Name: Dissektion und Kultur der Maus Embryonale Niere (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Kultur metanephroner Anlagen aus Maus-Embryonen für die Nierenorganogenese. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Ureterknospenverzweigungen und angeborenen Fehlbildungen.

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Die Autoren danken Leif Oxburgh und Derek Adams für ihre Kenntnisse, Leif Oxburgh für die hilfreichen Kommentare zum Manuskript und Stefan Wölfl und Ulrike Müller für ihre technische Unterstützung und Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer und Viola Mayer für die Hilfe in der Labor. Diese Arbeit wurde von der Entwicklung, der Gesellschaft der Biologen (nach CP) unterstützt .

Die Mäuse wurden nach den schwedischen Vorschriften und den Rechtsvorschriften der Europäischen Union (2010/63 / EU) aufrechterhalten. Alle Verfahren wurden nach den Richtlinien des schwedischen Ethikausschusses durchgeführt (Genehmigungen C79 / 9, C248 / 11 und C135 / 14). Die Verfahren an der Universität Heidelberg mit Tierfächern wurden vom Regierungspräsidium Karlsruhe und den Tierschutzbeauftragten an der Universität Heidelberg genehmigt. 1. Vorbereitung von Reagenzien und Materialien für Kultur HINWEIS: Verwenden Sie eine laminare Strömungshaube, um die Kontamination zu minimieren. <ol><li> Am Tag der Sezierung wurde das menschliche Fc allein oder rekombinantes chimäres Ephrinprotein, das mit menschlichem Fc fusioniert ist, durch Mischen mit anti-humanen Fc-Ziegen-Antikörpern in einem Molverhältnis von 1: 5 in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hergestellt. 1 Stunde bei 37 ° C inkubieren 5 . </li><li> Bereiten Sie das Kulturmedium vor, indem Sie Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient ergänzenMischung F-12 (DMEM / F12) mit 1% Penicillin / Streptomycin (v / v), 1% Glutamin (v / v), 1% Insulin-Transferrin-Selen (v / v), 50 μg / ml menschliches Holo- Transferrin und 1,5 μg / ml Amphotericin. HINWEIS: 10 ml Medium reicht für 16 Embryonen aus. </li><li> Fügen Sie gruppierte rekombinante Ephrinlösung in einer Endkonzentration von 20 μg / ml zum Kulturmedium hinzu. Verwenden Sie Clustered Human Fc als Kontrolle. </li><li> Bereiten Sie Kulturplatten vor, indem Sie 500 &amp; mgr; l Kulturmedium zu jeder Vertiefung einer sterilen, unbeschichteten, flachen Boden-Polystyrol-4-Well-Platte hinzufügen. </li><li> Mit sterilen Pinzetten sorgfältig einen Polycarbonat-Membranfilter mit einer Porengröße von 5 μm pro Well auf das Medium legen. Übertragen Sie die vorbereitete Platte in den Inkubator (37 ° C / 5% CO 2 ). Stellen Sie sicher, dass der Filter auf der Oberseite trocken bleibt und schwimmt. HINWEIS: Ein Filter reicht für zwei Nierenanlagen aus. </li><li> Mit einer Rasierklinge schneiden Sie ca. 30 Pipettenspitzen (Volumen: 100 μl) approximatelY 1 mm von der Spitze, um zu einer breiteren Öffnung zu führen. Legen Sie die Spitzen wieder in ein Pipetten-Tip-Rack. </li></ol> 2. Dissektion von metanephrischen Rudimente bei E11.5 <ol><li> Opfer eine zeitlich-schwangere Maus bei E11.5 durch zervikale Versetzung (oder mit einer Methode, die von der lokalen Ethik-Ausschuss genehmigt). </li><li> Entfernen Sie den Uterus und die Embryonen, wie von Brown et al. 6 beschrieben. Von diesem Punkt aus, arbeiten Sie unter einem Sektionsmikroskop. </li><li> Mit der Nr. 5 Uhrmacherzange, schneide den Embryo direkt unter die Vorderbeine. Verwenden Sie für jeden Embryo eine frische Petrischale. Entfernen Sie die Beine und den Schwanz des Embryos. Um dies zu tun, greifen Sie das Gewebe mit einem Paar von Nr. 5 Uhrmacher Pinzette entfernt werden und verwenden Sie die Spitzen eines zweiten Paares zu schneiden. </li><li> Um die ventrale Organmasse zu entfernen, benutze die Spitzen einer Pinzette, um die Körperwand des Embryos in einer rostral-to-caudalen Richtung zu öffnen. <ol><li> Schnitt oberflächlich, parallel zu tEr dorsale aorta Verwenden Sie die Blut-gefüllte und daher sichtbare dorsale Aorta zur Orientierung. Sorgfältig trennen Sie den ventralen Teil der