Minimal-Invasive Muskel einbetten (MIME) - eine neuartige experimentelle Technik, Spender-Zell-vermittelten Myogenesis zu erleichtern

Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, ein kleines Segment von Spender-Muskelgewebe in einen Wirtsmuskel zu implantieren, um eine von Spenderzellen vermittelte Myogenese zu fördern. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der regenerativen Muskelbiologie zu beantworten, beispielsweise, ob aus postmortal gewonnenem Muskelgewebe entnommene Zellen eine von Spenderzellen vermittelte Myogenese in einem Wirtsmuskel fördern können. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie minimalinvasiv ist.

Die Auswirkungen dieser Technik reichen bis hin zur Therapie nicht tödlicher Formen der Muskeldystrophie, da eine Kombination aus Muskeleinbettung, körperlicher Bewegung und Immuntherapie das regenerative Potenzial bestimmter betroffener Muskeln wiederherstellen könnte. Als Physiotherapeutin und Biomedizinische Ingenieurin halte ich die minimalinvasive Natur des MIME-Verfahrens für entscheidend, da sie eine Quelle myogener Zellen zusammen mit einem natürlichen Gewebegerüst bietet, ohne die Struktur und Funktion des Wirtsmuskels übermäßig zu beeinträchtigen. Die Durchführung des Verfahrens wird Frau Morium Begam, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin in meinem Labor, demonstrieren.

Beginnen Sie damit, 12 bis 16 Wochen alte C57 Black Six Spendermäuse gemäß dem schriftlichen Protokoll zu töten. Öffnen Sie mit einem Paar chirurgischer Scheren die Haut über der vorderen Fläche des Hinterbeins. Nachdem Sie den TA-Muskel gefunden haben, entfernen Sie ihn, um den hinter dem TA-Muskel liegenden EDL-Muskel sichtbar zu machen.

Schieben Sie die Spitze einer Pinzette hinter den Muskel und ziehen Sie vorsichtig, um zu prüfen, ob sich die Zehen strecken, wodurch bestätigt wird, dass es sich um den EDL-Muskel handelt. Nach der Identifizierung des EDL-Muskels verwenden Sie etwa 10 cm lange Abschnitte aus 4-0-Seide, um Führungsnahtfäden an den distalen und proximalen Sehnen anzubringen. Knoten Sie je zwei Doppelknoten in die Nähte der proximalen und distalen Sehne des Muskels.

Schneiden Sie das distale EDL-Sehnenende und klappen Sie den Muskel zurück. Anschließend schneiden Sie das proximale Sehnenende durch, um den Muskel zu lösen. Legen Sie die gewonnenen EDL-Muskeln in eine Petrischale, die mit Maus-Ringer-Lösung gefüllt ist.

Betäuben Sie die acht bis zehn Wochen alten männlichen NSG-GFP-Wirtsmäuse gemäß dem Textprotokoll. Tragen Sie Vaseline auf die Augen auf, um Austrocknung zu verhindern. Um die Haut vorzubereiten, tragen Sie Enthaarungscreme auf die vordere Seite des linken Hinterbeins auf und lassen Sie sie zwei Minuten einwirken.

Entfernen Sie die Enthaarungscreme zusammen mit dem Fell mithilfe mit PBS getränkter Tücher. Zum Reinigen der Haut wechseln Sie abwechselnd das Schrubben mit drei Tüchern mit Povidon-Iod-Lösung und 70 %igem Ethanol. Um eine Nadelbahn im TA-Muskel des Wirts zu schaffen, führen Sie eine chirurgische Nadel durch die Mitte des Muskels entlang der langen Achse des Muskels.

Stellen Sie sicher, dass die Nadel in zephalokaudaler Richtung entlang der Länge des M. tibialis anterior und durch die Mitte des Muskelbauchs geführt wird. Nach der Nadeleinführung werden die Führungsnahtfäden von einem Ende des Spendergewebes durch das Lumen der Operationsnadel in kaudozephaler Richtung gezogen. Ziehen Sie die Nadel in kaudozephaler Richtung aus dem Empfängermuskel zurück, um das Spendergewebe durch die Nadelbahn zu führen.

Platzieren Sie das Spender-EDL-Muskelgewebe ordnungsgemäß im Wirt-TA-Muskel, indem Sie die Führungsnahtfäden an den kaudalen und zephalen Enden des Spendermuskels verwenden. Nachdem das Spendergewebe eingebettet wurde, schneiden Sie die Führungsnahtfäden ab und nehmen Sie eventuelle Justierungen mit feinen Pinzetten vor. Verschließen Sie abschließend die Nadeleinstiche im Muskelgewebe, indem Sie die Wundkerbe mit der Pinzette verschließen und mit der Spitze einer 27-Gauge-Chirurgienadel veterinärmedizinischen Gewebekleber auftragen.

