Systemische Lieferung von MicroRNA mit rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 zur Behandlung von neuromuskulärer Erkrankungen bei Nagern
10. August 2018
Hier beschreiben wir die Lieferung von MicroRNA verwenden ein rekombinantes Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 in einem Mausmodell der neuromuskulären Erkrankungen. Eine einzelne periphere Verabreichung bei Mäusen führte zu nachhaltigen MiRNA Überexpression in Muskel und motorischen Neuronen, bietet eine Möglichkeit, MiRNA Lernfunktion und therapeutische Potenzial in Vivo.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Selektion und Verabreichung einer microRNA unter Verwendung eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virusvektors. Anschließend wird es an die Skelettmuskulatur und die Motoneuronen von Mäusen abgegeben und ihre Wirksamkeit bei der Verbesserung von Krankheitsphänotypen bewertet. Diese Methode kann helfen, die wichtige Frage zu beantworten, ob eine microRNA-basierte Silencing-Strategie zur Behandlung neuromuskulärer Erkrankungen eingesetzt werden kann.
Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Verwendung des Adeno-assoziierten Serotyp-9-Virus, um eine microRNA durch systemische Zirkulation an das Rückenmark und die Skelettmuskulatur von Mäusen zu liefern, um ein Zielkrankheitsgen direkt zum Schweigen zu bringen. Teilen Sie den AAV-microRNA-Plasmidbestand in 100 bis 200 Mikroliter große Aliquote auf, die eine Viruslast von zehn bis hundert Billionen Genomen pro Milliliter enthalten. Laden Sie dann ein Aliquot in eine Spritze und befestigen Sie eine Nadel mit 27 bis 30 Gauge.
Befestigen Sie nun eine Maus mit einem Standard-Maus-Rückhaltesystem mit freiliegendem Schwanz. Reinigen Sie dann den Schwanz mit 70% Alkohol und legen Sie ein warmes Pad für etwa 30 Sekunden unter den Schwanz, um die Vasodilatation zu erhöhen. Führen Sie nun am distalen Teil des Schwanzes die Nadel mit der Abschrägung nach oben und in einem flachen Winkel von etwa 15 Grad in die Schwanzvene ein.
Injizieren Sie dann das Virus und warten Sie einige Sekunden, bevor Sie die Nadel entfernen. Nachdem Sie die Nadel entfernt haben, üben Sie mit zwei Fingern mäßigen Druck aus, um Blutungen zu stoppen. Bringen Sie das Tier dann in seinen Heimatkäfig zurück.
Bei der Schwanzveneninjektion kommt es nicht selten zu einem Blutblitz in der Nadelnabe. Während der Injektion sollte kein Widerstand entstehen. Wenn der Schwanz anfängt zu bleichen und anzuschwellen, entfernen Sie die Nadel und versuchen Sie es erneut proximal an der vorherigen Eintrittsstelle.
Für diese Tests sollten die Mäuse älter als vier Wochen sein und vor der Behandlung unbedingt eine Basismessung vornehmen. Der Testraum sollte ruhig und dunkel sein, ohne dass es zu Störungen kommt. Bringen Sie die Mäuse mindestens 30 Minuten vor der Durchführung von Tests in den Raum.
Stören Sie die Tiere während dieser Eingewöhnungsphase nicht. Beginnen Sie mit dem Test des hängenden Drahtes. Fassen Sie die Maus am Schwanz und platzieren Sie sie in der Mitte des Drahtgitters.
Heben Sie dann das Raster um 15 bis 20 Zoll an und drehen Sie den Bildschirm langsam um, um der Maus Zeit zu geben, ihren Griff anzupassen. Sobald das Gitter vollständig invertiert ist, starten Sie den Timer und notieren Sie die Zeit bis zum Fallen. Lassen Sie die Maus 60 Sekunden hängen, wenn sie früher herunterfällt, dann legen Sie sie wieder auf das Raster und wiederholen Sie den Vorgang.
Wenn die Maus volle 60 Sekunden hängt, registrieren Sie 60 Sekunden für die Punktzahl, und setzen Sie die Maus wieder in ihren Käfig ein. Erlauben Sie jeder Maus drei Versuche, 60 Sekunden lang Hand zu geben. Andernfalls erzielen Sie die längste Hangtime.
Nach der Einschläferung der Maus wird das Rückenmark und dann der Quadrizeps-Skelettmuskel entnommen. Um die geernteten Taschentücher schnell einzufrieren, füllen Sie eine Edelstahlschüssel zur Hälfte mit 2-Methylbutan und tauchen Sie das untere Viertel der Schüssel in flüssigen Stickstoff. Warten Sie zwei Minuten, bevor Sie fortfahren.
Nach einigen Minuten wird die Probe in das 2-Methylbutan überführt. Wenn die Probe weiß wird, geben Sie sie sofort in einen Behälter, in den Trockeneis eingebettet ist. Lagern Sie die Probe später bei 80 Grad Celsius.