Körperwand von der dorsalen Teil mit den Spitzen der geschlossenen Pinzette und drehen Sie den Embryo über. Schneiden Sie die Körperwand seitlich in einer rostralen bis kaudalen Richtung und verwenden Sie die dorsale Aorta zur Orientierung, wie für die vorherige Seite. </li></ol></li><li> Sobald die ventrale Körperwand vom dorsalen Körper getrennt ist, packt sie mit einer Pinzette und zieht sie sorgfältig zusammen, um sie zusammen mit der Orgelmasse zu entfernen. HINWEIS: Die metanephrischen Anlagen bleiben gewöhnlich an der dorsalen Körperwand befestigt. Sie sind ovale, 200 μm lange Strukturen, die sich auf der Höhe der Hinterbeine befinden. </li><li> Halten Sie die dorsale Körperwand mit einer Pinzette, mit der ventralen Seite nach oben. Mit dem anderen Paar Pinzette, greifen die dorsale Aorta an seinem rostralen Ende und sorgfältig schälen die dorsale Aorta aus der dorsalen Körperwand. ANMERKUNG: Beide metanephrischen Nieren bleiben in der Regel angebrachtAuf die dorsale aorta </li><li> Mit einem Paar Pinzette, schneiden rostral auf die Niere anlagen, um die Aorta zu entfernen. Dann trennen Sie sorgfältig die beiden Niere anlagen mit den Spitzen der Pinzette. </li><li> Vorsichtig vor unerwünschtes Gewebe aus der Niere anlagen mit den Spitzen der Pinzette abziehen. Achten Sie darauf, das Mesenchym nicht zu beschädigen, da Schäden zu einem schlechten Wachstum und Ausschluss des Explantats aus einer weiteren Analyse führen können. </li><li> Übertragen Sie die Niere anlagen separat mit einer Mikroliterpipette und einer weit geöffneten Pipettenspitze in 10 μl PBS zum Polycarbonat-Membranfilter in einer 4-Well-Platte. HINWEIS: Durch die Oberflächenspannung wird das Explantat mit einer dünnen Schicht von Medium bedeckt. Ein Filter reicht für zwei Nierenanlagen aus. <ol><li> Legen Sie jedes der beiden Nieren-Anlagen in die Mitte jeder jeweiligen Hälfte des Filters. Übertragen Sie die Platte wieder auf den Inkubator bei 37 ° C / 5% CO 2 . Verlasse den Teller im Inkubator bis zum metanephrischen RudIments aus dem nächsten Embryo sind bereit, auf den Filter gelegt zu werden. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.3-2.9.1 für jeden Embryo. ANMERKUNG: Bei einigen Übungen dauert das Dissektionsverfahren etwa 5 min pro Embryo. </li><li> Inkubation der Niere anlagen für 3 Tage bei 37 ° C / 5% CO 2 . </li></ol> 3. Vorbereitung der Reagenzien zur Fixierung und Färbung <ol><li> Zur Herstellung von 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS ohne Calcium und Magnesium (w / v), löst man die PFA bei 60 ° C in PBS, kontinuierlich rühren. Auf Raumtemperatur abkühlen und mit einem Papierfilter die restlichen Partikel entfernen. Aliquot und bei 4 ° C zur sofortigen Anwendung aufbewahren oder zur Langzeitlagerung einfrieren. ACHTUNG: PFA ist giftig. Tragen Sie die persönliche Schutzausrüstung, die in den örtlichen Sicherheitsnormen angegeben ist, und arbeiten Sie in einer Abzugshaube. Verwerfung von Abfällen nach institutionellen Richtlinien und Verwendung von Abfallbehältern. </li><li> Zur Vorbereitung der Permeabilisierungslösung verdünnen Sie Triton X-100In PBS ohne Kalzium und Magnesium bis 0,3% (v / v). </li><li> Zur Herstellung der Blockierungslösung 5% (v / v) Ziegenserum und 0,1% Triton X-100 zu PBS ohne Calcium und Magnesium zugeben. Füge Natriumazid zu einer Endkonzentration von 0,02% (w / v) hinzu. Bei 4 ° C aufbewahren. ACHTUNG: Natriumazid ist giftig. Behandeln Sie Natriumazid gemäß den örtlichen Sicherheits- und Umweltschutzbestimmungen. HINWEIS: Bei der Verwendung von Antikörpern für die Färbung, verwenden Sie 5% Serum aus der Spezies der sekundäre Antikörper wurde abgeleitet, um Sperrlösung zu machen. </li><li> Verdünnen Sie biotinyliertes Dolichorus biflorus Agglutinin 1: 200 in Blockierungslösung. Verdünnen Sie Alexa488-konjugiertes Streptavidin 1: 200 in Blockierungslösung. </li><li> Zur Herstellung von gebrauchsfertigem Einbettungsmedium (siehe Tabelle der Materialien) werden 0,1 g wasserlösliches Polyvinylalkohol-basiertes Mukoadhäsiv / ml bis 25% (w / v) Glycerin in 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5) . Unter ständigem Rühren für 1 h auf 50 ° C erhitzen, abkühlen lassen und den pH-Wert auf 8,0-8,5 einstellenM NaOH. Vermeiden Sie höhere NaOH-Konzentrationen. Füge 100 μg / ml N-Propylgallat und Thimerosal zu einer Endkonzentration von 0,02% (w / v) hinzu. 