DiI Perfusion als Methode zur vaskulären Visualisierung in Ambystoma mexicanum

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Gefäßsystem des Axolotls sichtbar zu machen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der regenerativen Medizin über die Feinheiten der Revaskularisierung von regenerierenden Geweben im Axolotl zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Gefäßvisualisierungstechnik besteht darin, dass alle Blutgefäße im Tier problemlos mit einem Standard-Fluoreszenzmikroskop abgebildet werden können.

Obwohl diese Methode einen Einblick in die Regeneration der Axolotl-Gliedmaßen geben kann, kann sie auch auf andere Gewebe wie Schwanz, Herz, Augen, Kiemen oder andere Organe angewendet werden. Bevor Du die Brust des Axolotls öffnest, bestätige zunächst den entsprechenden Grad der Sedierung, indem Du die Zehen kneifst. Kneifen Sie dann mit einer chirurgischen Zange die Haut entlang der Mittelachse der Brust ein, direkt unter der Linie der Schultern.

Machen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt, an der die Haut nach oben gezogen wird, und entfernen Sie einen quadratischen Hautfleck über der Brust, um zwei Knorpelplatten freizulegen. Öffnen Sie anschließend ein Fenster über der Brusthöhle und reißen Sie das Bindegewebe vorsichtig ein, ohne größere Blutgefäße zu durchtrennen. Heben Sie jede Knorpelplatte einzeln mit einer Pinzette an und schneiden Sie sie mit einer chirurgischen Schere heraus.

Kneifen Sie das freiliegende Perikard vorsichtig mit der Pinzette zusammen. Das Gewebe nach oben ziehen und mit der chirurgischen Schere punktieren, gerade tief genug, um das Perikard zu entfernen, ohne das Herz zu verletzen. Entfernen Sie dann vorsichtig das Perikard, um das Herz und die Aorta freizulegen, um das Herz bei etwa fünf Millimetern von der Aorta entfernt, die vom Herzen abzweigt, deutlich zu sehen.

Um den Axolotl zu perfundieren, platzieren Sie einen Klemmständer mit einer geladenen Schmetterlingsnadel neben einem Rahmen aus Polystyrolschaum, so dass der Arm der Klemme für das Einführen der Nadel leicht manipuliert werden kann. Schalten Sie eine Peristaltikpumpe ein, um 0,7x PBS durch den Pumpenschlauch zu spülen, und richten Sie die Nadelspitze auf den rostralen Aspekt. Schieben Sie die Pinzette unter den Aortenbogen und ziehen Sie sie leicht nach oben.

Manövrieren Sie dann die Nadelklemmenkombination so, dass die Nadel entlang der Länge der Aorta in Richtung Kopf des Tieres verläuft, und führen Sie die Nadel etwa fünf Millimeter in die Aorta ein, wobei Sie die Pinzette zur Unterstützung hinter der Aorta halten. Eine erfolgreiche Einlage kann durch eine sichtbare Vergrößerung der Herzvorhöfe bestätigt werden. Reißen Sie schnell einen Vorhof auf und lassen Sie das Blut abfließen.

Dann durchblutest Du den Axolotl mit etwa 20 bis 30 Millilitern PBS. Nach einer erfolgreichen Durchblutung sollte sich die Farbe des Tieres von hellrosa zu weiß ändern. Wenn das gesamte PBS durchblutet ist, halten Sie die Schlauchpumpe an und schieben Sie das freie Ende des Schlauchs in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit Dil-Lösung.

Starten Sie die Pumpe neu, achten Sie darauf, dass keine Blasen in den Rohren entstehen, und durchbluten Sie das Tier mit dem gesamten Arbeitsmaterial. Bei einer erfolgreichen Perfusion nimmt der Axolotl eine leuchtend rosa Farbe an, die sich am deutlichsten in den Kiemen bemerkbar macht. Wenn der gesamte Dil durchblutet ist, halten Sie die Pumpe an und legen Sie das freie Ende des Schlauchs in eine 4%ige Paraformaldehydlösung.

Starten Sie dann die Pumpe neu und perfundierten Sie mindestens 10 Milliliter des Fixiermittels. Wenn das gesamte Paraformaldehyd verabreicht wurde, stoppen Sie die Pumpe und entfernen Sie die Nadel. Gib den Axolotl auf eine Plastikschale und stelle die Schale auf einen fluoreszierenden Mikroskoptisch.

Wählen Sie dann bei ausgeschaltetem Licht einen Filter aus, der die Anregung von Dil zulässt, das ein rot-orangefarbenes Licht ausstrahlt. Nach erfolgreicher Perfusion ist der Dil-Fleck als rotes Einfallssignal in allen Geweben des Axolotls sichtbar, einschließlich des Schwanzes, der Gliedmaßen, der Kiemen und der Augen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Stunde abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei diesem Eingriff ist es wichtig, darauf zu achten, dass die großen Blutgefäße oder das Herz beim Öffnen der Brusthöhle nicht zerrissen werden und die Nadel in einer Linie mit der Aorta eingeführt wird, um Durchstiche zu vermeiden. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Skelettpräparationen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher im biomedizinischen Bereich, um das Gefäßsystem verschiedener Arten zu erforschen.

Nachdem Du Dir dieses Video angesehen hast, solltest Du ein gutes Verständnis dafür haben, wie Du eine Herzperfusion des Axolotls mit dem Carbocyanin-Farbstoff Dil durchführst. Vergiss nicht, dass die Arbeit mit Nadeln und Paraformaldehyd extrem gefährlich sein kann und dass während der Durchführung des Eingriffs immer Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung, getroffen werden sollten.