Name: Systemische Lieferung von MicroRNA mit rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 zur Behandlung von neuromuskulärer Erkrankungen bei Nagern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Erfahren Sie die systemische Lieferung von MicroRNA mit rekombinantem AAV9 zur Behandlung neuromuskulärer Erkrankungen bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht gezielte Gentherapie durch RNA-Interferenz in Skelettmuskulatur und Motorneuronen.

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Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt. Wir danken SignaGen Laboratories (Rockvile, MD, USA) für das AAV9-Virus-Produktion. Diese Forschung wurde durch das intramurale Forschungsprogramm der NINDS, NIH unterstützt. Philip R. Lee wurde aus der Division von intramuralen Forschung NICHD Mitteln unterstützt. Carlo Rinaldi wurde durch ein Stipendium von der Association Française Contre Les Myopathien (AFM) unterstützt.

Alle Verfahren wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den nationalen Instituten der Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren (8. Aufl., National Academies Press überarbeitet 2011), und von der NINDS Animal Care Committee genehmigt worden.
1. AAV9-MiRNA Design Strategie und MiRNA-Auswahl
<ol><li>Verwenden Sie MiRWalk prädiktive Datenbank Kandidat MiRNAs auswählen, die mit der mRNA 3' UTR Region des Zielgens interagieren. 15 Hinweis: Beschränken Sie minimale Samen Länge der MiRNA-Sequenz auf mindestens 7 Nukleotide. Wählen Sie andere etablierte MiRNA Vorhersage Programme (MiRanda, MiRDB, Zielscan) für die vergleichende Analyse. Basierend auf diesen Auswahlkriterien, wurden hier, MiR-185, MiR-298, MiR-873 und MiR-877 zur weiteren Auswertung ausgewählt.</li>
	<li>Die Reihenfolge der ausgewählten MiRNA aus MiRBase (http://www.mirbase.org/) abrufen.</li>
	<li>Klonen die Pri-Mir (60-70 Nts) und seine 250-300 Nts flankierende genomischen Sequenz auf beiden Seiten oder eine mock Sequenz, in der entsprechenden AAV GUS Vektor. Hinweis: Die flankierende Sequenz ist für korrekte Pri-Mir Ausdruck und Reife MicroRNA Verarbeitung erforderlich. Wählen Sie einen Dual-Promotor rAAV GUS-Vektor mit einer Expressionskassette bestehend z. B. aus menschlichen Dehnung Faktor-1 Alpha (EIF1α) Förderer gefolgt von dem ausgewählten MiRNA oder mock-Sequenz, und der Projektträger menschliches Cytomegalovirus (CMV) gefolgt von cDNA Kodierung das GFP fluoreszierende Tag. Der Veranstalter EIFα wurde gewählt, weil es stabile und homogene Ausdruck, mit minimalen Risiken der zum Schweigen zu bringen garantiert. Gewebe-spezifische oder bedingte Promotoren können je nach spezifischen Anwendungen verwendet werden.</li>
	<li>Bereiten Sie vor, reinigen Sie und Titrieren Sie AAV, folgenden veröffentlichten Protokolle. 16 Hinweis: Hier wurden Klonen der Pri-Mir in der AAV Vektor und virale Produktion von einem externen Hersteller durchgeführt.</li>
</ol>(2) Tail Vene Injektion von AAV-MiRNA Plasmid
Hinweis: Dieser Schritt braucht Regulierung je nach Alter und Gewicht der Mäuse das Zielgen. Verwenden Sie die institutionelle und Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) Richtlinien der Dosisbereich, Volumen und beste Art der Verabreichung, basierend auf Alter und Gewicht der Mäuse zu bestimmen. GFP Fluoreszenz-Signal und MiRNA Ausdruck Niveaus im Zielgewebe sollen Gipfel ab 2 Wochen nach der Injektion. Das folgende Protokoll bezieht sich auf männliche Mäuse im frühen Erwachsenenalter. AAV sollte als ein Biohazard unter Biosafety Level 1 Richtlinien behandelt werden.
<ol><li>Unterteilen Sie AAV-MiRNA Plasmid Lager in 100-200 µL Aliquots, enthält eine Viruslast von 1010-1011 virale Genom pro mL (Vg/mL) mit steriler Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Labor Biohazard persönlicher Schutzausrüstung sollte verwendet werden, um die AAV-Lösung zu behandeln. Hinweis: Wenn ein Aliquot aufgetaut ist kann es bei 4 ° C bis zu zwei Wochen aufbewahrt werden. Virale Lager kann bei-80 ° C Gefrierschrank gespeichert werden.</li>
	<li>Bändigen Sie die Maus in handelsüblichen wachstumsbefürworter wie Kunststoff oder konische Kunststoff-filmschlauchs der richtigen Größe.</li>
	<li>Reinigen Sie die Oberfläche des Hecks mit 70 % Alkohol abwischen.</li>
	<li>Halten Sie eine warmen Pad (28-30 ° C) unter der Rute zu Vasodilatation für 30 s. Alternativ, wärmen die Tiere mit einer roten Wärmelampe (in einem Abstand von 2-3 Fuß) oder durch die Rute ins warme Wasser eintauchen.</li>
	<li>
Ausgehend von den distalen Teil des Hecks, Stechen Sie die Nadel (27-30 G) mit der viralen aliquoten geladen, Abschrägung, 15° vom Heck in die Vene. Vor der Injektion stellen Sie sicher, dass die Nadel richtig eingesetzt ist.
	<ol>
<li>Wenn Widerstand zu beim Einspritzen spüren ist oder Schwellungen unter der Haut erscheint, beenden Sie das Verfahren. Die Nadel entfernen und wieder einsetzen der Nadel oberhalb der bisherigen Injektionsstelle. Hinweis: Alternativ kann dies durch die Nadel vorsichtig Absaugen und Beobachtung Blut erreicht werden. Harte Aspiration kann die Rute Vene zusammenbrechen. Wenn die Vene beim Einspritzen blanches, wird die Nadel korrekt eingefügt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach die Injektion abgeschlossen ist, warten Sie ein paar Sekunden vor dem Auslösen der Nadelöhrs.</li>
	<li>Beobachten Sie die Injektionsstelle für Blutungen. Mäßiger Druck mit zwei Fingern auf die Website, bis die Blutung stoppt.</li>