30 min bei Raumtemperatur umrühren. ACHTUNG: Thimerosal ist giftig. Behandeln Sie es gemäß den örtlichen Sicherheits- und Umweltschutzbestimmungen. <ol><li> Füllen Sie das Einbettungsmedium in 50 ml Röhrchen, balancieren Sie den Rotor und zentrifugieren Sie bei 3.200 xg und Raumtemperatur für 10 min. Die klare Lösung in 15 ml Röhrchen dekantieren und das Pellet entsorgen. Aliquot und bei -20 ° C für mehrere Wochen aufbewahren. Einmal aufgetaut, halten Sie die Lösung bei 4 ° C. Warm bis ~ 30 ° C sofort vor Gebrauch. </li></ol></li><li> Bereiten Sie so viele Glasrutschen vor, wie Filter mit Explantaten montiert werden sollen. Dazu kleben Sie zwei kleine Deckgläser, 18 x 18 mm, auf beiden Seiten des Glasschiebers mit Instant-Klebstoff, lassen Sie einen Durchmesser von 15 mm für den Filter dazwischen. </li></ol> 4. Fixierung und Färbung <ol><li> Nach einer Kultivierungszeit von 3Tage in vitro (div), entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und sorgfältig aspirieren das Kulturmedium aus jeder Vertiefung mit einer Mikropipette. Achten Sie darauf, den Filter nicht zu berühren und halten Sie die Spitze in Richtung der Wand des Brunnens. </li><li> Fügen Sie 500 μl 4% PFA / PBS zu jeder Vertiefung hinzu. Die Filter schweben auf dem Fixiermittel. Verwenden Sie eine Mikropipette, fügen Sie vorsichtig das PFA-Fixiermittel hinzu, um die Filter zu tauchen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min. HINWEIS: Für alle folgenden Schritte ist darauf zu achten, dass die Explantate nicht aus dem Filter abgewaschen werden. Halten Sie das Öffnen der Pipettenspitze zur Wand des Brunnens. </li><li> Entfernen Sie die PFA und spülen Sie zweimal mit 500 μl PBS, tauchen Sie den Filter ein. Füge 500 μl Permeabilisierungslösung zu jeder Vertiefung hinzu und inkubiere bei Raumtemperatur für 1 h. </li><li> Spülen Sie zweimal mit 500 &amp; mgr; l PBS und fügen Sie 500 &amp; mgr; l Blockierungslösung zu jeder Vertiefung hinzu. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 h. </li><li> Ersetzen Sie die Sperrlösung durch250 μl biotinyliertes Dolichorus biflorus Agglutinin verdünnt 1: 200 in Blockierungslösung und inkubieren bei 4 ° C für 24 h. </li><li> Die Dolichorus biflorus Agglutininlösung entfernen und zweimal mit 500 μl PBS pro Vertiefung ausspülen. </li><li> Füge 250 μl Alexa488-konjugiertes Streptavidin hinzu, verdünnt 1: 200 in Blockierungslösung und inkubiere bei 4 ° C für 24 h. Alternativ bei Raumtemperatur für 2 h inkubieren. HINWEIS: Ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis wird erreicht, wenn es bei 4 ° C inkubiert wird. </li><li> Spülen Sie zweimal mit 500 μl PBS pro Vertiefung. Mit Pinzette, die Filter auf die vorbereiteten Glasrutschen übertragen, mit den Explantaten nach oben. Montage mit ~ 50-100 μl Einbettmedium. Deckel mit 60 mm langen Nr. 1,5 Deckgläschen. Man läßt die Einbettmediumlösung 2 h bei Raumtemperatur im Dunkeln erstarren. Gehen Sie zum Abbilden oder lagern Sie die Folien, in Folie verpackt, bei 4 ° C bis zum Bild. </li><li> Bild mit einem Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskop 7 &lt;/ Sup&gt; gekoppelt an eine Hg-Lampe und verwenden eine Spiegeleinheit für die blaue Anregung (Anregungsbandpass, 460 - 495 nm, dichromatischer Spiegel, 505 nm und Emissionsbandpass, 510 - 550 nm) und 20X Plan-Apochromat-Linsen, 0,75 numerisch Öffnung. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode, um das sich entwickelnde metanephrische Anlagen aus dem Maus-Embryo zu isolieren und die Orgel-Rudimente zu kultivieren. Diese Methode ist eine Standardtechnik, wie sie von Grobstein 8 und Saxén 9 , 10 entwickelt wurde und von vielen anderen 11 , 12 angepasst und modifiziert wurde. Der Erfolg der Methode hängt hauptsächlich von der Dauer ...

