Name: Unterscheidung von Chondrozyten aus periphere Blut-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Erfahren Sie die Chondrozytendifferenzierung aus peripheren Blutzellen über iPS-Zellen für patientenspezifische Knorpelregeneration. Diese reproduzierbare, serum- und xenofreie Methode ermöglicht kostengünstige Therapieansätze.

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Die Autoren danken Xiaobin Zhang für sein Plasmid. Wir danken auch Shaorong Gao und Qianfei Wang für ihre freundliche Hilfe während des Experiments. Diese Studie wird von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (Nr.81101346, 81271963, 81100331), dem Peking 215 High-Level-Talent-Projekt (Nr. 2014-3-025) und dem Peking Chao-Yang Hospital Fund (Nr CYXX-2017-01) und die Jugend-Innovationsförderungsvereinigung der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (YL).

Das Protokoll zur Erzeugung von hiPSCs aus PBCs findet sich in unserer vorherigen Studie 5 . Die Studie wurde von der Institutional Review Board unserer Institution genehmigt. 1. Embryoidkörper (EB) Bildung <ol><li> Machen Sie 50 ml hiPSC-Medium: Knockout Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 15% Knockout Serumersatz (KSR), 5% fötalem Rinderserum (FBS), 1 × nicht essentielle Aminosäuren, 55 μM 2-Mercaptoethanol, 2 mM L Glutamin und 8 ng / ml basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF). </li><li> Machen Sie 50 ml EB-Formationsmedium: DMEM, ergänzt mit 15% KSR, 5% FBS, 1x nicht essentielle Aminosäuren, 55 μM 2-Mercaptoethanol und 2 mM L-Glutamin. </li><li> Machen Sie 50 ml Basalkulturmedium: DMEM, ergänzt mit 20% FBS, 1 × nicht essentielle Aminosäuren, 55 μM 2-Mercaptoethanol und 2 mM L-Glutamin. </li><li> 10 ml Disposelösung, 1 mg / ml im Knockout DMEM vorbereiten. </li><li> KultusRe hiPSCs auf 60-mm-Gewebekulturschalen mit Feeder-Zellen ( dh eine Monoschicht von bestrahlten embryonalen Fibroblasten-Zellen). Wenn die Zellen 80-90% konfluent sind, disassoziieren die Zellen mit Disposition und Passage der hiPSCs 1: 3 alle 4-5 Tage. Legen Sie die Zellen in einen 37 ° C und 5% CO 2 Inkubator. </li><li> Die undifferenzierten hiPSC-Kolonien in kleinere Stücke (ca. 50-100 μm Durchmesser) mit einer feuergezogenen Glasnadel zerlegen, wenn die iPSCs 80-90% konfluent sind. Im Allgemeinen verwenden Sie hiPSC-Kolonien in einer 60-mm-Schale, um EBs in einer 100 mm Petrischale zu erzeugen. <ol><li> Kultur weniger als 100 kleine Stücke von Kolonien in einer 100 mm, nicht adhärenten Petrischale mit 10 ml EB-Formationsmedium. Legen Sie das Geschirr in einen 37 ° C und 5% CO 2 Inkubator. </li></ol></li><li> Ersetzen Sie etwa 25% des Ausgangsmediums mit einer gleichen Menge des Basalkulturmediums alle 2 Tage. Kippen Sie die Schale, damit sich die EBs absetzen können. Entfernen Sie vorsichtig 3 mlDes oberen Mediums und füge 4 ml frisches Basalkulturmedium hinzu. Störe die EBs nicht HINWEIS: Die EBs sind morphologisch durch die Kolonien charakterisiert und nehmen ein rundes Aussehen mit glatten Rändern unter dem Mikroskop auf. </li><li> Nach 10 Tagen Kultur in der nicht adhärenten Petrischale eine neue 100-mm-Gewebekulturschale mit 4 ml 0,1% iger Gelatine für 30 min bei 37 ° C vor Gebrauch einwickeln. </li><li> Übertragen Sie das Medium plus EBs von einer 100 mm, nicht adhärenten Petrischale zu einem 