	<li>Das Tier in seinen Käfig zurück.</li>
</ol>(3) Verhaltens Assays
Hinweis: Durch einen Dritten mit Verschleierung der Behandlungen durch eindeutig codierten Fläschchen wurden blind alle Experimente durchgeführt. Reihenfolge der Behandlungen war randomisiert. Wenn Sie die nachfolgend beschriebenen Tests durchführen, sollte Versuchsbedingungen (Zimmertyp) und der Tageszeit kontrolliert werden, um Schwankungen zu reduzieren. Dieser Test sollte durchgeführt werden, an Mäusen, die älter als vier Wochen, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Maus wurde behavioral Beurteilung einmal vor viralen Injektion bei 5 Wochen alt, Überblick über normale Leistung zu erhalten. Nach viralen Injektion wurden Mäuse einmal wöchentlich ab 48 h nach der Injektion bis zum Alter von 40 Wochen bewertet.
<ol><li>Bringen Sie die Maus zu einem ruhigen, dunklen Raum, das frei von Lärm oder andere Störungen mindestens 30 min vor Beginn der Tests mit AAV injiziert. Stören Sie die Tiere nicht während dieser Zeit der Akklimatisierung.</li>
	<li>Akklimatisieren Sie die Maus, um den neuen Raum für 30 min und starten Sie dann die folgenden Verhaltens Assays (Schritt 3.3 und 3.4). Halten Sie einen Abstand von 10 Minuten zwischen jedem Verhaltens Assay.</li>
	<li>
Hängende Kabel test Hinweis: Dieser Test überwacht Muskelkraft und motorische Störungen.<ol>
<li>Verwenden Sie eine Polsterung Blatt als Sitzkissen zu handeln. Heben Sie die Maus durch seinen Schweif, und legen Sie sie in der Mitte des Rasters Drahtzahnstange. Heben Sie das Rack 15-20 Zoll über der Oberfläche und kehren Sie langsam den Bildschirm, um das Tier seinen Griff auf dem Bildschirm anpassen kann.</li>
		<li>Sobald das Rack komplett invertiert ist, der Timer gestartet wird, und notieren Sie die Zeit zu fallen. Hinweis: Mäuse werden auf einem Raster mit vier Gliedmaßen hängen. Wenn der Draht zu niedrig eingestellt ist können die Mäuse nicht hängen. Wenn Mäuse aus dem Netz vor 60 fallen s, legen Sie sie wieder am Netz, den Timer zurückgesetzt, und wiederholen Sie diesen Vorgang bis zu zwei weitere Versuche. Registrieren Sie die beste Leistung.</li>
		<li>Wenn die Frist von 60 s erreicht ist, wird das Tier zurück in den Käfig zurück.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fuß-print-assay Hinweis: Die saugfähige Blatt einer schmalen Landebahn ca. 70 cm lang und 5 cm breit mit 5 cm hohen Mauern sollte.<ol>
<li>Halten Sie die Maus vorsichtig mit einer Hand und Auftragen Sie roter Tinte auf Vorderpfoten und blauer Tinte, die Hinterpfoten mit einem Pinsel.</li>
		<li>Legen Sie die saugfähige Blatt, auf dem Boden einer schmalen Landebahn.</li>
		<li>Lassen Sie die Maus zu gehen oder laufen über ein saugfähiges Blatt in einer geraden Linie in der Start-und Landebahn von einem Ende zum anderen.</li>
		<li>Wiederholen Sie den Vorgang zwei weitere Male mit der Maus mit einem frischen saugfähigen Blatt.</li>
		<li>Messen Sie den Abstand zwischen zwei aufeinander folgenden Schritten in der Vorwärtsbewegung. Gehören Sie zunächst nicht und dauern Sie wenige Fußspuren, wo das Tier nur initiieren und Veredelung seinen Lauf.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) Sterbehilfe und Gewebe-Ernte
<ol><li>Verwenden Sie eine Euthanasie-Kammer oder einer Glasglocke. Wenn eine Glasglocke verwenden, führen Sie die unter einem Abzug.</li>
	<li>Genießen Sie Baumwolle mit Isofluran und legen Sie sie in die Glasglocke. Verwenden Sie eine physische Trennzeichen, um das Tier von Körperkontakt mit dem Anästhesie-Material zu halten. Legen Sie das Tier in das Glas sofort nach diesem Schritt. Hinweis: Die Glasglocke sollte nicht vorgeladen mit Isofluran zur Vermeidung von Hypoxämie bei den Tieren sein.</li>
	<li>Weiter Isofluran Exposition bis 30 s nach Atmung stoppt.</li>
	<li>Sofort nach dem entfernen die Maus aus dem Glas einschläfern durch zervikale Dislokation. Hinweis: Dieser Schritt sollte so schnell wie möglich zum Abbau des Gewebes zu vermeiden statt.</li>
	<li>
Ernte das Rückenmark zuerst und dann die Quadrizeps skelettartiger Muskel.
	<ol>
<li>Um das Rückenmark zu ernten, setzen Sie die Rückseite der Maus und befestigen Sie die vier Gliedmaßen auf der Seite um eine Dissektion Board.</li>
		<li>Waschen Sie die Website der Dissektion mit 70 % Ethanol.</li>
		<li>Führen Sie durch zervikale Dislokation mit einer scharfen Schere.</li>
		<li>Machen Sie einen Schnitt in der Haut in der Mittellinie. Entfernen Sie das Fell durch Schneiden oder vorsichtig Aufreißen der Haut in der Querebene, gefolgt von das Fell, und über den Kopf ziehen. Entfernen Sie den Kopf durch das Schneiden mit der Schere unter den Schulterblättern und an die C1-2-Region der Spalte (angrenzend an der Schädelbasis zu finden).<ol>
<li>Die Muskulatur der Bauchwand auf der ventralen Seite geschnitten und weiter seitlich, eine Richtung zu einem Zeitpunkt, bis die Wirbelsäule erreicht ist.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verwenden eine scharfe Schere entfernen Wirbel des zervikalen Rückenmarks ab. Entfernen Sie die seitlichen Teile der Wirbel durch Schneiden über die vertebralen Bögen auf beiden Seiten.</li>
		<li>Lassen Sie nach dem Entfernen der ganze Wirbel das Rückenmark.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Snap freeze der geernteten Gewebe in vorgekühlt 2-Methylbutane mithilfe der folgenden Methode:
	<ol>