Die Säugetierniere stammt von zwei primordialen Strukturen mesodermalen Ursprungs ab: der röhrenförmigen epithelialen Harnleiterknospe und dem metanephrischen Mesenchym. Während der Nephrogenese dringt die Harnleiterknospe in das metanephrische Mesenchym ein und verzweigt sich, um das Sammelsystem zu bilden. Aus dem metanephrischen Mesenchym entstehen die epithelialen Elemente der Nephrone. Diese Prozesse laufen zeitlich und räumlich abgestimmt ab und werden durch reziproke induktive Mechanismen in Gang gesetzt. Beide Gewebekomponenten kommunizieren und beeinflussen die Zellmorphogenese des jeweils anderen. 
In den 1920er Jahren war es Boyden, der die in vivo Obstruktion des Ductus mesonephricus bei Hühnern durchführte und damit den ersten Hinweis auf induktive Wechselwirkungen lieferte, da getrennte nephrische Blasteme nicht differenzieren konnten1. Etwa zur gleichen Zeit wurden die ersten erfolgreichen Versuche veröffentlicht, nephrische Rudimente von Hühnern in einem hängenden Tropfen zu kultivieren. Anschließend wurde die Organkultur entwickelt, um Gewebeinteraktionen bei der Organogenese von Säugetieren zu untersuchen. In den 1950er Jahren entwickelte Grobstein eine Technik, mit der metanephrische Rudimente auf einem Filter kultiviert werden konnten. Diese Technik wurde von Saxén modifiziert, indem er den Filter auf einem Trowell-artigen Sieb in einer Kulturschale platzierte1. Im Laufe der Jahre sind viele Modifikationen und Anwendungen für die Organkultur entstanden. Die hier beschriebene Methode basiert auf der Saxén-Technik, ist aber vereinfacht, da die Filter frei auf dem Medium schwimmen und der Durchmesser der Kulturvertiefung den Durchmesser des Filters nur geringfügig übersteigt, wodurch unerwünschte Bewegungen des Filters begrenzt werden.
Ganzorgankultur ist ein klassisches, billiges und einfaches, aber leistungsfähiges Werkzeug, um zelluläre Prozesse und interzelluläre Kommunikation während der Organogenese zu untersuchen. Die Organkultur ermöglicht die Behandlung mit biologischen Wirkstoffen wie Wachstumsfaktoren, Antikörpern, Antisense-Oligonukleotiden, Viren und Peptiden sowie mit pharmazeutischen Verbindungen und anderen Chemikalien. Die Genfunktion kann auch unter Verwendung von Explantaten untersucht werden, die von genetisch veränderten Mäusen stammen, oder unter Verwendung einer induzierbaren Geninaktivierungstechnologie, wie z. B. dem Cre-loxP-System. Dies ermöglicht die Untersuchung genetischer Mutationen, die vor der Entwicklung der Niere eine embryonale Letalität verursachen. Organkulturen können auch mit Fluoreszenzmarkierungen für die Rückverfolgung von Genfunktionen oder Abstammungslinien und modernen bildgebenden Verfahren kombiniert werden, die eine Echtzeitüberwachung des Zellverhaltens ermöglichen2.
In dem hier bereitgestellten speziellen Beispiel wurde die Wirkung des EphrinB2-aktivierten Eph-Rezeptor-Signalwegs auf die Verzweigungsmorphologie der Harnleiterknospe untersucht. Die Morphologie der EphA4/EphB2-Doppel-Knockout-Mäuse deutete auf mehrere schwere Defekte in der Nierenentwicklung hin, die bereits am embryonalen Tag 11 (E11) nachweisbar waren und die Harnleiterknospe, den Harnleiter und den Ductus nephricus communis betrafen3. Die Signalübertragung über Eph-Rezeptoren erfordert die Clusterbildung des Liganden-Rezeptors dimer4. Um den Eph-Signalweg zu überaktivieren, wurden die Nierenrudimente von E11.5-Mausembryonen in Gegenwart von geclustertem rekombinantem EphrinB2-Fc kultiviert. EphrinB2 ist ein bekannter Ligand für den EphA4-Rezeptor, der in den Harnleiterknospen tips3 exprimiert wird.