15-ml-Kegelrohr. Lassen Sie die EBs für 4-5 min sedimentieren. Aspirieren Sie den Überstand sorgfältig und lassen Sie weniger als 0,5 ml Medium plus EBs </li><li> Seed weniger als 100 EBs auf eine 100 mm, gelatinebeschichtete Gewebekulturschale mit 10 ml Basalkulturmedium. Legen Sie das Geschirr in einen 37 ° C und 5% CO 2 Inkubator. </li></ol> 2. Zellpelletbildung und Chondrozytendifferenzierung <ol><li> 10 ml 0,25% Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zugeben. Machen Sie 80 ml BasAl Kulturmedium: DMEM, ergänzt mit 20% FBS, 1x nicht essentielle Aminosäuren, 55 μM 2-Mercaptoethanol und 2 mM L-Glutamin. </li><li> 10 mL Chondrogen-Differenzierungsmedium: DMEM (hohe Glukose), ergänzt mit 10% Insulin-Transferrin-Selen-Lösung (ITS), 0,1 μM Dexamethason, 1 mM Ascorbinsäure, 1% Natriumpyruvat und 10 ng / ml transformierenden Wachstumsfaktor- Beta 1 (TGF-β1). </li><li> Erfrischen Sie das Medium mit 10 ml Basalkulturmedium nach 48 h. Danach das Medium alle drei Tage mit 10 ml Basalkulturmedium auffrischen. ANMERKUNG: Nach 10 Tagen in der Kultur sollten sich die Fibroblastischen Zellwälder von den EBs erweitern. <ol><li> Die 100 mm-Schale mit 4 ml 0,1% iger Gelatine für 30 min bei 37 ° C vor Gebrauch beschichten. Den Zellüberstand verwerfen und die Zellen mit Dulbecco&#39;s Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS) einmal waschen. </li><li> Die Zellen mit 3 ml 0,25% Trypsin / EDTA bei 37 ° C für 5 min verdauen und mit 4 m neutralisierenL des Basalkulturmediums. </li></ol></li><li> Dissoziieren Sie die Zellen in einzelne Zellen durch Pipettieren auf und ab 5-10 mal und durchlaufen sie durch ein 70 μm Nylon Mesh. Die Zellsuspension bei 200 xg für 5 min zentrifugieren. Die Zellen auf einer neuen 100 mm, mit Gelatine beschichteten Gewebekulturschale mit 10 ml Basalkulturmedium re-seed. </li><li> Erfrischen Sie das Medium mit 10 ml Basalkulturmedium nach 48 h. Danach das Medium alle drei Tage mit 10 ml Basalkulturmedium auffrischen. HINWEIS: Die Zellen erlangen eine homogene, fibroblastenartige Morphologie. </li><li> Wenn ~ 90-100% Konfluenz erreicht ist ( dh etwa 5-7 Tage), ernten Sie die Zellen mit 3 ml 0,25% Trypsin / EDTA bei 37 ° C für 5 min. Neutralisieren mit 4 ml Basalkulturmedium. Dissoziieren Sie die Zellen in einzelne Zellen durch Pipettieren auf und ab 5 mal. Verwenden Sie ein Hämocytometer, um die Zellzahl zu zählen. <ol><li> Legen Sie 3 x 10 5 Zellen in ein 15 ml Polypropylenrohr. Zentrifuge bei 200 xgFür 5 min bei Raumtemperatur (RT). Die Zellen in 1 ml chondrogenem Differenzierungsmedium erneut suspendieren. </li></ol></li><li> Die Zellen bei 300 xg für 3 min erneut zentrifugieren und die Zellen in einer kleinen Pelletform aufrechterhalten. Setzen Sie den Schlauch in den 37 ° C und 5% CO 2 Inkubator für 21 Tage. Schrauben Sie den Deckel nicht fest und lassen Sie den Gasaustausch. </li><li> Ersetzen Sie 3/4 des Kulturmediums alle drei Tage durch frisches chondrogenes Differenzierungsmedium. ANMERKUNG: Nach 21 Tagen in Kultur sollten sich hiPSC-chondrogene Pellets (hiPSC-Chon) gebildet haben. Menschliche mesenchymale Stammzellen (MSCs) als Positivkontrolle werden auch im chondrogenen Differenzierungsmedium für 21 Tage gesammelt und kultiviert, um chondrogene Pellets (hMSC-Chon) zu bilden. </li></ol> 3. Analyse der chondrogenen Differenzierung <ol><li> 10 ml 10% neutral-gepuffertes Formalin zubereiten. </li><li> Vorbereiten von 50 ml 0,1% alcianblauem Reagenz und 50 ml 1% Toluidinblau-Reagenz. </li><li> PrEpare 1 ml der primären Antikörper: Kaninchen polyklonale Antikörper gegen Kollagen II (1:50) oder Maus monoklonale Antikörper gegen Kollagen X (1:50). Auch Anti-Kaninchen oder Maus sekundäre Antikörper vorbereiten. </li><li> Machen Sie 1 ml Papain-Lösung: 10 U / ml in PBS mit 0,1 M Natriumacetat, 2,4 mM EDTA und 5 mM L-Cystein. </li><li> 100 ml Dimethylmethylenblau (DMMB) Farbstofflösung: 100 μl 16 mg / l 1,9-Dimethylmethylenblau, 40 mM Glycin, 40 mM NaCl und 9,5 mM HCl; PH 3,0 </li><li> Beurteilen Sie die chondrogene Differenzierung durch alcianblaue und toluidinblaue Flecken der Pelletabschnitte. <ol><li> Fixieren Sie ein hiPSC-Chon-Pellet oder hMSC-Chon-Pellet in 1 ml 10% neutral-gepuffertem Formalin für 24 h. </li><li> Übertragen Sie das Pellet auf 1 ml 70% iges Ethanol in H 2 O. Dehydrieren Sie das Pellet mit 1 ml einer abgestuften Ethanolreihe ( dh 25, 50, 75, 90, 95, 100 und 100%, jeweils 3 min). </li><li> Klären Sie das Pellet in 1 ml 100% Xylol dreimal. InfiltratE das Pellet mit Paraffin für 1 h in einem 65 ° C Ofen. Einfügen des Pellets in Paraffinblöcke mit einer 7 x 7 x 5 mm 3 Grundform nach routinemäßigen histologischen Verfahren 6 . </li><li> Mischen Sie angrenzende Abschnitte durch Mikrotom mit einer Dicke von ca. 4 μm 7 . Befestigen Sie die Abschnitte auf Glasrutschen. </li><li> Trocknen Sie die Objektträger für 2 h bei 60 ° C in einem Ofen. Deparaffinieren Sie die Abschnitte in drei Zyklen (jeweils 3 min) mit 100% Xylol. </li><li> Verwenden Sie eine abnehmende Alkoholreihe für die Rehydratisierung ( dh 100, 100, 95, 95, 70, 50 und 25% in H 2 O, jeweils 3 min) und führen Sie dann mit abisoliertem Wasser 5 min ab. </li><li> Färben Sie die Sektionen mit 0,1% alcianblauem Reagenz oder 1% Toluidin-Blau-Färbung für 4-5 h und spülen Sie sie dann mit destilliertem Wasser ab. </li><li> Dehydrieren mit einer abgestuften Ethanolreihe ( dh 25, 50, 75, 90, 95, 100 und 100%, jeweils 3 min), gefolgt von drei aufeinanderfolgenden stEps der Klärung in 100% Xylol. Montiere die Dias und visualisiere sie unter einem Mikroskop. </li></ol></li><li> Führen Sie Immunhistochemie durch. HINWEIS: Zusätzliche Pelletabschnitte werden durch Immunhistochemie weiter beurteilt. <ol><li> Nach der Entparaffinierung und Rehydratisierung bringen Sie die Objektträger in 1 mM EDTA, pH 8,0 (wasserdicht in Wasser, das von Autoklaven gekocht wird) zum Kochen bringen. Lassen Sie sie für 8 min bei einer Unterkochtemperatur sitzen und lassen Sie dann die Objektträger bei RT abkühlen. </li><li> Spülen Sie die Dias mit deionisiertem Wasser 3 mal. Inkubieren Sie die Abschnitte in 3% H 2 O 2 -Lösung in Methanol bei RT für 15 min, um die endogene Peroxidase-Aktivität zu blockieren. </li><li> Spülen Sie die Folien mit deionisiertem Wasser und tauchen Sie sie in DPBS für 5 min ein. 50-100 &amp; mgr; l eines entsprechend verdünnten (1:50) primären Antikörpers auf die Abschnitte auf den Objektträgern auftragen und dann 1 h in einer befeuchteten Kammer bei RT inkubieren. </li><li> Die Dias 3 mal (jeweils 5 min) mit DPBS waschen. Inkubiere die saMit den entsprechenden sekundären Antikörpern ( dh Anti-Kaninchen oder Maus) für 15 min