Für die biochemische Analyse und microRNA-Quantifizierung legen Sie das entnommene Gewebe in ein Kryofläschchen und frieren es in flüssigem Stickstoff ein. Lagern Sie es dann bei 80 Grad Celsius. SBMA-Mäusen wurden im Alter von fünf Wochen einhundert Billionen Genome von AAV microR-298 injiziert.
SBMA-Mäuse tragen das humane Androgenrezeptor-Transgen mit einem abnormal expandierten Polyglutamin-Trakt. Nach zehn Wochen entwickeln sie in der Regel Anzeichen einer neuromuskulären Erkrankung. Das lumbale Rückenmark und der Quadrizepsmuskel wurden zu mehreren Zeitpunkten nach der Behandlung zur Analyse entnommen.
Die quantitative RT-PCR zeigte, dass die micro-R298-Expression im Skelettmuskel nach acht Wochen ihren Höhepunkt erreichte und dass die Expression im Rückenmark nach 12 Wochen ihren Höhepunkt erreichte. Zehn Wochen nach der Injektion wurde in beiden Geweben GFP nachgewiesen. Und die GFP-Expression war co-lokalisiert mit dem Motoneuron-Marker Cholinacetyltransferase.
In einem Folgeexperiment wurden Mäuse im Alter von sieben Wochen nach dem Zufallsprinzip mit dem Virus oder Vehikel injiziert und dann wöchentlich bis zum Alter von 40 Wochen gewogen und verhaltensgetestet. Zehn Wochen nach der Injektion begannen die behandelten Mäuse an Gewicht zuzunehmen und zeigten eine verbesserte motorische Leistung. Quantitative Echtzeit-PCR zeigte, dass die Behandlung die AR-Transkriptspiegel in den betroffenen Geweben reduziert.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine microRNA mit einem rekombinanten Adeno-assoziierten Virusvektor durch Schwanzinjektion verabreichen. Und wie man Verhaltensassays durchführt, die helfen können, die Wirksamkeit der abgegebenen microRNA bei der Verbesserung der Atrophie und Schwäche der unteren Gliedmaßen bei Mäusen zu bewerten. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auch auf gentherapeutische Ansätze, da eine sichere und effektive Gentherapie einen gezielten gewebespezifischen Transfer des therapeutischen Transgens erfordert.
Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir erkannten, dass Krankheiten, die durch toxische Gain-of-Function-Mechanismen wie SBMA verursacht werden, von einer Überexpression natürlich vorkommender microRNAs profitieren würden, die speziell auf die Drei-Prime-Reparatur des Krankheitstranskripts abzielen.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Verabreichung eines Mikro-RNAs (miRNA) unter Verwendung eines rekombinanten adenoassoziierten Virus (rAAV)-Vektors vorgestellt, der auf die Skelettmuskulatur und Motoneurone in einem Mausmodell der spinalen und bulbo-spinalen Muskelatrophie (SBMA) abzielt. Der Ansatz zielt darauf ab, die Wirksamkeit der miRNA-vermittelten Genstilllegung bei der Verbesserung neuromuskulärer Krankheitsphänotypen zu bewerten, was Auswirkungen auf die Gentherapie bei toxischen Funktionserkrankungen hat.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Gen-Therapie
- Forschung zu neuromuskulären Erkrankungen
- Molekulare Neurowissenschaft
Hintergrund
- Die RNA-Interferenz über endogene miRNA-Wege reguliert die Genexpression posttranskriptionell.
- Die durch miRNAs vermittelte Genregulation ist eine aussichtsreiche therapeutische Strategie für neurologische Erkrankungen, die durch toxische Mutationen mit Funktionserwerb verursacht werden.
- Die effiziente Abgabe therapeutischer miRNAs in Zielgewebe bleibt eine bedeutende Herausforderung.
- SBMA ist eine neuromuskuläre Erkrankung, die durch eine Polyglutamin-Expansion im Androgenrezeptor-Gen (AR) verursacht wird.
Zweck der Studie
- Untersuchung, ob die Überexpression eines neu identifizierten, das Androgenrezeptor (AR) targetierenden miRNA (miR-298) die Krankheitsphänotypen bei SBMA-Mäusen verbessern kann.
- Beurteilung der Effizienz der systemischen Verabreichung von miR-298 mittels rAAV9-Vektoren.
- Beurteilung des Einflusses von miR-298 auf die AR-Transkriptmengen und die neuromuskuläre Funktion.
Verwendete Methoden
- Herstellung von rAAV9-Vektoren, die miR-298 kodieren, aliquotiert zur Injektion.
- Systemische Applikation mittels Schwanzveneninjektion bei SBMA-Mäusen unter Verwendung einer 27–30-Gauge-Nadel.
- Verhaltensanalyse mittels des Hängedrahttests zur Beurteilung der motorischen Funktion.
- Gewinnung von Gewebeproben (Rückenmark und Quadrizepsmuskel) zur biochemischen Analyse und Quantifizierung von miRNA mittels quantitativer RT-PCR.
- Immunfluoreszenz zur Detektion der GFP-Expression und deren Kolokalisation mit Markern für motorische Neuronen.