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 35050061</td> DPBS, <td></td></tr><tr><td>Calcium,</td><td>Magnesium Thermo Fisher Scientific</td><td>14040117</td><td>Verwendung zur Dissektion</td></tr><tr><td>Holo-Transferrin human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0665</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selen (ITS-G) (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400045</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Thiomersal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5125</td><td></td></tr><tr><td>Propylgallat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2370</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyliertes Dolichorus biflorus Agglutinin</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1035</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 konjugiertes Streptavidin</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>016-540-084</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes Maus-Ephrin-B2 Fc-Chimären-Protein, CF</td><td>R& D Systems</td><td>496-EB</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes IgG1 Fc, CF</td><td>R& D Systems</td><td>110-HG-100</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Human-IgG Fc Antikörper</td><td>R& T D Systems</td><td>G-102-C</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalztabletten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>zur Fixierung und Immunfärbung</td></tr><tr><td>Dumont #5, biologie Spitzen, INOX, 11 cm</td><td>agnthos.se</td><td>0208-5-PS</td><td>2 Paar Pinzetten werden benötigt</td></tr><tr><td>Irisschere, gerade, 12 cm</td><td>agnthos.se</td><td>03-320-120</td><td></td></tr><tr><td>Verbandzange, gerade, zart, 13 cm</td><td>agnthos.se</td><td>08-032-130</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen Nunclo Delta behandelt</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150679</td><td></td></tr><tr><td>TMTP01300 Isoporen-Membranfilter, Polycarbonat, hydrophil, 5.0 & Mikro; m, 13 mm, weiß, blank</td><td>MerckMillipore</td><td>TMTP01300</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Multidish 4 Vertiefungen, flacher Boden</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6789-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas 24 x 50 mm dick. Nr.1.5H 0.17+/-0.005 mm</td><td>nordicbiolabs</td><td>107222</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser Nr.1.5, 18 mm x 18 mm</td><td>nordicbiolabs</td><td>102032</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger ~76 x 26 x 1, 1/2-w. geschliffen glatt</td><td>nordicbiolabs</td><td>1030418</td><td></td></tr><tr><td>VWR Rasierklingen</td><td>VWR</td><td>55411-055</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430055</td><td></td></tr><tr><td>Whatman vorgefaltetes qualitatives Filterpapier, Güteklasse 113V, kreppiertes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1213125</td><td></td></tr><tr><td>Festtisch-Forschungsmikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>Schwarz 6 Inzuchtmäuse, männlich, C57BL/6NTac</td><td>Taconic</td><td>B6-M</td><td></td></tr><tr><td>Schwarz 6 Inzuchtmäuse, weiblich, C57BL/6NTac</td><td>Taconic</td><td>B6-F</td><td></td></tr><tr><td>Greenough Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>Leica S6 E</td><td></td></tr></tbody></table>

