Analysieren von Supercomplexen der mitochondrialen Elektronentransportkette mit Native Elektrophorese, In-Gel-Assays und Elektrolyse

Das übergeordnete Ziel der nativen Elektrophorese in Kombination mit In-Gel-Assays, Immunoblotting und nativer Elektroelution besteht darin, die Zusammensetzung mitochondrialer Superkomplexe zu bewahren und zu analysieren. Diese Methode kann dabei helfen zu klären, wie sich die Proteinkomplexe der mitochondrialen Atmungskette unter Einfluss zahlreicher Faktoren – wie beispielsweise bioenergetischer Anforderungen sowie physiologischer und pathologischer Bedingungen – zu Superkomplexen zusammensetzen. Der entscheidende Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, dass bei korrekter Durchführung die physiologische Integrität und Funktionalität der mitochondrialen Superkomplexe während des langwierigen Isolationsprozesses erhalten bleibt.

Diese Methode kann auch zur Untersuchung der Dynamik der Superkomplexbildung sowie zur Analyse von Protein-Komplexen in der Plasmamembran und anderen intrazellulären Membranen angewendet werden. Bei der Vorbereitung von In-Gel-Assays ist es äußerst wichtig, dass alle für die native Elektrophorese verwendeten Teile frei von Detergenzien sind, da diese zur Zerstörung der mitochondrialen Superkomplexe beitragen würden. Schneiden Sie eine oder mehrere Gelen aus einem klaren nativen Gel aus und überführen Sie diese in einen beschrifteten Behälter.

Um den Komplex-1-Assay durchzuführen, mischen Sie 10 Milliliter Assay-Puffer mit 25 Milligramm Nitroblautetrazolium und 100 Mikrolitern NADH (10 Milligramm pro Milliliter). Geben Sie diese Mischung auf die ausgeschnittene klare native Gelelektrophoresebande oder den interessierenden Bereich. Verfolgen Sie die Entwicklung blauer Banden nach sanfter Agitation auf einem Rüttler für mindestens drei Minuten.

Fixieren Sie dann das Gel in 10 bis 20 Milliliter Essigsäurelösung oder waschen Sie es in fünf Millimolar Tris pH 7,4, um die Reaktion zu stoppen. Machen Sie Fotografien zur Dokumentation. Um den Komplex-5-Assay durchzuführen, entnehmen Sie ein Gel, eine Spur oder einen Bereich von Interesse aus einem blau-nativen oder klar-nativen Gel.

Die Probe zwei Stunden unter leichtem Rühren in 10 bis 20 Milliliter Assay-Puffer, zuzüglich oder minus fünf Mikrogramm pro Milliliter Oligomycin, bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation den Puffer durch 14 Milliliter frischen Assay-Puffer ersetzen. Anschließend in der angegebenen Reihenfolge 190 Mikroliter einer einmolarigen Magnesiumsulfat-Lösung, 27,28 Milligramm Bleinitrat, 60 Milligramm ATP und 75 Mikroliter Oligomycin hinzufügen.

Ansäuern Sie unter leichtem Schütteln und beobachten Sie ein weißes Präzipitat, da die Bänder in den mit Oligomycin behandelten Gele nicht von Komplex 5 abhängig sind. Fixieren Sie das Gel in einer methanolbasierten Fixierlösung, da saure Lösungen das Bleipräzipitat auflösen würden. Fotografieren Sie die Ergebnisse und führen Sie anschließend den Proteinauftrag und die Immunoblotanalyse gemäß dem im Text beschriebenen Protokoll durch.

Am Tag der Elektroelution einen Sinter in den Boden jedes verwendeten Glasrohrs geben. Gegebenenfalls das Glasrohr in Elutionspuffer stellen und den Sinter von innen in den Boden des Rohrs schieben. Das Glasrohr mit dem Sinter in das Modul des Electro-Eluters hineinschieben.

Befeuchten Sie die Dichtung mit Elutionspuffer und schieben Sie das Glasrohr an die richtige Stelle. Stellen Sie sicher, dass die Oberkanten der Glasrohre bündig mit der Dichtung abschließen. Schließen Sie die leeren Dichtungen mit Stopfen.

Als Nächstes eine feuchte Membrankappe an der Unterseite des Silikonadapters anbringen und den Adapter mit Elutionspuffer füllen. Den Puffer langsam mehrmals mit dem Pipettiergerät und dem Adapter auf- und abpipettieren, um eventuelle Luftblasen um die Dialysemembran zu entfernen. Den mit Puffer gefüllten Adapter vorsichtig an die Unterseite des Glasrohrs schieben.