<li>Die Hälfte füllen Sie eine Schale aus Edelstahl mit 2-Methylbutane und Tauchen Sie die unteren Viertel der Schüssel in einem Behälter mit flüssigem Stickstoff gefüllt.</li>
		<li>Pre-chill 2-Methylbutane in flüssigem Stickstoff für 1-2 min.</li>
		<li>Legen Sie der Skelettmuskulatur mit der Pinzette in die 2-Methylbutane, bis es weiß wird. Sofortüberweisung des Gewebes zu Trockeneis und speichern Sie es dann bei-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Für Rückenmark Immunostaining Einbetten des Gewebes in Paraffin-Blöcke bei Raumtemperatur vor Snap Einfrieren, wie beschrieben. 17
</li>
	<li>Für die biochemische Analyse und Quantifizierung der MiRNA1 legen Sie die geerntete Gewebe in ein Cryoröhrchen und Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Speichern Sie die Proben bei-80 ° C.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier zeigen wir eine hocheffiziente und zugänglich Methodik um auszuwählen und liefern über Heck Injektion eine MiRNA mit rAAV9 als viraler Vektor Skelettmuskulatur und motorischen Neuronen in den Mäusen. 14 im Vergleich zu anderen RNAi-Strategien, sind MiRNAs weniger giftig und weniger immunogen. 18 darüber hinaus ihre geringe Größe machen sie gut geeignet, um die begrenzten Verpackungskapazität von viralen Vektoren. 2 numerische Algorithmen und Vorhersage Werkzeuge ermöglichen die Identifizierung von vermeintlichen MiRNA-mRNA Zielen. Einmal identifiziert, müssen die Auswirkungen der MiRNA auf Ziel Genexpression nachgewiesen werden. Ein gemeinsamer Ansatz ist einer bestimmten MiRNA in Vitro overexpress und Protein Ausdruck Zielwerte mit westlichen Analyse zu erkennen. 14 , 19
Verschiedene Studien haben virale und nicht-viralen Strategien verwendet, für die Bereitstellung von MiRNAs. 13 hier wir Adeno-assoziierte Virus (AAV) als gen Lieferung-Tool verwendet. Im Vergleich zu anderen viralen Vektoren, AAV entlockt niedrige Immunogenität ermöglicht langfristige Gentransfer, und hat ein breites Spektrum an Tropismus zu Spalten und nicht-teilenden Zellen. 18 diese Versandart kann auch die Notwendigkeit einer chemischen Veränderung umgehen, die Funktionalität und die Spezifität der RNS-Molekül beeinträchtigen können. Es gibt mehrere Serotypen der AAV, die meist durch die Zusammensetzung der Kapsid-Proteine bestimmt werden. Diese Serotypen unterscheiden sich in ihren Tropismus und transduzieren verschiedener Zelltypen. Es ist notwendig, die korrekte Serotyp auszuwählen, wenn man bedenkt das Zielgewebe. Wir haben rAAV9, aufgrund seiner hohen Transduktion Effizienz in das zentrale Nervensystem und Skelettmuskulatur nach peripheren Verwaltung19,20. Dieser Ansatz hat größere Transduktion Wirksamkeit bei Neugeborenen Tieren im Vergleich zu erwachsenen Tieren, wahrscheinlich wegen der Unterschiede in der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix, Neuron-Glia-Verhältnis und Reife der Blut-Hirn-Schranke gezeigt. 21 , 22
Ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll ist das Design des Expressionsvektors. Im Vergleich zu Bicistronic Vektoren, die durch niedrigere Ausdruck des zweiten Gens im Vergleich mit dem ersten Gen neben der Projektträger behindert sind, ermöglicht der dual Promotor Vektor eine kaskadierende Konfiguration so hohe Expression der MiRNA und EGFP, nachgeben Lokalisierung von der MiRNA ermöglicht im Maus-Gewebe durch Immunfluoreszenz.
Intravenöser Injektion von AAV9 führte zu hohen Wirkungsgrad und homogene Transduktion in den Zielgeweben, Skelettmuskel und motorischen Neuronen. Diese Route der Injektion ermöglicht der verabreichte Dosis zu erreichen die systemische Zirkulation und Hirn-Schranke das Blut, das für Therapien, die auf das zentrale Nervensystem wichtig ist. Darüber hinaus ist es eine nicht-invasive Methode zur Auslieferung an die CNS. MiR-298 Ausdruck erhöht in das Rückenmark und Muskel nach 2-4 Wochen mit einer einzigen peripheren Injektion bei 5 Wochen alt. Wenn mit einsträngiger Genom AAV Vektoren, die de-Novo -Synthese des zweiten DNA-Strang für die verzögerte Transduktion ausmachen können. 23
Ebenen der menschlichen MiR-298 waren nicht nachweisbar im behandelten Mäuse 20 Wochen nach einer einzigen Verwaltung, darauf hindeutet, dass bei chronischen Erkrankungen, mehrere Injektionen erforderlich, um einen therapeutischen Nutzen zu erreichen. Jedoch kann die MiRNA Verschlechterung im Laufe der Zeit Begrenzung wenn ein lebenslange wiederholter Verabreichung erforderlich ist. Darüber hinaus kann adaptive Immunität gegen AAV-Vektoren ein weiteres Hindernis für eine erfolgreiche gen-Lieferung bilden. 24 so Generation der AAV-Vektoren, die immunologisch inerten ist entscheidend für wiederholter Verabreichung und langfristige Effekte mit diesem vielversprechenden-Delivery-System zu erreichen. 25
Eine Beschränkung auf die Verwendung von MiRNA als therapeutische Strategie ist das Risiko von Ziel-Effekten. MiRNAs können durch incomplementary Basenpaarung mit anderen gen-Transkripte, die eine Sicherheit Gefahr mit diesem Ansatz interagieren. Verbesserte Gestaltung der RNAi-Sequenzen, einschließlich der Verwendung von nicht-kanonischen MiRNAs, z. B. Mirtrons, das umgehen des Mikroprozessor-komplexes und umfangreiche Sicherheits- und Verträglichkeitsprofil Langzeitstudien kritisieren vor der Umsetzung dieser Strategie in eine sichere und effektive Therapie. 26 , 27 , 28
Die hier beschriebene Methode wurde ursprünglich für MiRNA Überexpression entwickelt, aber es kann auch für MiRNA Hemmung Therapie mit antagomire genutzt werden.