bei RT. </li><li> Die Dias 3 mal (für jeweils 5 min) mit DPBS waschen. DAB-Erkennung unter einem Mikroskop durchführen. </li><li> Waschen Sie die Dias mit DPBS 3 mal (jeweils 2 min). Gegen die Zellkerne durch Eintauchen der Folien in Hämatoxylin für 1-2 min. Dehydrieren mit einer abgestuften Ethanolreihe (25, 50, 75, 90, 95, 100 und 100%, jeweils 3 min), gefolgt von drei aufeinanderfolgenden Schritten der Klärung mit Xylol. Schließlich montiere die Dias und visualisiere sie unter dem Mikroskop. </li></ol></li><li> SGAG-Inhalt erkennen. <ol><li> Chondrogene Pellets in Papain-Lösung bei 60 ° C für 2 h ausbauen. </li><li> Bestimmen Sie den DNA-Gehalt mit dem dsDNA-Assay-Kit und dem Fluorometersystem. Messen Sie den sGAG-Gehalt durch Mischen mit DMMB-Farbstofflösung unter Messabsorption bei 525 nm 8 . </li><li> Berechnen Sie die Konzentration von sGAG gegen eine Standardkurve vonHai-Chondroitinsulfat. </li></ol></li><li> Führen Sie die Echtzeit-PCR-Analyse der chondrogenen Differenzierungsmarker in hiPSC-Chon-Pellets durch. <ol><li> Ernte 3-4 der gleichen chondrogenen Pellets durch Zugabe von 500 μl eiskaltes Extraktionsreagenz zu einem Röhrchen. Vortex gründlich. Inkubieren Sie die Probe für 5 min bei RT. </li><li> 0,1 ml Chloroform zugeben. Vortex die Probe für 15 s und inkubiere sie bei RT für 3 min. Die Probe für 15 min bei 12.000 xg und 4 ° C zentrifugieren. Übertragen Sie die obere wässrige Phase (ca. 250 μl) in ein neues 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Füge 25 μl Natriumacetat und 1 μl Glykogen zur Probe hinzu. Fälligkeit der RNA durch Mischen mit 250 μl Isopropylalkohol. Gründlich mischen. Inkubieren Sie die Probe bei RT für 10 min. </li><li> 10 min bei 12.000 xg und 4 ° C zentrifugieren. Den Überstand vollständig entfernen. Das RNA-Pellet zweimal mit 500 μl 75% igem Ethanol waschen. </li><li> 5 min zentrifugierenBei 7.500 xg und 4 ° C. Entfernen Sie alle übrig gebliebenen Ethanol und lüften Sie das RNA-Pellet für 5-10 min. Die RNA in 10 μl nukleasefreies Wasser auflösen. </li><li> Umwandlung der RNA in cDNA unter Verwendung eines reversen Transkriptase-Systems. Betrachten Sie die cDNA-Proben in Echtzeit-PCR mit qPCR Kit Master Mix (2x) und einem Echtzeit-PCR-System 9 . HINWEIS: Die Primerfolgen sind: H AGGRECAN -F: TCGAGGACAGCGAGGCC; H AGGRECAN -R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA; H β-ACTIN -F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC; H β-ACTIN -R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC; H COL2 -F: TGGACGATCAGGCGAAACC; H COL2 -R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT; H SOX9 -F: AGCGAACGCACATCAAGAC; H SOX9 -R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG; H COL10 -F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT; H COL10 -R: GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier stellen wir ein Protokoll zur Generierung von Chondrozyten aus PBCs über iPSCs zur Verfügung. Weil PBCs häufiger und weit verbreitet im klinischen Bereich sind, werden sie als eine mögliche Alternative zur Umprogrammierung dargestellt. In dieser Studie wurden episomale Vektoren (EV) verwendet, um PBCs in iPSCs zu programmieren, nachdem die Methode von Zhang et al. 11 Dieser integrationsfreie Ansatz beinhaltet nicht die Integration der virusassoziierten Genotoxizität, von der angenom...

