Analysieren von Supercomplexen der mitochondrialen Elektronentransportkette mit Native Elektrophorese, In-Gel-Assays und Elektrolyse

Das übergeordnete Ziel der nativen Elektrophorese in Kombination mit In-Gel-Assays, Immunblotting und nativer Elektroelution besteht darin, die Assemblierung mitochondrialer Superkomplexe zu erhalten und zu analysieren. Diese Methode kann helfen zu beantworten, wie sich die Proteinkomplexe der mitochondrialen Elektronentransportkette in Abhängigkeit von vielen Faktoren, einschließlich bioenergetischer Bedürfnisse und physiologischer und pathologischer Bedingungen, zu Superkomplexen zusammensetzen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass bei richtiger Anwendung die physiologische Integrität und Funktionalität der mitochondrialen Superkomplexe während des langwierigen Isolationsprozesses erhalten bleibt.

Diese Methode kann auch angewendet werden, um die Dynamik des Aufbaus von Superkomplexen zu untersuchen und Proteinkomplexe in der Plasmamembran sowie in anderen intrazellulären Membranen zu analysieren. Bei der Vorbereitung von In-Gel-Assays ist es absolut entscheidend, dass alle Teile, die für die native Elektrophorese verwendet werden, nicht durch Detergenzien verunreinigt werden, da sie zu einem Zerfall der mitochondrialen Superkomplexe beitragen. Schneiden Sie eine oder mehrere Bahnen aus einem durchsichtigen nativen Gel ab und geben Sie diese in einen beschrifteten Behälter.

Um den Komplex-1-Assay durchzuführen, kombinieren Sie 10 Milliliter Assay-Puffer mit 25 Milligramm Nitroblau-Tetrazolium und 100 Mikroliter 10 Milligramm pro Milliliter NADH. Fügen Sie dies der herausgeschnittenen klaren nativen Gel-Spur oder dem Interessenbereich hinzu. Verfolgen Sie die Entwicklung der blauen Bänder nach leichtem Rühren auf einer Wippe für mindestens drei Minuten.

Fixieren Sie dann das Gel in 10 bis 20 Millilitern Essigsäurelösung oder waschen Sie es in fünf Millimolaren Tris pH 7,4, um die Reaktion zu stoppen. Machen Sie Fotos zur Dokumentation. Um den Complex-5-Assay durchzuführen, erhalten Sie ein Gel, eine Spur oder einen interessierenden Bereich aus einem blauen nativen oder klaren nativen Gel.

Die Probe wird zwei Stunden lang unter leichtem Rühren in 10 bis 20 Millilitern Assay-Puffer plus oder minus fünf Mikrogramm pro Milliliter Oligomycin bei Raumtemperatur inkubiert. Ersetzen Sie den Puffer nach der Inkubation durch 14 Milliliter frischen Assay-Puffer. Fügen Sie dann der Reihe nach 190 Mikroliter eines molaren Magnesiumsulfats, 27,28 Milligramm Bleinitrat, 60 Milligramm ATP und 75 Mikroliter Oligomycin hinzu.

Inkubieren Sie unter leichtem Rühren und achten Sie auf einen weißen Niederschlag, da die Banden auf den mit Oligomycin behandelten Gelen nicht-Komplex-5-abhängige Banden ergeben. Fixieren Sie das Gel in einem Fixiermittel auf Methanolbasis, da saure Lösungen den Bleiniederschlag auflösen. Fotografieren Sie die Ergebnisse und führen Sie anschließend Proteintransfer und Immunblotting durch, wie im Textprotokoll beschrieben.

Legen Sie am Tag der Elektroelution eine Fritte in den Boden jedes zu verwendenden Glasrohrs. Legen Sie das Glasrohr bei Bedarf in einen Elutionspuffer und schieben Sie die Fritte von innen auf den Boden des Rohres. Schieben Sie das Glasrohr mit der Fritte in das Modul des Elektro-Eluters.

Befeuchten Sie die Tülle mit Elutionspuffer und schieben Sie das Glasrohr an seinen Platz. Stellen Sie sicher, dass die Oberseiten der Glasröhren auf gleicher Höhe mit der Tülle sind. Verschließen Sie die leeren Tüllen mit Stopfen.

Setzen Sie anschließend eine nasse Membrankappe an die Unterseite des Silikonadapters und füllen Sie den Adapter mit Elutionspuffer. Pipettieren Sie den Puffer und den Adapter langsam auf und ab, um alle Luftblasen um die Dialysemembran herum zu entfernen. Schieben Sie den mit Puffer gefüllten Adapter an die Unterseite des Glasrohrs.