MiRNAs sind nicht-RNAs, 21-23 Nukleotide in der Länge, Codierung, die eine wichtige bei der Regulation der Genexpression und Kontrolle der verschiedenen zellulären und metabolische Bahnen Rolle. 1 Genexpression wird hauptsächlich durch Induktion posttranskriptionelle gen zum Schweigen zu bringen oder mRNA Abbau reguliert. 2 MiRNAs ergänzen sich in der Regel um die 3' untranslatierten Region (UTR) Kodierung Gene, obwohl binden an den 5' UTR und Codierung Regionen des Ziels, die mRNA auch beschrieben worden ist. 3
Das gegenwärtige Verständnis der Rollen von MiRNA in der Pathogenese von Krankheiten des Menschen dehnt sich aus, wird pharmakologische Modulation der einzelnen MiRNAs oder MiRNA-Familien zunehmend eine sinnvolle therapeutische Option. Im Vergleich zu anderen RNA Hemmung Strategien, MiRNAs haben viele Vorteile: MiRNAs sind weniger toxisch und weniger immunogen und können leicht in Zellen aufgrund ihrer geringen Größe geliefert werden. 4 , 5 , 6 MiRNAs haben in der Regel viele Ziele innerhalb von Mobilfunknetzen, daher mögliche Ziel-Effekte und Sicherheitsbedenken müssen berücksichtigt werden, zusammen mit effizienten Auslieferung an Zielgeweben.
Neuromuskuläre Erkrankungen sind erworben oder geerbt Bedingungen, die Muskel- und motorischen Neuronen beeinflussen. Die Ausrichtung der Drogen in Skelettmuskeln ist eine aufstrebende Gebiet der Forschung, wo die größte Herausforderung ist, weite Verbreitung innerhalb des therapeutischen Fensters zu erreichen. 7 Motoneuronen sind schwieriger zu Zielen, vor allem, weil Zugang zu Medikamenten, durch die Blut-Hirn-Schranke verwehrt ist.
Kultur und Maus zellmodelle bulbärer und Spinale Muskelatrophie (SBMA) wurden in dieser Studie verwendet. SBMA ist eine neuromuskuläre Erkrankung, verursacht durch einen giftigen Gewinn Funktion Mechanismus, in dem Muskel und motorischen Neuronen betroffen sind. 8 , 9 SBMA (Kennedy-Krankheit; OMIM #313200) ist eine X-chromosomale Krankheit, gekennzeichnet durch Muskelschwäche und Atrophie, verursacht durch CAG Wiederholung Expansion in das AR-gen, das eine erweiterte Trinukleotiderkrankungen-Darm-Trakt in der AR -Protein kodiert. 10 keine krankheitsmodifizierende Therapie ist derzeit verfügbar für diese Störung. In dieser Studie verwendeten transgenen Mausmodell rekapituliert die Merkmale der Krankheit, einschließlich Geschlecht Spezifität, Motoneuron Pathologie und progressive Muskelatrophie. 11
In dieser Studie, unser konzentriert auf die Ermittlung eines MiRNA, die direkt herunterreguliert Ausdruck der mutierten AR Transgen und auf eine sichere und effiziente Art der Lieferung von MiRNA zum Rückenmark und Skelettmuskulatur von unserer Krankheit-Maus-Modell entwerfen.
Hier haben wir eine relativ fußgelenkes MiRNA, MiRNA-298 (Zbl-Nummer MIMAT0004901),12 , mutierte AR Ausdruck in SBMA Modellen direkt zu reduzieren. Um Lieferung von MiR-298 an Zielgeweben zu erreichen, verwenden wir eine virale Strategie mit rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 (rAAV9). rAAV9 ist in der Lage, die Blut-Hirn-Schranke und langfristige Genexpression in nicht-teilenden Zellen, einschließlich Neuronen zu vermitteln. 13 eine einzelne systemische Verabreichung von AAV9-MiR-298 führte zu nachhaltigen Ausdruck der MiRNA, effizienten Transduktion von Muskel- und motorischen Neuronen, Down-Regulierung der AR Ausdruck und Besserung der Krankheit Phänotyp bei SBMA Mäusen. 14 dieser Methodik lässt sich MiRNA oder antagomire Überexpression in Vivozu bieten.