dissektion und kultur der maus embryonale niere

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Methode für die Sektion, Isolierung und Kultur der Maus metanephrischen Rudimente zu beschreiben. Während der Säugetier-Nieren-Entwicklung, die beiden Vorläufer-Gewebe, die ureterische Knospe und das metanephrische Mesenchym, kommunizieren und wechselseitig zelluläre Mechanismen induzieren, um schließlich das Sammelsystem und die Nephrone der Niere zu bilden. Da Säugetier-Embryonen intrauterin wachsen und daher für den Beobachter unzugänglich sind, wurde eine Orgelkultur entwickelt. Mit dieser Methode ist es möglich, epithelial-mesenchymale Wechselwirkungen und zelluläres Verhalten während der Nierenorganogenese zu untersuchen. Darüber hinaus kann der Ursprung von angeborenen Nieren- und Urogenitaltrakt-Fehlbildungen untersucht werden. Nach sorgfältiger Dissektion werden die metanephrischen Rudimente auf einen Filter übertragen, der auf Kulturmedium schwimmt und in einem Zellkulturinkubator für mehrere Tage gehalten werden kann. Allerdings muss man sich bewusst sein, dass die Bedingungen sindKünstlich und könnte den Stoffwechsel im Gewebe beeinflussen. Auch konnte das Eindringen von Testsubstanzen aufgrund der extrazellulären Matrix und der im Explantat vorhandenen Basalmembran begrenzt werden. Ein wesentlicher Vorteil der Orgelkultur ist, dass der Experimentator direkten Zugang zum Orgel haben kann. Diese Technologie ist billig, einfach und erlaubt eine Vielzahl von Modifikationen, wie die Zugabe von biologisch aktiven Substanzen, die Untersuchung von genetischen Varianten und die Anwendung fortschrittlicher bildgebender Verfahren.

Metanephrische Nierenanlagen wurden von schwangeren Black-6-Inzuchtmäusen bei E11.5 abgeleitet und wurden kultiviert. Nach 3 Tagen hatte sich die Harnröhre bis zu 5 Mal verzweigt, was zu einer Verzweigung der anfänglich T-förmigen Harnröhre führte. Jedes Explantat wurde fotografiert, und die Anzahl der Segmente und Endpunkte wurde quantifiziert, um die Verzweigungsgenerationen zu bestimmen und die Anzahl der Endpunkte pro Zweig zu berechnen (Abbildung 1 ). Die Erzeugung ...

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von metanephrischen Rudimente aus Mäuseembryonen.

Dissektion und Kultur der Maus Embryonale Niere

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Die allgemeinen Ziele dieses Verfahrens bestehen darin, metanephrogene Anlagen aus Maus-Embryonen zu isolieren und zu kultivieren sowie die Auswirkungen spezifischer Behandlungen auf die Verzweigungsmorphologie des Harnleiterknospen zu beobachten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Nierenorganogenese zu beantworten, insbesondere bezüglich der Kontrolle der tubulären Verzweigungsmorphogenese, der epithelialen Mesenchym-Interaktionen und der Entstehung angeborener Fehlbildungen. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik liegen darin, dass sie direkten Zugang zum Organ ermöglicht, einfach, kostengünstig und leicht modifizierbar ist.Verwenden Sie vor Beginn der Dissektion sterile Pinzette, um sorgfältig einen Polycarbonat-Membranfilter mit einer Porengröße von fünf Mikrometern in jede Vertiefung einer Vier-Vertiefungs-Platte zu legen, die 500 Mikroliter frisches Kulturmedium enthält. Überführen Sie die Platte in einen Zellkultur-Inkubator. Schneiden Sie anschließend mit einer Rasierklinge etwa 30 Mikropipettenspitzen für 100 Mikroliter etwa einen Millimeter vor der Spitze ab, um die Öffnungen zu vergrößern, und legen Sie die Spitzen danach zurück in den Pipettenspitzenhalter

dissection-and-culture-of-mouse-embryonic-kidney

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

In diesem Bericht beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultivierung der Progenitorzellen Nische aus der embryonalen Maus-Niere, die verwendet werden, um Signalwege Regulierspindel / Vorläuferzellen des sich entwickelnden Nieren untersucht werden können. Diese kultivierten Zellen sind sehr zugänglich kleines Molekül und rekombinante Protein Behandlung und allem auch auf virale Transduktion, die einer effizienten Handhabung von Kandidaten Wege ermöglicht.