Entfernen Sie anschließend alle Blasen, die auf dem Sinter im Inneren des Glasrohrs erscheinen. Füllen Sie jedes Glasrohr mit Puffer zum Eluieren. Geben Sie die ausgeschnittenen Bande der BN-Gelelektrophorese in die Glasröhrchen.

Schneiden Sie große Stücke in kleinere Stücke. Stellen Sie sicher, dass die Füllhöhe innerhalb des Glasrohrs etwa einen Zentimeter beträgt. Danach setzen Sie das gesamte Modul in den Tank ein.

Geben Sie etwa 600 Milliliter kaltes Elutionspuffer in den Tank. Stellen Sie sicher, dass die Silikonadapterkappen im Puffer eingetaucht sind. Platzieren Sie einen Rührstab am Boden des Tanks, bevor Sie die Proteine vier Stunden lang bei 350 Volt im Kühlschrank eluieren.

Nach Abschluss der Elution entfernen Sie das Electro-Eluter-Modul aus dem Pufferbehälter und stellen es in ein Spülbecken oder eine Schüssel. Falls ein Stopfen verwendet wurde, nehmen Sie ihn zum Entleeren der oberen Pufferkammer heraus. Entfernen Sie den Puffer aus jedem Glasrohr und entsorgen Sie ihn.

Stellen Sie sicher, dass der Silikonadapter an seinem Platz bleibt und die Flüssigkeit unterhalb der Sinterplatte nicht gestört oder geschüttelt wird. Entfernen Sie dann vorsichtig den Silikonadapter zusammen mit der Membrankappe von der Unterseite des Glasrohrs. Pipettieren Sie den Inhalt der Silikonkappe in ein Mikroröhrchen.

Mit weiteren 200 Mikrolitern Elutionspuffer die Silikonkappe spülen und zum Mikroröhrchen geben. Diesen Vorgang für alle Glasröhrchen wiederholen. Die wiederverwendbaren Membrankappen dadurch aufbewahren, dass sie in Elutionspuffer mit 0,5 Milligramm pro Milliliter Natriumazid gegeben werden, und anschließend kühlen.

Superkomplexe aus Herzmitochondrien werden hier mittels In-Gel-Assays visualisiert. Gelenkämmchen des klaren nativen Gels werden für In-Gel-Assays für Komplex 1 und Komplex 5 verwendet. Die Spezifität des Signals kann durch die Verwendung von Inhibitoren, wie Oligomycin für die ATP-Synthase, überprüft werden.

Gelelektrophoretische Assays liefern Informationen über die Größe eines Protein-Komplexes, beispielsweise bezüglich der Aktivität von Komplex-1 oder Komplex-5, jedoch nicht über dessen Zusammensetzung. Im blauen nativen Gel werden Banden von Protein-Komplexen sichtbar, die zur Elektroelution ausgeschnitten werden können. Nach der Elektroelution wird das Eluat für weitere Analysen verwendet, wie zum Beispiel Gelelektrophoretische Assays, Silberfärbung der eluierten Proteine mittels nativer oder denaturierender Elektrophorese sowie Western Blotting.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von drei Tagen durchgeführt werden. Diese drei Tage umfassen die Isolierung von Mitochondrien, eine über Nacht durchgeführte Blue-native-Maxi-Elektrophorese und das Immunoblotting. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie mitochondriale Superkomplexe mittels Nativelektrophorese, In-Gel-Assays und Elektroelution isoliert und identifiziert werden können.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass mitochondriale Superkomplexe empfindlich sind. Das Einfrieren und Auftauen von Proben sollte auf ein Minimum beschränkt werden. Die native Elektrophorese und die Elektroelution sollten auf Eis oder im Kühlschrank durchgeführt werden.

Die Auswirkungen dieser Techniken reichen über die Bestimmung der physikalischen Zusammensetzung jedes Suprakomplexes hinaus. Da die Suprakomplexe in ihrer nativen Form erfasst werden, können funktionelle Assays durchgeführt werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg dafür, dass Forscher auf dem Gebiet der mitochondrialen Biologie das Verständnis der mitochondrialen Elektronentransportaktivität und deren Konsequenzen für Patienten mit mitochondrialen Erkrankungen neu bewerten konnten.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie HPLC, Massenspektroskopie, Elektronenmikroskopie oder Patch-Clamp durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur molekularen Zusammensetzung, Struktur oder elektrophysiologischen Eigenschaften der isolierten Protein-Komplexe zu beantworten.