<table><tbody><tr><td>QIAzol Lysereagenz</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Lyse von Fett- und Standardgeweben vor der RNA-Isolierung</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Aufreinigung von miRNA und Gesamt-RNA</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transkriptionskit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4366596</td><td>Ein hochspezifisches Kit, das nur reife miRNAs quantifiziert</td></tr><tr><td>snoRNA202 Primer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1232</td><td>Taqman miRNA-Kontrollassay in der Maus</td></tr><tr><td>miR-298 Primer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2190</td><td>Taqman miRNA-298 Assay in der Maus</td></tr><tr><td>Anti-GFP-Antikörper</td><td>abcam</td><td>ab290</td><td>Kaninchen polyklonal zu GFP - ChIP-Qualität</td></tr><tr><td>Rotes Stempelkissen</td><td>Dovecraft Essentials</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blaues Stempelkissen</td><td>Dovecraft Essentials</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV9-GFP Vektor</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100840</td><td>Herstellung, Verpackung und Reinigung von AAV-Plasmiden in großem Maßstab</td></tr><tr><td>mmu-miR-298-5p</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MC12525</td><td>mirVana miRNA-imitiert</td></tr><tr><td>AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP</td><td>Vector Biosystems Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

systemische lieferung von microrna mit rekombinanten adeno-assoziierten virus serotyp 9 zur behandlung von neuromuskulärer erkrankungen bei nagern

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

RNA-Interferenz über den endogenen MiRNA Weg regelt Genexpression durch die Kontrolle der Proteinsynthese durch posttranskriptionelle gen-silencing. In den letzten Jahren hat die MiRNA-vermittelten Genregulation Potenzial für die Behandlung von neurologischen Störungen, verursacht durch einen giftigen Gewinn der Funktion Mechanismus gezeigt. Effiziente Bereitstellung zum Zielgewebe sind jedoch seine Anwendung begrenzt. Hier haben wir einem transgenen Mausmodell für bulbärer und Spinale Muskelatrophie (SBMA) verwendet, eine Neuromuskuläre Krankheit verursacht durch Trinukleotiderkrankungen Expansion in den Androgenrezeptor (AR), testen Sie gen-silencing durch eine neu identifizierten AR-targeting MiRNA, MiR-298. Wir überexprimiert MiR-298 mit einem rekombinanten Adeno-assoziierte Virus (rAAV) Serotyp 9 Vektor Transduktion von nicht-teilenden Zellen zu erleichtern. Eine einzige Rute-Vene-Injektion bei SBMA Mäusen induziert nachhaltig und weit verbreitete Überexpression von MiR-298 im Skelettmuskel und motorischen Neuronen und führte zu Verbesserung der neuromuskulären Phänotyp in den Mäusen.

