Unterscheidung von Chondrozyten aus periphere Blut-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, chondrogene Abstammungszellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (IPS-Zellen) aus dem peripheren Blut zu erzeugen. Diese Methode kann helfen, die Schlüsselfragen im Bereich der Knorpelregeneration zu beantworten, bei denen es darum geht, aus Patienten stammende periphere Blutzellen als C-Zellen für die Erzeugung von IPS-Zellen für die Knorpelreparatur zu verwenden. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie leicht reproduzierbar ist und die Chondrozytendifferenzierung unter serum- und xenofreien Bedingungen erfolgt.

Beginnen Sie mit der Beschichtung menschlicher IPS-Zellen in vier Millilitern humanem IPSC-Medium auf eine 60-Millimeter-Gewebekulturschale, die eine Monoschicht aus bestrahlten embryonalen Fibroblasten-Feederzellen der Maus enthält. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in fünf Prozent Kohlendioxid. Wenn die Stammzellen zu 80 bis 90 Prozent konfluiert sind, dissoziieren Sie die Zellen mit Dispace-Lösung zur Subkultur.

Nach zwei bis drei Passagen verwenden Sie eine feuergezogene Glasnadel, um die 80 bis 90 Prozent konfluente undifferenzierte IPSC-Kolonie in kleinere Fragmente zu zerlegen, und übertragen Sie nicht mehr als 100 Zellkulturstücke in eine neue, nicht haftende 100-Millimeter-Petrischale, die 10 Milliliter Embryoidkörperbildungsmedium enthält. Die mechanische Dissoziation ist besser als der automatische Verdau, da sie die Zellschädigung auf nun kleine Zellfragmente reduziert, die in den neuen Kulturbehälter übertragen werden sollen, und die manuelle Entsorgung der Feeder-Zellen ankündigt, die die Differenzierung der menschlichen IPS-Zellen unterdrücken. Bringen Sie die menschlichen IPS-Zellen wieder in den Zellkultur-Inkubator zurück.

Nach zwei Tagen kippen Sie die Schale, damit sich die Embryoidkörper absetzen können, und ersetzen Sie vorsichtig drei Milliliter des Embryoidkörperbildungsmediums durch vier Milliliter frisches Basalkulturmedium. Nach 10 Tagen haben sich embryoide Körper gebildet. Eine neue 100-Millimeter-Schale 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit vier Millilitern 0,1 Prozent Gelatine bestreichen.

Übertragen Sie die Embryoidkörper mit dem Überstand in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und lassen Sie die Körper vier bis fünf Minuten lang ruhen. Aspirieren Sie alle bis auf die letzten 0,5 Milliliter des Mediums und resuspendieren Sie die Embryoidkörper in 10 Millilitern frischem Basalkulturmedium. Wenn die Gelatine fest geworden ist, entsorge die Gelatine.

Dann säen Sie die Zellen auf die mit Gelatine überzogene Schale und stellen Sie die Schale in den Zellkultur-Inkubator. Nach 10 Tagen in Kultur haben sich die Embryoidkörper zu fibroblastischen Zellauswüchsen differenziert. Um die Chondrozytendifferenzierung zu induzieren, waschen Sie die Kultur mit DPBS und lösen Sie die Zellen fünf Minuten lang mit drei Millilitern 0,25 Prozent Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius ab.

Wenn sich die Zellen vom Boden der Platte abgehoben haben, neutralisieren Sie die Reaktion mit vier Millilitern frischem Basalkulturmedium und titrieren Sie die Kultur vorsichtig fünf- bis zehnmal. Filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikron-Nylonnetzsieb und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Anschließend säen Sie die Zellen auf eine neue, mit Gelatine beschichtete 100-Millimeter-Platte in 10 Millilitern frischem Basalkulturmedium.

Wenn die Kultur eine Konfluenz von 90 bis 100 Prozent erreicht, ernten Sie die Zellen mit drei Millilitern 0,25 Prozent Trypsin-EDTA, wie gerade für die Zählung gezeigt. Übertragen Sie ein dreimal 10 bis fünftes Aliquot der Zellen zur Zentrifugation in ein 15-Milliliter-Polypropylenröhrchen. Und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter chondrogenem Differenzierungsmedium.

Zentrifugieren Sie dann die Zellen erneut und legen Sie das Röhrchen für 21 Tage in den Zellkultur-Inkubator, ohne das Pellet zu stören. Chondrogene Zellen können sich in vitro zusammensetzen und unter Kulturbedingungen mit hoher Dichte charakteristische extrazelluläre Metriken erzeugen. Nach 21 Tagen in Kultur hat sich ein chondrogenes Pellet aus menschlichen IPS-Zellen gebildet.

Nach 21-tägiger Kultivierung sind die humanen IPSC-Chondrogenzellen positiv für Alcianblau und Toluidin in der Blaufärbung, was auf eine erfolgreiche chondrogene Differenzierung des HIPSC-Pellets hinweist. Die immunhistochemische Analyse von Kollagen zwei und Kollagen 10 bestätigt außerdem ihren Chondrozyten-ähnlichen Phänotyp. Die Analyse von sulfatierten Glykosaminoglykanen zeigt, dass der Gehalt an sulfatierten Glykosaminoglykanen der Zellen in humanen IPSC-chondrogenen Pellets im Vergleich zu humanen fibroblastischen IPSC-ähnlichen Zellen, Embryoidkörpern und undifferenzierten menschlichen IPS-Zellen signifikant hochreguliert ist.

Darüber hinaus weisen humane IPSC-Chondrogenzellen ein hohes Genexpressionsniveau der Chondroprogenitor-Linie und vollständig differenzierte Chondrozytenmarker auf, was auf das Erreichen einer erfolgreichen chondrogenen Differenzierung hindeutet. Eine mehrstufige Kulturmethode zur Unterscheidung von humanen IPSCs in Chondrozyten, einschließlich spontaner Differenzierung durch EB-Bildung, Zellauswuchs aus EBs, Monolayer-Zellkultur nach Zellkultur und 3D-Pelletkultur. Der Chondrozyten-Phänotyp wird durch histologische Analyse, biochemische Analyse und chondrogene Genexpression beurteilt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine mehrstufige Kulturmethode verwenden, um die Differenzierung menschlicher IPS-Zellen in Chondrozyten zu induzieren. Diese Technik könnte patientenspezifischer und kostengünstiger sein.