Die optische Fraktionator-Technik zur Schätzung der Zellzahlen in einem Rattenmodell der elektrokonvulsiven Therapie

Das übergeordnete Ziel dieser stereologischen Studie unter Verwendung des optischen Fraktionators besteht darin, quantitative Informationen, wie beispielsweise die Gesamtanzahl der Zellen in einem bestimmten Hirnbereich, mithilfe von Methoden zu gewinnen, die auf unvoreingenommenen Prinzipien basieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der quantitativen Analyse zu beantworten, etwa die Schätzung der Gesamtanzahl der Zellen in einer vollständigen Struktur von Interesse. Ein wesentlicher Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie genaue Schätzungen mit einer festen und vorab bestimmten Präzision liefert.

Den Ablauf demonstriert Esther Kjaer Needham, die Mitverfasserin des Artikels ist. Beginnen Sie mit einem fixierten und gefrorenen Rattenhirn. Trennen Sie mit einem Skalpell die rechte und linke Hemisphäre entlang der Mittellinie des Gehirns und wählen Sie dann zufällig eine der beiden Hemisphären im ersten Gehirn aus.

Anschließend systematisch zwischen der rechten und linken Hemisphäre wechseln. Dann die gewählte Hemisphäre mit einem Einbettmedium auf einer Probenscheibe befestigen, wobei die Längsachse senkrecht zur Scheibe ausgerichtet ist. Sobald die Hemisphäre auf der Scheibe befestigt ist, einen Schlauch um die Hemisphäre legen und diesen mit Tissue-Tek füllen, sodass die Hemisphäre vollständig bedeckt ist.

Als Nächstes nummerierte Mehrfachschalen in den Kryostaten zur Vorabkühlung geben. Anschließend die Probenscheibe im Kryostaten befestigen und den gesamten Hippocampus beginnend zufällig in 80 µm dicke Schnitte in koronaler Ebene schneiden. Während des Schneidens alle gewonnenen Schnitte der Reihe nach in die gekühlten Mehrfachschalen legen, um sicherzustellen, dass die Schnitte in der Reihenfolge des Schneidens aufbewahrt werden.

Wenn der gesamte Hippocampus eingebettet wurde, die Schnitte vollständig mit Kryoschutzmittel bedecken und die Behälter bis zur weiteren Verwendung bei minus 20 Grad Celsius lagern. Wenn die Immunfärbung beginnen soll, die Schnitte langsam auf Raumtemperatur bringen. Anschließend mit einem Pinsel jeden fünften Schnitt aus einer Serie von Hippocampus-Schnitten auf 25-Loch-Färbenetze übertragen, die in mit PBS gefüllte Petrischalen eingelegt sind.

Es sollten acht bis zwölf Schnitte pro Hippocampus für die Färbung vorliegen. Überführen Sie die Färbenetze mit den Schnitten in passende Glasgefäße mit PBS und waschen Sie die Schnitte zweimal für jeweils 10 Minuten in PBS. Anschließend inkubieren Sie sie 20 Minuten lang in 3 % Wasserstoffperoxid.

Nach dem Waschen die Schnitte in drei Salzsäurelösungen überführen. Anschließend 20 Minuten bei Raumtemperatur in 0,1 Natriumtetraborat neutralisieren. Nach drei 10-minütigen Inkubationen und Wechseln des Waschpuffers die Schnitte eine Stunde bei Raumtemperatur in die Blockierungslösung überführen.

Anschließend die Schnitte in Maus-anti-BrdU, im Verhältnis 1 zu 100 in Blockierungslösung verdünnt, für 48 Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation mit dem primären Antikörper dreimal je 10 Minuten in Waschpuffer waschen. Danach für 48 Stunden in Meerrettichperoxidase, im Verhältnis 1 zu 10 in Waschpuffer verdünnt, inkubieren.

48 Stunden später die Schnitte für 10 Minuten in PBS überführen und insgesamt fünfmal wiederholen. Nach dem Waschen die Schnitte für sieben Minuten in DAB-Lösung überführen. Anschließend für 10 Minuten in DAB-Lösung mit 0,02 % Wasserstoffperoxid überführen.