Eine Viruslast von 1011 Vg von AAV9-MiR-298 wurde durch eine einzige Rute-Vene-Injektion in 5 Wochen alten SBMA Mäuse injiziert. Diese Mäuse tragen das menschliche AR Transgen mit abnorm erweiterte Trinukleotiderkrankungen-Darm-Trakt in der AR (AR97Q) und Anzeichen für neuromuskuläre Erkrankungen mit 10 Wochen alt (Gewichtsverlust, Rundrücken und Muskelatrophie) zu entwickeln. 11 lumbar Rückenmark und Quadrizeps bei 2, 4, 8 und 12 Wochen nach der Verabreichung für MiRNA Quantifizierung, biochemische Tests und Immunohistochemistry (Abbildung 1) geerntet wurden. Verwaltung der Behandlung und die nachfolgende Analysen wurden durch verblindeten Untersucher durchgeführt.
qRT-PCR-Analyse zeigte MiR-298 Ausdruck in der Skelettmuskulatur und des Rückenmarks, zwei und vier Wochen nach der Behandlung bzw. mit Spitzenwerten Ausdruck nach 8 Wochen in der Skelettmuskulatur und 12 Wochen im Rückenmark nach der Injektion (Abbildung 2 ). Unter Verwendung eines Mikroskops (Axiovert 100 M), war grünes Fluoreszenzsignal röntgenologisch im Muskelgewebe und im spinalen Motorneuronen Co Lokalisierung von GFP und das Motoneuron Marker Cholin-Acetyltransferase (ChAT) 10 Wochen nach der Behandlung, wenn die Mäuse zu zeigen beginnen Manifestationen der Krankheit (Abbildung 2).
Mit der gleichen Dosierung, war eine Kohorte der SBMA Mäuse randomisiert entweder MiR-298 oder verspotten 7 Wochen alt über Heck Vene Injektion für Biochemische Analysen und funktionelle Charakterisierung. Injektion wöchentlich Gewicht und Verhaltensstörungen Bewertung zu 40 Wochen alt folgte. qRT-PCR-Analyse zeigte, dass MiR-298 Behandlung verringert das Niveau der Mutant AR in den betroffenen Geweben (Abbildung 3), und Körpergewicht erhöht und Motorleistung (Abbildung 4 verbessert) 10 Wochen nach der Injektion ab.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Studiendesign. Zum Ausdruck von MiR-298 in vivo erhöhen injiziert wir SBMA Mäuse mit (A) der dual-Promoter AAV Vektor Plasmid mit dem Ausdruck GFP und MiR-298 oder Mock. (B) Mäuse wurden über eine einzige Rute eitel Injektion bei 7 Wochen alt (präsymptomatischen Stadium) injiziert. Rückenmark und Quadrizeps wurden aus einer Kohorte von SBMA Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten für Gewebe Verteilungsanalyse (Grüne) erhoben. Eine Kohorte von SBMA Mäusen wurde behandelt und auf 16 Wochen alt für Biochemische Analysen (rot) geopfert. Gewicht und Verhaltensstörungen Assays wurden wöchentlich bis zu 40 Wochen alt für funktionelle Charakterisierung (blau) durchgeführt. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55724/55724fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig2.jpg"> Abbildung 2: AAV9-MiR-298 Lieferung bei Mäusen. Mit der beschriebenen Methode hier, erhielten Mäuse entweder AAV9-MiR-298-GFP oder AAV9-Mock-GFP durch intravenöse Injektion. Insgesamt MiRNA war von lumbalen Rückenmarks und Quadrizeps bei 2,4,8 und 12 Wochen nach der Injektion gesammelt. qRT-PCR wurde durchgeführt, um den Ausdruck von MiR-298 in (A) Quadrizeps einschätzen (n = 5) (B) Lendenwirbelsäule Rückenmark (n = 5, P < 0,01). Alle Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler bedeutet gemeldet. Die weit verbreitete Transduktion des AAV Vektors in Geweben, die 10 Wochen nach Behandlung durch Lokalisierung der Färbung für GLP in der Quadrizeps (C) (ursprüngliche Vergrößerung, 10 X. bestätigt wurde geerntet Maßstabsleiste = 100 µm) und (D) Motoneuronen im lumbalen Rückenmarks (original 40 X Vergrößerung. Maßstabsleiste = 10 µm. GFP (grün), ChAT (rot) und DAPI (blau). Die Figur verändert wurde, vom Doi: 10.1038/mt.2016.13. 14 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55724/55724fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig3.jpg"> Abbildung 3: MiRNA-298 Überexpression herunterreguliert Mutant AR in Rückenmark und Quadrizeps bei Mäusen. qRT-PCR wurde durchgeführt, um Ausdruck Niveaus der AR-mRNA in Lendenwirbelsäule Rückenmark (A) und (B) Quadrizeps behandelt mit AAV9-MiR-298-GFP oder AAV9-Mock-GFP zu schätzen. Transkript Ebenen wurden auf snoRNA202 normalisiert (n = 5 pro Behandlung). * P < 0,05, ** P < 0,01. Alle Daten werden als ± Standardfehler bedeutet gemeldet. Die Figur verändert wurde, vom Doi: 10.1038/mt.2016.13. 14
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55724/55724fig4.jpg"> Abbildung 4: MiR-298 Überexpression verbessert die Motorik und Gewichtsverlust reduziert. Verhaltens wurde einmal in der Woche (w), zwischen 5 bis 40 Woche durchgeführt. Body-Gewicht (links) und hängende Kabel (rechts) Leistung von Mäusen (n = 15 pro Gruppe). Alle Daten werden als ± Standardfehler bedeutet gemeldet. Die Figur verändert wurde, vom Doi: 10.1038/mt.2016.13. 14

Hier beschreiben wir die Lieferung von MicroRNA verwenden ein rekombinantes Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 in einem Mausmodell der neuromuskulären Erkrankungen. Eine einzelne periphere Verabreichung bei Mäusen führte zu nachhaltigen MiRNA Überexpression in Muskel und motorischen Neuronen, bietet eine Möglichkeit, MiRNA Lernfunktion und therapeutische Potenzial in Vivo.

Systemische Lieferung von MicroRNA mit rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 zur Behandlung von neuromuskulärer Erkrankungen bei Nagern