Nach der MIME injizieren Sie 50 bis 60 Mikroliter einer 1,2 %igen Bariumchloridlösung in den TA-Muskel des Wirts an drei Stellen entlang der Muskellänge, jeweils im proximalen, mittleren und distalen Drittel des Muskelbauchs. Nach der Injektion reinigen Sie das Bein der Wirtmaus mit Ethanol und schützen die Haut, indem Sie eine dünne Schicht Vaseline auftragen. Stellen Sie die Maus in einen separaten Erholungskäfig ohne Einstreu.

Ein isothermisches Gelwärmekissen sollte unter die Hälfte des Käfigs gelegt werden, um die Wirtmaus thermisch zu unterstützen, wobei der Maus weiterhin ermöglicht wird, in die unbeheizte Hälfte zu wechseln. Nach vollständiger Erholung die Maus in ihren ursprünglichen Käfig zurückbringen. Mit einer chirurgischen Schere die Haut über der vorderen Fläche des Beins öffnen.

Nachdem der TA-Muskel lokalisiert wurde, schneiden Sie sein distales Sehnenende und klappen den Muskel zurück. Durchtrennen Sie das proximale Muskelsehnenende, um den TA-Muskel zu lösen. Sammeln Sie sowohl den linken oder behandelten als auch den rechten oder Kontroll-TA-Muskel.

Wiegen Sie die gewonnenen Muskeln, indem Sie sie auf Wiegepapier und auf eine Waage legen. Tauchen Sie die Muskeln zur Kryoschutzbehandlung kurz in Mineralöl und tupfen Sie das überschüssige Öl ab. Um die Muskeln schockgefrieren zu können, legen Sie sie auf Aluminiumfolie und tauchen Sie diese schnell in eine Doppelkolben, die mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist.

Überführen Sie die gefrorenen Proben in beschriftete kryogene Gefäße. Eine präzise Einbettung des Spendergewebes in den Wirtsmuskel ist entscheidend für den Erfolg von MIME. Nach drei Tagen verbleibt der gespendete EDL-Muskel im Wirt-TA-Muskel, wobei Nadeleinstiche weiterhin am Wirtsmuskel sichtbar sind.

Außerdem zeigen die Querschnitte der Spendermuskeln keine grüne Fluoreszenz, während die Querschnitte der Wirtsmuskeln dies tun. In den Querschnitten der implantierten Muskeln ist eine deutliche Grenze zwischen den GFP-positiven Wirtsmuskel-Fasern und den GFP-negativen Spendermuskel-Fasern erkennbar.

14 Tage nach der Behandlung sind alle Muskel­fasern und die unbehandelten Muskeln GFP-positiv. Dies gilt jedoch nicht für die behandelten Wirtsmuskeln. Viele dieser GFP-negativen Fasern weisen eine Vitalität auf, wie durch rote Desmin-Färbung gezeigt wird.

Dies zeigt, dass MIME zu einer myogenen Differenzierung der Donorzellen führt. Es sind chimäre Muskel­fasern im Musculus tibialis anterior vorhanden, die anhand ihrer schwachen bis mäßigen Fluoreszenz detektiert wurden und vermutlich durch die Fusion von myogenen Zellen des Wirts und des Spenders entstanden sind.

Ihre Präsenz über den gesamten Durchmesser des Wirtsmuskels hinweg legt nahe, dass spendende myogene Zellen mehrere hundert Mikrometer innerhalb des Muskels wandern können. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in 15 bis 20 Minuten durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die MIME-Technik verwendet wird, um ein Segment von Spendermuskel in einen Wirtsmuskel einzubetten, um die spendenden Zellen vermittelte Myogenese zu fördern.

Die MIME-Technik eröffnet uns die Möglichkeit zu untersuchen, ob cadaverische menschliche Muskulatur eine spenderezellvermittelte Myogenese in einer Wirtmaus fördern kann oder nicht. Sie hilft zudem dabei zu beurteilen, ob eine neuromuskuläre elektrische Stimulation in der Lage ist, die spenderezellvermittelte Myogenese zu verstärken. Diese Methode kann außerdem auf andere Systeme angewandt werden, beispielsweise auf die Erzeugung von Tiermodellen menschlicher Erkrankungen durch Einpflanzung menschlicher Muskelbiopsien in Wirtstiere, sowie darauf, zu prüfen, ob muskelartige Gewebemimetics, die myogene Zellen enthalten, die Myogenese fördern können.