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The corresponding author was updated from:
Yueying Li 
yueyinglee2010@hotmail.com 
Key Laboratory of Genomic and Precision Medicine, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences
The corresponding author is now listed as:
Tie Liu 
waterkins@163.com 
Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University

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Erratum: Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Knorpelgewebe hat eine sehr schlechte Fähigkeit zur Selbstreparatur und Regeneration. Verschiedene chirurgische Eingriffe und biologische Behandlungen werden verwendet, um Knorpel und Gelenkfunktion wiederherzustellen, mit unbefriedigenden Ergebnissen. Die jüngste Entwicklung der Stammzellentechnologie kann das gesamte Knorpelreparaturfeld verändern 1 . Verschiedene Stammzellen wurden als Samenzellen untersucht, aber menschlich induzierte pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) scheinen die vielversprechendste Wahl zu sein, da sie viele Arten von patientenspezifischen Zellen liefern können, ohne Ablehnungsreaktionen zu verursachen 2 . Darüber hinaus können sie die begrenzte proliferative Natur der erwachsenen Zellen überwinden und ihre Selbsterneuerung und pluripotenten Fähigkeiten beibehalten. Darüber hinaus kann Gen-Targeting verwendet werden, um den Genotyp zu ändern, um spezifische Arten von Chondrozyten zu erhalten. Fibroblasten wurden weithin verwendet, um iPSCs zu erzeugen, weil ihre Umprogrammierungspotentiale auch gut untersucht wurden.Allerdings gibt es noch einige Einschränkungen, die überwunden werden müssen, wie die schmerzhafte Biopsie von Patienten und die Notwendigkeit für die in vitro Expansion der Fibroblasten, die zu Genmutationen führen können 3 . Kürzlich wurden PBCs als vorteilhaft für die Umprogrammierung von 4 gefunden ; Darüber hinaus wurden sie häufig genutzt und reichlich gelagert. Es ist möglich, dass sie den Studienfokus von der Haut umleiten können. Allerdings gibt es nach unserem besten Wissen nur wenige Berichte über die PBC-Neuprogrammierung, gefolgt von der Differenzierung in Chondrozyten. In der aktuellen Studie nutzen wir PBCs als alternative Quelle, indem wir sie in iPSCs umprogrammieren und dann die iPSCs in die chondrogene Linie durch ein Pelletkultursystem differenzieren, um die Chondrozytenbildung zu imitieren.