Isolierung und Kultivierung von Zellen aus dem Nephrogene Zone der embryonalen Maus Niere

Eine Methode zur direkten pharmakologischen Manipulation von Maus-Embryonen während der Neurulation, dass mütterliche Stoffwechsel umgeht beschrieben. Die Technik lässt sich an verschiedenen Aspekten der Neurulation durch Variation der Zeitpunkt und pharmakologischen Wirkstoffs zu untersuchen.

Neuralrohrschlusses in Maus Whole Embryo Culture

Dieses Video beschreibt die Methode zur Isolierung intakter Glomeruli aus Mausnieren. Die so erhaltenen verkapselten und entkapselten Glomeruli können weiterhin zur Kultivierung von parietalen Epithelzellauswüchsen aus der Mausniere verwendet werden.

Glomeruli-Isolierung: Eine Technik zur Gewinnung intakter Glomeruli aus der Murine

Serum in Embryokulturen genutzt enthält unbekannte Komponenten, die das Ergebnis von Experimenten, vor allem in Studien mit Signal Wechselwirkungen beeinflussen können. Hier verwendeten wir eine Serum-freien Kultursystem mit Sauerstoff angereichert und zeigen, dass Mitte der Schwangerschaft Maus-Embryonen für 16-40 h kultiviert morphologische Entwicklung vergleichbar zu entwickelnden Embryonen in utero.

Maus embryonalen Entwicklung in einem Serum-freien Whole Embryo Culture-System

Dopaminerge Neuronen spielen eine wichtige regulatorische Rolle im Gehirn. Ihr Verlust wird mit der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht. In diesem Video zeigen wir, wie Primärkulturen von zentralen dopaminergen Neuronen aus embryonalem Mausmesencephalon erzeugt werden können. Solche Kulturen sind nützlich, um die extreme Anfälligkeit dieser Neuronen gegenüber verschiedenen Belastungen zu untersuchen.

Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Wir stellen eine Methode zur Isolierung und Kultur der Maus Urnierengang (WD). Wir haben auch ein detailliertes Verfahren für ganze Berg Immunfärbung von kultivierten / frisch isolierten RDG mit fluoreszenz getaggten Antikörper nachweisen. Gemeinsam ermöglichen diese Techniken die Untersuchung von WD Entwicklung, Wickeln und Differenzierung.

Orgel, Kultur und Ganze Berge Immunfluoreszenzanfärbung von Maus Wolffschen Gänge

Tissue-Engineering Nierenfunktion Konstrukte bieten eine Lösung für den Organmangel und die schädlichen Wirkungen der Dialyse. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Mikro murine Nieren zur Isolation von Cortico-medullären Segmente zu sezieren. Diese Segmente werden in zellulären Gerüst-freie Konstrukte bilden renale Organellen implantiert.

Mikrodissektion primäre renale Gewebe Segmente und Einbindung mit neuartigen Gerüst-freie Konstrukt-Technologie

Hier stellen wir eine neuartige mikrochirurgische Technik für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz.

Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Kultivierung und Analyse glomerulären parietalen Epithelzellauswüchsen von verkapselten Glomeruli, die aus der Mausniere isoliert sind. Diese Methode kann verwendet werden, um Wege zu untersuchen, die an der Proliferation und Migration von parietalen Epithelzellen beteiligt sind.

Glomeruläres Outgrowth als Ex-Vivo-Assay zur Analyse von Pfaden, die an der Parietalepithel Cell Activation beteiligt sind

Diese Arbeit beschreibt zwei Methoden zur Untersuchung der Organentwicklung, eine verbesserte Xenotransplantation auf chorioallantoischer Membran (CAM) aus Aviären Embryonen, die eine Vaskularisation kultivierter embryonaler Organe und Organoide ermöglicht, und eine neuartige feste Z-Richtung. Organkulturmethode mit modifizierten experimentellen Bedingungen, die eine hochauflösende Zeitraffer-Konfokalbildgebung ermöglicht.

Optimierung der Renalorganoid- und Organotypischen Kultur für Vaskularisation, erweiterte Entwicklung und verbesserte Mikroskopie-Bildgebung

Lernen Sie die Isolierung und Kultur metanephroner Anlagen aus Maus-Embryonen für die Nierenorganogenese. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Ureterknospenverzweigungen und angeborenen Fehlbildungen.

Dissektion und Kultur der Maus Embryonale Niere

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