Hauptergebnisse
- Die Injektion von rAAV9-miR-298 in die Schwanzvene führte zu einer anhaltenden und weiträumigen Überexpression von miR-298 in der Skelettmuskulatur und in motorischen Neuronen.
- Die Expression von miR-298 erreichte in der Skelettmuskulatur acht Wochen und im Rückenmark zwölf Wochen nach der Injektion ihren Höhepunkt.
- Ein GFP-Reporter bestätigte eine erfolgreiche Transduktion und eine räumliche Überschneidung mit Markern motorischer Neuronen.
- Behandelte SBMA-Mäuse zeigten im Vergleich zu Kontrolltieren eine verbesserte Gewichtszunahme und bessere motorische Leistung.
- Die quantitative RT-PCR zeigte eine Verringerung der AR-Transkriptmengen in den betroffenen Geweben nach der Behandlung.
Schlussfolgerungen
- Die systemische Verabreichung von miR-298 mittels rAAV9 ist wirksam bei der gezielten Behandlung von Skelettmuskulatur und Motoneuronen bei SBMA-Mäusen.
- Die Überexpression von miR-298 verbessert neuromuskuläre Phänotypen und senkt die Spiegel der pathogenen AR-Transkripte.
- Dieser Ansatz zeigt das Potenzial von auf miRNA basierenden Gen-Silencing-Strategien zur Behandlung neuromuskulärer Erkrankungen, die durch toxische Gain-of-Function-Mutationen verursacht werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die systemische Verabreichung von miRNA mittels rAAV9-Vektoren ermöglicht eine gezielte Gen-Silenzierung in neuromuskulären Geweben und trägt damit einer zentralen Herausforderung bei der therapeutischen RNA-Interferenz für toxische Gain-of-Function-Erkrankungen Rechnung. Dieser Ansatz unterstützt eine vorhersagbare Sicherheit hinsichtlich der Zielstrukturen und der Messung funktioneller Ergebnisse und beeinflusst somit direkt Entscheidungen in der frühen Entdeckungsphase und im translationalen Entwicklungsprozess. Die Fähigkeit des Verfahrens, eine dauerhafte, gewebespezifische Modulation von Krankheitsgenen zu erreichen, stellt es als wiederverwendbare Plattform für Innovationen in der Gentherapie innerhalb von neuromuskulären Erkrankungsportfolios dar.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Untersuchung der Funktion von Krankheitsgenen durch miRNA-vermittelte Stilllegung in vivo.
- Unterstützt die biologische Risikominimierung, indem die Targetbindung in relevanten Geweben nachgewiesen wird.
- Erleichtert eine vorhersagbare Zuversicht bei der Überprüfung therapeutischer Hypothesen für neuromuskuläre Erkrankungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Erstellt validierte Tiermodelle für nachgeschaltete Verhaltens- und molekulare Analysen.
- Standardisiert die Applikation und Quantifizierung von Gen-Silencing-Agensien über Kohorten hinweg.
- Ermöglicht die reproduzierbare Messung motorischer Funktionen und der Transkriptreduktion als quantitative Endpunkte.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Anbindung an krankheitsrelevante Modelle zur translationellen Biomarker-Entwicklung.
- Gewährleistet Kontinuität von der mechanistischen Entdeckung bis zur präklinischen Wirksamkeitsbewertung.
- Unterstützt eine risikoadjustierte Weiterentwicklung durch die Verknüpfung molekularer und funktioneller Endpunkte.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese systemische miRNA-Übertragungsmethode verbindet die frühe Entdeckung, die Zielvalidierung und die präklinische Wirksamkeitsbewertung in Modellen neuromuskulärer Erkrankungen.
- Entdeckungsbiochemie: Demonstriert die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen in vivo für toxische Funktionserweiterungsziele.
- Screening: Stellt die Bereitschaft und Reproduzierbarkeit von Assays für verhaltensbezogene und molekulare Endpunkte sicher.
- Analytik: Bietet quantitative RT-PCR- und Verhaltensauswertungen für den Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verknüpft die Wirksamkeit der Genstilllegung mit funktioneller Verbesserung in krankheitsrelevanten Systemen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine skalierbare Plattform zur Bewertung weiterer miRNA-Kandidaten oder Krankheitsziele.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei Gentherapiestrategien.
- Operationaler Wert: Ermöglicht standardisierte, skalierbare und reproduzierbare Genmodulation in vivo.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen und verbessert die Kapitalnutzungseffizienz durch die Verknüpfung molekularer und phänotypischer Ergebnisse.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Gentherapiekandidaten für neuromuskuläre Indikationen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Herstellung viraler Vektoren und in Methoden zur In-vivo-Applikation.
- Benötigt Zugang zu Infrastruktur für quantitative molekulare und verhaltensbezogene Analysen.
- Setzt eine standardisierte Durchführung von Injektionsverfahren, Gewebeentnahme und Analyseprotokollen über mehrere Arbeitsgruppen hinweg voraus.
- Kann je nach miRNA-Sequenz oder Krankheitsmodell anpassungsbedürftig sein.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Dosierung des Vektors, die Gewebespezifität und die Überwachung der Langzeitexpression.