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829018</td><td>Basalmedium für die hiPSC-Kultur und EB-Bildungsmedium</td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>Ein definierteres, FBS-freies Medium, das für die hiPSC-Kultur und das EB-Bildungsmedium verwendet</td></tr><tr><td>wird Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>sh30070.03</td><td>Wird für hiPS-Kultur und EB-Bildungsmedium verwendet und bietet ein hervorragendes Preis-Leistungs-Verhältnis für die Zelle. Kultur</td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Chemicon</td><td>TMS-001-C</td><td>Wird als Wachstumszusatz in allen Zellkulturmedien verwendet, um das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit zu erhöhen</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>TMS-002-C</td><td>Eine Aminosäure, die für die Zellkultur benötigt</td></tr><tr><td>wird Grundischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Ein Zytokin, das zur Aufrechterhaltung der Pluripotenz und Selbsterneuerung von hiPS-Zellen verwendet wird</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105041</td><td>Wird für die hiPSC-Dissoziation für die Subkultur</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11960</td><td>Basalmedium für MSC-Kulturmedium</td></tr><tr><td>verwendet 0,1 %</td><td>Gelatine Millipore</td><td>ES-006-B</td><td>Wird für die Zelladhäsion auf den Schalen verwendet</td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Wird für die Zelldissoziation</td></tr><tr><td>verwendet DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>Eine ausgewogene Salzlösung, die zur Zellwäsche oder zur Herstellung von</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol-Invitrogen-21985023</td><td></td><td></td><td>verwendet wird als Wachstumszusatz in allen Zellkulturmedien verwendet wird.</td></tr><tr><td>ITS</td><td>Invitrogen</td><td>41400045</td><td>Insulin, Transferrin, Selenlösung. Wird zur chondrogenen Differenzierung verwendet.</td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma</td><td>4403</td><td>Bekannt als Vitamin C. Es hilft bei aktivem Wachstum und hat antioxidative Eigenschaften.</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Gibco</td><td>11360070</td> dem <td>Zellkulturmedium als Energiequelle zusätzlich zu Glukose zugesetzt.</td></tr><tr><td>Transformierender Wachstumsfaktor-beta 1</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-21C</td><td>Ein Zytokin, das die Zellproliferation, das Wachstum und die chondrogene Differenzierung reguliert.</td></tr><tr><td>Polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen Kollagen II</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>Dieser Antikörper reagiert mit Typ-II-Kollagenen, die spezifisch für Knorpelgewebe sind.</td></tr><tr><td>Monoklonale Antikörper der Maus gegen Kollagen X</td><td>Abcam</td><td>ab49945</td><td>Dieser Antikörper reagiert mit Kollagen vom Typ X, das ein Produkt von hyperthrophischen Chondrotozyten ist.</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td>Zum Einbetten und zur Langzeitlagerung von Objektträgern</td></tr><tr><td>Toluidinblau</td><td>Sigma</td><td>89640</td><td>Wird für den Nachweis von Proteoglykanen verwendet.</td></tr><tr><td>Alcianblau</td><td>Amresco</td><td>#0298</td><td>Wird zum Nachweis von Glucosaminoglykanen verwendet.</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma</td><td>P4762-25MG</td><td>Wird zur Verdauung von chondrogenen Pellets verwendet.</td></tr><tr><td>Dimethylmethylenblau</td><td>Sigma</td><td>341088-1G</td><td>Wird zur Quantifizierung von Glykosaminoglyanen</td>Chondroitinsulfat-Natriumsalz</tr><tr><td>aus Haifischknorpel</td><td>verwendet Sigma</td><td>C4384-250MG</td><td>Wird verwendet, um die Standardkurve für die Messung des sGAG-Gehalts zu zeichnen.</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851 (100)</td><td>Zur Bestimmung des DNA-Gehalts</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>Zur RNA-Isolierung aus Zellen</td></tr><tr><td>Reverse Transkriptase-System</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td>Zur Umwandlung von RNA in cDNA</td></tr><tr><td>SYBR FAST qPCR Kit Master Mix</td><td>Kapa</td><td>KK4601</td><td>Zur Bestimmung der Echtzeit-PCR</td></tr></tbody></table>