Entfernen Sie dann alle Blasen, die auf der Fritte im Inneren des Glasrohrs erscheinen. Füllen Sie jedes Glasröhrchen mit dem Elutionspuffer. Legen Sie die ausgeschnittenen Bänder der BN-PAGE in die Glasröhrchen.

Große Stücke in kleinere Stücke schneiden. Achten Sie darauf, dass die Füllhöhe innerhalb des Glasrohrs etwa einen Zentimeter beträgt. Setzen Sie dann das gesamte Modul in den Tank ein.

Geben Sie etwa 600 Milliliter Kaltelutionspuffer in den Tank. Stellen Sie sicher, dass die Silikon-Adapterkappen in den Puffer eingetaucht sind. Legen Sie einen Rührstab auf den Boden des Tanks, bevor Sie die Proteine vier Stunden lang bei 350 Volt in einem kalten Raum eluieren.

Nachdem die Elution abgeschlossen ist, nehmen Sie das Elektro-Eluter-Modul aus dem Puffertank und stellen Sie es in ein Waschbecken oder eine Schüssel. Wenn ein Stopfen verwendet wurde, entfernen Sie diesen, um die obere Pufferkammer zu entleeren. Entferne den Puffer von jedem Glasrohr und entsorge ihn.

Achten Sie darauf, dass der Silikonadapter an Ort und Stelle bleibt und dass die Flüssigkeit unter der Fritte nicht gestört oder geschüttelt wird. Entfernen Sie dann vorsichtig den Silikonadapter zusammen mit der Membrankappe von der Unterseite des Glasrohrs. Pipettieren Sie den Inhalt der Silikonkappe in ein Mikroröhrchen.

Spülen Sie mit weiteren 200 Mikrolitern Elutionspuffer die Silikonkappe aus und geben Sie sie in das Mikroröhrchen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Glasröhren. Bewahren Sie die wiederverwendbaren Membrankappen auf, indem Sie sie in einen Elutionspuffer legen, der 0,5 Milligramm pro Milliliter Natriumazid enthält, und kühlen Sie sie.

Superkomplexe aus Herzmitochondrien werden hier durch In-Gel-Assays sichtbar gemacht. Lanes des klaren nativen Gels werden für In-Gel-Assays für Komplex-1 und Komplex-5 verwendet. Die Spezifität des Signals kann mit Hilfe von Inhibitoren, wie Oligomycin für die ATP-Synthase, bewertet werden.

In-Gel-Assays liefern Informationen über die Größe eines Proteinkomplexes mit Komplex-1- oder Komplex-5-Aktivität, aber nicht über deren Zusammensetzung. Das blaue native Gel zeigt Banden von Proteinkomplexen, die für die Elektroelution herausgeschnitten werden können. Nach der Elektroelution wird das Eluat für weitere Analysen verwendet, wie z. B. In-Gel-Assays, Silberfärbung der eluierten Proteine durch native oder denaturierende Elektrophorese und Western Blotting.

Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von drei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Diese drei Tage umfassen die Isolierung von Mitochondrien, die Durchführung einer blauen nativen Maxi-Elektrophorese über Nacht und das Immunblotting. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mitochondriale Superkomplexe mithilfe von nativer Elektrophorese, In-Gel-Assays und Elektroelution isoliert und identifiziert.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass mitochondriale Superkomplexe zerbrechlich sind. Das Einfrieren und Auftauen der Proben sollte auf ein Minimum beschränkt werden. Die native Elektrophorese und Elektroelution sollte auf Eis oder im Kühlraum durchgeführt werden.

Die Implikationen dieser Techniken gehen über die Definition der physikalischen Zusammensetzung jedes Superkomplexes hinaus. Da die Superkomplexe in ihrer nativen Form eingefangen werden, können funktionelle Assays durchgeführt werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Mitochondrienbiologie, um das Verständnis der mitochondrialen Elektronentransportaktivität und ihrer Folgen für Patienten mit mitochondrialen Erkrankungen neu zu bewerten.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie HPLC, Massenspektroskopie, Elektronenmikroskopie oder Patch-Clamp durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die molekulare Zusammensetzung, Struktur oder elektrophysiologische Eigenschaften der isolierten Proteinkomplexe zu beantworten.