Nach einer Reihe von Waschschritten werden die Schnitte in numerischer Reihenfolge auf Objektträger aufgebracht. Etwa 30 Minuten trocknen lassen. Anschließend die Proben trocknen, indem sie in einen Objektträgerhalter gestellt werden.

Anschließend die Proben 10 Minuten lang in einer Objektträgerfärbekammer mit destilliertem Wasser rehydrieren. Danach die Objektträger 15 Minuten lang in 0,02 % Cresylviolett und destilliertem Wasser überführen. Nach erneuter Wiederholung der Cresylviolett-Färbung die Schnitte durch eine Ethanolreihe rehydrieren.

Anschließend die Schnitte zweimal je 15 Minuten in Xylol entfärben. Zum Schluss schnelltrocknendes Eindeckmedium hinzufügen und die Objektträger mit Deckgläsern belegen. Nach 24 Stunden können die Objektträger für die Mikroskopie verwendet werden.

Beginnen Sie mit der Überprüfung der Dicke des Gewebes, indem Sie zunächst die Objektträger auf die motorisierte Bühne des Mikroskops stellen und anschließend die Stereologie-Software öffnen. Begrenzen Sie den interessierenden Bereich mit einem Objektiv mit niedriger Vergrößerung, bevor Sie zu einem 100x-Ölimmersionsobjektiv wechseln. Wählen Sie dann einen bestimmten Punkt innerhalb eines Zählrahmens aus, beispielsweise einen Bereich neben einer Ecke, und bestimmen Sie die Oberseite des Schnitts, indem Sie entlang der Fokusebene wandern, bis ein Merkmal des Schnitts scharf erscheint.

Registrieren Sie die Z-Position als Null. Bewegen Sie danach die Fokusebene durch das Gewebe nach unten, bis die letzte Z-Ebene des Gewebes scharf ist, und markieren Sie anschließend diese Position. Die lokale Gewebestärke wird von Null bis zu diesem Endpunkt definiert und kann an der Z-Achse abgelesen werden.

Registrieren Sie die Gewebedicke. Die Gewebedicke wird an mehreren Stellen innerhalb des interessierenden Bereichs gemessen. Die Höhe des Dissektors und der Schutz zonen, die Größe des Zählrahmens, die Schrittlänge sowie die endgültige Vergrößerung werden in einer Pilotstudie bestimmt.

Nun können Sie mit der Zählung der BrdU-positiven Neuronen beginnen, üblicherweise bei einer Endvergrößerung von 2000- bis 3000-fach unter Verwendung eines 60x-Öl- oder 100x-Öl-Objektivs mit hoher numerischer Apertur. Identifizieren Sie BrdU-positive Neuronen in jedem Zählkästchen, zählen Sie jedoch keine, die die rote Ausschlusslinie berühren. Zählen Sie jene BrdU-positiven Neuronen, die die grüne Einschlusslinie berühren, sowie jene, die innerhalb der Grenze des Zählkästchens liegen.

Zählen Sie nur BrdU-positive Neuronen, wenn das Merkmal von Interesse innerhalb der Dissektorhöhe eindeutig erkennbar ist. Die hier gezeigten halbsichtbaren Neuronen werden nicht gezählt. Dieses Bild zeigt die Gesamtanzahl der BrdU-positiven Neuronen in der granulären Zellschicht und der subgranulären Zone des Rattenhippocampus.

Die horizontalen Balken stellen die Mittelwerte dar. Nach elektrokonvulsiver Stimulation ergibt sich im Vergleich zu behandelten Kontrollen eine sofortige Zunahme der Bildung neuer BrdU-positiver Neuronen um 260 %. In diesem Pool neu gebildeter Neuronen kommt es zwischen dem ersten Tag und drei Monaten zu einem Rückgang um 40 %, wobei fast 50 % der neu gebildeten Neuronen zwölf Monate nach der Behandlung noch überleben.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mithilfe stereologischer Methoden eine Schätzung der Gesamtanzahl von Zellen in einem Gehirnbereich erhält.