unterscheidung von chondrozyten aus periphere blut-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten stammzellen

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In dieser Studie verwendeten wir periphere Blutzellen (PBCs) als Samenzellen, um Chondrozyten über induzierte pluripotenten Stammzellen (iPSCs) in einer integrationsfreien Methode zu erzeugen. Nach der Embryoidkörperbildung (EB) und der fibroblastischen Zellexpansion werden die iPSCs für die chondrogene Differenzierung für 21 Tage unter serumfreien und xenofreien Bedingungen induziert. Nach der Chondrozyteninduktion werden die Phänotypen der Zellen durch morphologische, immunhistochemische und biochemische Analysen sowie durch die quantitative Echtzeit-PCR-Untersuchung von chondrogenen Differenzierungsmarkern ausgewertet. Die chondrogenen Pellets zeigen eine positive alcianblaue und toluidinblaue Färbung. Auch die Immunhistochemie der Kollagen II und X Färbung ist positiv. Der sulfatierte Glycosaminoglycan (sGAG) -Gehalt und die chondrogenen Differenzierungsmarker COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 und AGGRECAN sind in chond signifikant hochreguliertRogene Pellets im Vergleich zu hiPSCs und fibroblastischen Zellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass PBCs als Samenzellen verwendet werden können, um iPSCs für die Knorpelreparatur zu erzeugen, die patientenspezifisch und kostengünstig ist.

Chondrogene Differenzierung von hiPSCs: EB-Formationsmedium und Basalkulturmedium wurden verwendet, um die hiPSCs in die mesenchymale Linie zu differenzieren. Es wurde eine mehrstufige Kulturmethode verwendet ( Abbildung 1 ). Zuerst wurden die hiPSCs spontan über EB-Bildung für 10 Tage differenziert (D10, Abbildung 2A ). Zweitens stiegen die Zellen von den EBs für weiter...

Wir präsentieren ein Protokoll zur Erzeugung einer chondrogenen Linie aus menschlichem peripherem Blut (PB) über induzierte pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung einer integrationsfreien Methode, die Embryoidkörperbildung (EB), Fibroblastische Zellenexpansion und chondrogene Induktion umfasst.

Unterscheidung von Chondrozyten aus periphere Blut-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, chondrogene Zelllinien aus menschlichen peripheren Blut-abstammenden induzierten pluripotenten Stammzellen, oder IPS-Zellen, zu erzeugen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Knorpelregeneration zu beantworten, insbesondere hinsichtlich der Verwendung patientenabstammender peripherer Blutzellen als C-Zellen zur Erzeugung von IPS-Zellen für die Knorpelreparatur. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik liegen in ihrer einfachen Reproduzierbarkeit und darin, dass die Chondrozyten-Differenzierung unter serum- und xenofreien Bedingungen stattfindet.Beginnen Sie mit dem Ausplattieren menschlicher IPS-Zellen in vier Milliliter menschlichem IPSC-Medium auf eine 60-Millimeter-Zellkulturschale, die eine Monoschicht aus bestrahlten murinen embryonalen Fibroblasten als Fütterungszellen enthält. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in fünf Prozent Kohlendioxid. Wenn die Stammzellen zu 80 bis 90 Prozent konfluent sind, lösen Sie die Zellen mit Displace-Lösung zur Subkultivierung auf.Nach zwei bis drei Passagen verwenden Sie eine mit der Flamme gezogene Glasnadel, um die 80 bis 90 Prozent konfluente undifferen

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Der Artikel beschreibt die detaillierte Methode zur menschlichen pluripotenten Stammzellen differenzieren zu Herzmuskelzellen wirksam durch selektives Modulieren des Wnt-Signalwegs, gefolgt von Durchflusszytometrie-Analyse von Referenzmarkierungen, um die Homogenität und Identität der Population abzuschätzen.

High Efficiency Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen zu Kardiomyozyten und Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie

Mechanischer Stress kann die chondrogene Differenzierung von Stammzellen induzieren und bietet damit einen potentiellen therapeutischen Ansatz für die Reparatur von gestörtem Knorpel. Wir stellen ein Protokoll vor, um die chondrogene Differenzierung von aus Fett gewonnenen Stammzellen (ASCs) mit Hilfe der Zentrifugalgravitation (CG) zu induzieren. Die CG-induzierte Hochregulierung von SOX9 führt zur Entwicklung chondrogener Phänotypen.