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, ein Mikro-RNA mittels eines rekombinanten Adeno-assoziierten Vektorvirus auszuwählen und zu übermitteln. Anschließend wird es an die Skelettmuskulatur und die Motoneuronen von Mäusen übertragen, um die Wirksamkeit bei der Verbesserung von Krankheitsphänotypen zu bewerten. Diese Methode kann helfen, die wichtige Frage zu beantworten, ob eine auf Mikro-RNA basierende Stilllegungsstrategie zur Behandlung neuromuskulärer Erkrankungen eingesetzt werden kann.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der Verwendung des Adeno-assoziierten Serotyp 9-Virus, um ein Mikro-RNA über die systemische Zirkulation an das Rückenmark und die Skelettmuskulatur von Mäusen zu liefern und direkt ein Zielkrankheitsgen zu stillen. Teilen Sie die AAV-Mikro-RNA-Plasmidlösung in Aliquots von 100 bis 200 Mikroliter auf, die eine Viruslast von zehn bis hundert Billionen Genomen pro Milliliter enthalten. Laden Sie anschließend ein Aliquot in eine Spritze und befestigen Sie eine Nadel mit einer Größe von 27 bis 30 Gauge. Fixieren Sie nun mit Hilfe eines standardmäßigen Maushalters eine Maus, sodass der Schwanz freiliegt. Reinigen Sie anschließend den Schwanz mit 70 %igem Alkohol und legen Sie etwa 30 Sekunden lang ein warmes Pad unter den Schwanz, um die Vasodilatation zu fördern. Stechen Sie danach im distalen Bereich des Schwanzes mit der Schräge der Nadel nach oben und in einem flachen Winkel von etwa 15 Grad in die Schwanzvene ein.Danach injizieren Sie das Virus und warten einige Sekunden, bevor Sie die Nadel entfernen. Nach dem Entfernen der Nadel üben Sie mit zwei Fingern mäßigen Druck aus, um eventuelle Blutungen zu stoppen. Anschließend bringen Sie das Tier in seinen Heimkäfig zurück.Während der Injektion in die Schwanzvene ist es nicht unüblich, einen Blutblitz im Nadelschaft zu sehen. Beim Injizieren sollte kein Widerstand spürbar sein. Wenn der Schwanz blass wird und anschwillt, nehmen Sie die Nadel heraus und versuchen Sie es erneut proximal zur vorherigen Einstichstelle.Für diese Tests sollten die Mäuse älter als vier Wochen sein, und es ist darauf zu achten, vor der Behandlung eine Basislinienmessung durchzuführen. Der Testraum sollte ruhig und dunkel sein, ohne Störungen. Die Mäuse sollten mindestens 30 Minuten vor Durchführung der Tests in den Raum gebracht werden.Stören Sie die Tiere während dieser Akklimatisierungsphase nicht. Beginnen Sie mit dem Hängetest am Drahtgitter. Heben Sie die Maus am Schwanz auf und platzieren Sie sie in die Mitte des Drahtgitters. Anschließend heben Sie das Gitter um 15 bis 20 Zoll an und kippen Sie den Schirm langsam um, um der Maus Zeit zu geben, ihren Griff anzupassen. Sobald das Gitter vollständig umgekehrt ist, starten Sie die Stoppuhr und notieren Sie die Zeit bis zum Herunterfallen. Lassen Sie der Maus 60 Sekunden, um sich festzuhalten; falls sie früher herunterfällt, bringen Sie sie zum Gitter zurück und wiederholen Sie den Vorgang.Falls die Maus 60 Sekunden lang hängt, vermerken Sie 60 Sekunden für die Wertung und bringen Sie die Maus in ihren Käfig zurück. Jeder Maus sind drei Versuche gestattet, 60 Sekunden zu halten. Andernfalls wird die längste Haltzeit gewertet.Nach der Tötung der Maus das Rückenmark entnehmen und anschließend den Quadrizeps-Skelettmuskel gewinnen. Um die gewonnenen Gewebe schnell einzufrieren, eine Edelstahlschale halbvoll mit 2-Methylbutan füllen und das untere Viertel der Schale in flüssigen Stickstoff eintauchen. Vor dem Fortfahren zwei Minuten warten.Nach einigen Minuten überführen Sie die Probe in 2-Methylbutan. Sobald die Probe weiß wird, überführen Sie sie unverzüglich in einen Behälter, der in Trockeneis eingebettet ist. Lagern Sie die Probe anschließend bei 80 Grad Celsius.Für die biochemische Analyse und die Quantifizierung von Mikro-RNAs das gewonnene Gewebe in ein Kryoröhrchen geben und in flüssigem Stickstoff einfrieren. Anschließend bei -80 Grad Celsius lagern. SBMA-Mäuse erhielten im Alter von fünf Wochen eine Injektion mit einhundert Billionen Genomen des AAV microR-298.Mäuse mit SBMA tragen das humane Androgenrezeptor-Transgen mit einer abnorm verlängerten Polyglutaminsequenz. Normalerweise entwickeln sie bis zum zehnten Lebenswochenanzeichen einer neuromuskulären Erkrankung. Das Lendenrückmark und der Quadrizepsmuskel wurden zu mehreren Zeitpunkten nach der Behandlung zur Analyse entnommen.Die quantitative RT-PCR zeigte, dass die Expression von micro-R298 im Skelettmuskel nach acht Wochen ihr Maximum erreichte und dass die Expression im Rückenmark nach zwölf Wochen ihren Höhepunkt erreichte. Zehn Wochen nach der Injektion wurde GFP in beiden Geweben nachgewiesen. Außerdem zeigte die GFP-Expression eine Kolokalisation mit dem Motorneuronen-Marker Cholinacetyltransferase.In einem Folgeexperiment wurden Mäuse im Alter von sieben Wochen zufällig mit dem Virus oder mit dem Kontrollpräparat injiziert und anschließend wöchentlich bis zum Alter von 40 Wochen gewogen und hinsichtlich ihres Verhaltens getestet. Zehn Wochen nach der Injektion begannen die behandelten Mäuse an Gewicht zuzunehmen und zeigten verbesserte motorische Leistungen. Die quantitative Echtzeit-PCR zeigte, dass die Behandlung die AR-Transkriptspiegel in den betroffenen Geweben verringerte.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Mikro-RNA mittels eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus-Vektors über eine Schwanzveneninjektion verabreicht. Und wie man Verhaltensuntersuchungen durchführt, die zur Beurteilung der Wirksamkeit des verabreichten Mikro-RNA bei der Minderung von Unterlappenatrophie und -schwäche bei Mäusen beitragen können. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Bereiche der Gentherapieansätze, da eine sichere und wirksame Gentherapie eine gezielte, gewebespezifische Übertragung des therapeutischen Transgens erfordert.Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir erkannten, dass eine Krankheit, die durch toxische Gewinn-der-Funktion-Mechanismen wie SBMA verursacht wird, von einer Überexpression natürlicherweise vorkommender microRNAs profitieren würde, die gezielt die drei-Prime-Reparatur des Krankheits-transkripts ansteuern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Dieser Artikel zeigt zwei sehr unterschiedliche Methoden der Injektion: 1) in das Gehirn (intracerebroventrikuläre) und 2) systemischen (intravenösen), um die therapeutischen Wirkstoffe in das zentrale Nervensystem von neugeborenen Mäusen einzuführen.

