Stammlösung pro Milliliter der Zellsuspension hinzufügen.

Werfen Sie dann die Proben gut in die Strudel. Analysieren Sie die gefärbten Zebrafisch-T-ALL-Zellsuspensionen mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer. Anregung von Proben mit einem UV-Laser für die Hoechst-Farbstoffanalyse und einem 488-Nanometer-Laser für den Nachweis von Propidiumiodid oder GFP-positiven T-ALL-Zellen.

Die Anzahl der Zellen, die Konzentration des Farbstoffs, die Inkubationstemperatur und die Inkubationsdauer müssen möglicherweise für jeden verwendeten Zelltyp optimiert werden. Und Änderungen an jeder dieser Bedingungen können die Ergebnisse des Assays drastisch verändern. Um die Seitenpopulation unter den aus dem Zebrafisch isolierten T-ALL-Zellen zu identifizieren, werden zunächst zelluläre Trümmer und Zellklumpen ausgeschlossen.

Die Aufnahme von Propidiumiodid und die GFP-Expression in einer einzelnen Zellpopulation werden dann analysiert, um lebende Tumorzellen zu identifizieren. Um die Seitenpopulation zu visualisieren, werden dann die blauen und roten Emissionen des Hoechst-Farbstoffs verglichen. Die Seitenpopulation erscheint als dunkler Schwanz von Zellen, der sich von der linken Seite der Hauptzellpopulation in Richtung der blauen Fluoreszenzachse erstreckt.

Im Folgenden werden die Ergebnisse der Nebenpopulationsanalyse vorgestellt, die für zwei verschiedene Tumorzellproben durchgeführt wurde. In beiden Exemplaren wurde eine Nebenpopulation identifiziert. Verschiedene Tumorproben enthielten jedoch eine unterschiedliche Anzahl der Zellen der Seitenpopulation.

Unabhängig von der analysierten Tumorprobe führte die Behandlung der Probe mit einem Effluxhemmer von Verapamil zum Verschwinden des Signals, das für die zuvor identifizierten Zellen beobachtet wurde, was den Phänotyp der Seitenpopulation weiter bestätigt. Einmal gemeistert, kann die Seitenpopulationstechnik an einem Zebrafisch-T-ALL in weniger als vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird und wie wir es hier vorgestellt haben. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, sich an die Schritte zu erinnern, die für Zebrafisch-T-ALL optimiert wurden, wie z. B. Inkubationstemperatur und -zeit, Farbstoffkonzentration und Ausflusshemmer.

Diese müssen möglicherweise für verschiedene experimentelle Systeme geändert werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. die RNA-Isolierung oder in vivo Transplantationsassays, mit sortierten Zellen der Seitenpopulation durchgeführt werden, um Fragen zur Funktionalität und Genregulation der Zellen der Seitenpopulation zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Seitenpopulation von Zellen aus akuter lymphatischer Leukämie mit Zebrafisch-T-Zellen isolieren können.