Chondrogene Differenzierung Induktion von Fettgewebe gewonnene Stammzellen durch Zentrifugalkraft Gravity

Hier präsentieren wir menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC) Kultur Protokolle verwendet, um hPSCs in CD34 unterscheiden+ hämatopoetischen Vorläuferzellen. Diese Methode nutzt Bühne-spezifische Manipulation von kanonischer WNT signalisieren Zellen ausschließlich entweder die definitive oder primitive hämatopoetischen Programm angeben.

Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

Hier schlagen wir ein Protokoll für die chondrogene Differenzierung von Nervenblut mononuklearen Zell-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen vor.

Chondrogene Pelletbildung aus Cord Blut-induzierten induzierten pluripotenten Stammzellen

Wir schlagen eine Protokoll, die zeigt, wie man differenzieren induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Keratinozyten und Fibroblasten und generieren eine organoide 3D Haut mit diesen Keratinozyten und Fibroblasten. Dieses Protokoll enthält einen zusätzlichen Schritt einem humanisierten Mäuse-Modell zu erzeugen. Die hier vorgestellten Technik verbessert die dermatologische Forschung.

Generation von 3D Haut organoide aus Cord Blood-abgeleitete induzierte pluripotente Stammzellen

Das Ziel dieses Protokolls ist, die Fähigkeit der Vorläuferzellen aus menschlichen perivaskuläre Fettgewebe abgeleitet, in mehrere Linien der Zelle differenzieren zu testen. Differenzierung war im Vergleich zu mesenchymalen Stammzellen aus menschlichen Knochenmark, die bekanntlich in Adipocyte, Osteocyte und Knorpelzelltransplantation Abstammungen zu differenzieren.

Differenzierung-Kapazität des menschlichen Aortenklappe perivaskuläre Fettgewebe Vorläuferzellen

Hier wird ein einfaches Protokoll für die gezielte Differenzierung von hämogenen Endothelzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen in ca. 1 Woche vorgestellt.

Gerichtete Differenzierung hämogener Endothelzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt und vergleicht zwei repräsentative Methoden zur Differenzierung von hiPSCs in mesenchymale Stromazellen (MSCs). Die Monolayer-Methode zeichnet sich durch geringere Kosten, einfachere Bedienung und leichtere osteogene Differenzierung aus. Die Methode der Embryoidkörper (EBs) zeichnet sich durch einen geringeren Zeitaufwand aus.

Vergleich zweier repräsentativer Methoden zur Differenzierung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen in mesenchymale Stromazellen

Dieses Protokoll stellt die Differenzierung humaner Osteoklasten aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) dar und beschreibt Methoden zur Charakterisierung von Osteoklasten und Osteoklastenvorläufern.

Differenzierung und Charakterisierung von Osteoklasten aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Chondrozyten, Fibronektin-Adhäsionsassay-abgeleiteten Chondroprogenitoren (FAA-CPs) und migratorischen Chondroprogenitoren (MCPs) aus menschlichem Gelenkknorpel. Es umfasst enzymatischen Verdau, Fibronektin-Adhäsion und migrationsbasierte Assays zur Isolierung und Charakterisierung dieser Zellen.

Isolierung von Chondrozyten und Chondroprogenitoren mittels Fibronektin-Adhäsions- und Migrationsassay

Diese Studie beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von chondrozytären Sphäroiden, indem Zellen unter Verwendung der Schwerkraft unter Bedingungen mit geringer Adhäsion zu Sphäroiden aggregiert werden, gefolgt von der Kultivierung der resultierenden Sphäroide in Mini-Bioreaktoren.

Erzeugung von Sphäroiden aus verschiedenen Chondrozyten unter Verwendung von niedrigadhäsiven Bedingungen unter Schwerkraft und selbstgemachten Mini-Bioreaktoren

Erfahren Sie die Chondrozytendifferenzierung aus peripheren Blutzellen über iPS-Zellen für patientenspezifische Knorpelregeneration. Diese reproduzierbare, serum- und xenofreie Methode ermöglicht kostengünstige Therapieansätze.

Unterscheidung von Chondrozyten aus periphere Blut-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

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