Abgabe therapeutischer Wirkstoffe durch intracerebroventrikuläre (ICV) und intravenöse (IV) Injektion in Mäuse

In diesem Video demonstrieren wir die rekombinante Adeno-assoziierte Virus-basierte Genabgabe im Maus-Welpen. Diese Methode hilft bei der Untersuchung der Genexpression in den Zielzellen.

Rekombinante Adeno-assoziierte virusbasierte Genverabgabung: Eine Technik für die transgene Verabreichung und kardiospezifische Expression im Nagetiermodell

Quelle: Li, D., et al. Direkte intrathekale Injektion von rekombinanten Adeno-assoziierten Viren in erwachsene Mäuse. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt das Verfahren zur intrathekalen Injektion von Adeno-assoziierten Viren (AAV) in die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) einer wachen Maus, einschließlich der Spritzenvorbereitung, der Ausrichtung der Wirbelsäule und des präzisen Einführens der Nadel. Diese Methode validiert die gezielte Verabreichung von Genen und unterstützt ihr Potenzial für...

Intrathekale Verabreichung von Viren in einem Mausmodell zur Behandlung von Erkrankungen des Zentralnervensystems

Quelle:Pourshafie, N., et al. Systemische Verabreichung von microRNA unter Verwendung des rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 zur Behandlung neuromuskulärer Erkrankungen bei Nagetieren. J. Vis. Exp. (2018).In diesem Video wird eine von spinaler und bulbärer Muskelatrophie oder SBMA betroffene Maus einer Schwanzveneninjektion von rekombinanten AAV-Vektoren (Adeno-assoziierten Vektoren) unterzogen, die ein Plasmid tragen, das für therapeutische microRNA kodiert. Der Vektor produziert...

Injektion rekombinanter adeno-assoziierter Vektoren in einem Mausmodell für spinale und bulbäre Muskelatrophie

Tiermodelle der pädiatrischen Erkrankung früh einsetzende und aggressiven Krankheitsprogression zu erleben. Klinisch relevante Therapieabgabe, junge Maus-Modellen kann technisch schwierig sein. Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-invasive Methode zur intravenösen Injektion neugeborene Mäuse innerhalb der ersten zwei Tage nach der Geburt des Lebens.

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Eine einfache Alternative zur stereotaktische Injektion für Hirnspezifische Knockdown von miRNA

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Potenz und Sicherheit der spinalen Adeno-assoziierten Virus 9 (AAV9) -vermittelten Genabgabe zu entwickeln und zu validieren, indem eine neuartige subpiale Genabgabetechnik bei erwachsenen Mäusen verwendet wurde.

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Methoden für eine breit angelegte zentrale Nervensystem gen Lieferung bei der Ratte sind abgedeckt. In diesem Beispiel ist der Zweck, eine Krankheit zu imitieren, die das gesamte Rückenmark betrifft. Die weit verbreitete Transduktion lässt sich ein therapeutisches Protein aus einer einmaligen, periphere Verwaltung an die CNS liefern.

Methoden und Tipps für die intravenöse Gabe von Adeno-assoziierten Virus an Ratten und Bewertung des zentralen Nervensystems Transduktion

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Durchführung kardiale gen bearbeiten in Vivo in Mäusen mit rekombinanten Adeno-Associated Virus (rAAV)-Lieferung von CRISPR vermittelt. Dieses Protokoll bietet eine vielversprechende therapeutische Strategie zur Behandlung von Dystrophischen Kardiomyopathie in Duchenne-Muskeldystrophie und kann verwendet werden, um Herz-Kreislauf-spezifische ko in postnatale Mäuse zu erzeugen.

Adeno-assoziierten Virus-vermittelte Lieferung von CRISPR für kardiale gen Bearbeitung bei Mäusen

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Direkte intrathekale Injektion von Recombinant Adeno-assoziierten Viren bei Erwachsenen Mäusen

Im Folgenden stellen wir ein optimiertes Protokoll für die Injektion von seitlichen Schwanzvenen aus der Maus zur systemischen Verabreichung von Adeno-assoziierten Viren (AAV) bei adulten Mäusen vor. Darüber hinaus beschreiben wir Protokolle von häufig verwendeten Assays zur Beurteilung der AAV-Transduktion.

Konsistente Verabreichung des Adeno-assoziierten Virus durch laterale Schwanzveneninjektion bei erwachsenen Mäusen

Erfahren Sie die systemische Lieferung von MicroRNA mit rekombinantem AAV9 zur Behandlung neuromuskulärer Erkrankungen bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht gezielte Gentherapie durch RNA-Interferenz in Skelettmuskulatur und Motorneuronen.

Systemische Lieferung von MicroRNA mit rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 zur Behandlung von neuromuskulärer Erkrankungen bei Nagern (Video) | JoVE Journal

Systemische Lieferung von MicroRNA mit rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 zur Behandlung von neuromuskulärer Erkrankungen bei Nagern

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