Name: DiI Perfusion als Methode zur vaskulären Visualisierung in Ambystoma mexicanum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Lernen Sie die DiI-Perfusionsmethode zur vaskulären Visualisierung bei Ambystoma mexicanum. Diese Technik ermöglicht die Fluoreszenzmikroskopie aller Blutgefäße und liefert wertvolle Erkenntnisse für die regenerative Medizin.

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Diese Forschung wurde vom Brigham &amp; Women&#39;s Hospital und dem March of Dimes unterstützt. Die Autoren danken allen Mitgliedern des Whited Labs für ihre Unterstützung und Beratung.

Alle Axolotl-Experimente wurden in Übereinstimmung mit Brigham und Women&#39;s Hospital (BWH) Institutional Animal Care und Use Committee durchgeführt. 1. Perfusionsexperiment einrichten <ol><li> Legen Sie ein erwachsenes Axolot in einen mit 0,1% Triacinlösung (MS222) gefüllten Plastikbehälter für 15-20 min oder bis vollständig anästhesiert. Stellen Sie sicher, dass der Behälter mit genügend Triacin-Lösung gefüllt ist, so dass das Axolotl vollständig untergetaucht ist. Hinweis: Alle Verfahren müssen gemäß den Richtlinien der institutionellen Tierpflege durchgeführt werden. Bei BWH wird ein Axolotl als vollständig betäubt betrachtet, wenn es einen Fuß-Prise-Test versagt, dh es gibt keine reflexive Bewegung, wenn der Fuß sanft gequetscht wird. Achtung: Obwohl Tricaine ein Anästhetikum ist, das speziell für Wasserorganismen verwendet wird, sollte ein direkter Hautkontakt mit der Tricainlösung vermieden werden. </li><li> Richten Sie die Axolotl-Perfusionsstation ein. <ol><li> Setze dasAbsorbierende Auflage auf einer ebenen, ebenen Oberfläche mit der nach oben weisenden Seite. </li><li> Schneiden Sie ein Loch in den Polystyrol-Schaumrahmen, der die passende Größe und Form für das anästhesierte Axolotl ist, um in der Rückenlage zu liegen. Legen Sie den Rahmen auf das saugfähige Pad. Hinweis: Einige zusätzliche Papiertücher können sofort unter dem Rahmen für zusätzliche Saugfähigkeit platziert werden. </li><li> Die peristaltische Pumpe mit dem Perfusionsschlauch beladen. Stellen Sie die Pumpe auf eine Durchflussrate von 0,7 ml / min ein, die im Uhrzeigersinn fließt. </li><li> Mischen Sie die Verdünnungslösung mit 0,7x PBS und 5% Glukose in einer 1: 4 Mischung. </li><li> Mischen Sie 10 ml Verdünnungslösung mit 200 μl der DiI-Stammlösung in einem 50 ml konischen Röhrchen. Cap und Mix durch Inversion. Decken Sie diesen Schlauch mit Aluminiumfolienpapier ab, um die Arbeitslösung vor Lichteinwirkung zu schützen. Hinweis: Die Volumina sollten entsprechend der Größe des Axolotls proportional geändert werden. Diese Werte sind für eine ca. 15 cm axolotl (Schnauze-zu-Schwanz-Länge). EINNaturen dieser Größe haben möglicherweise nicht die volle Geschlechtsreife erreicht, so dass Tier Sex nicht zu diesem Zeitpunkt bestimmt werden kann. </li><li> Füllen Sie ein 50 mL konisches Rohr mit 0,7x PBS. Hinweis: PBS wird für die Priming der Schleife und Axolotl Exsanguination verwendet werden. </li><li> Befestigen Sie die 27-Gauge-Schmetterlingsnadel am Austrittsende des Perfusionsschlauches. Falten Sie die Schmetterlingsflügel aufeinander und legen Sie sie in den Klemmenständer. </li><li> Legen Sie das freie Ende des Perfusionsschlauches in das 50 mL konische Rohr, das mit 0,7x PBS gefüllt ist, und führen Sie die Perfusionspumpe, bis der gesamte Schlauch mit einer Lösung gefüllt ist. Pausieren Sie die Pumpe, sobald der gesamte Schlauch mit PBS gefüllt ist. Hinweis: Achten Sie darauf, dass der Schlauch jederzeit frei von Luftblasen ist, da diese Luft in den Axolotl bringen und eine vollständige Perfusion verhindern. </li><li> Legen Sie ein Papiertuch in die axolotlförmige Form im Polystyrol-Schaumstoffrahmen. Mit einer Transferpipette das Tuch mit Triacinlösung einweichen. Anmerkung: Schneiden Sie ein kleines Quadrat in der Mitte des PapiertuchesEl, um die Drainage von Flüssigkeiten während des Perfusionsverfahrens zu ermöglichen. </li><li> Legen Sie die anästhesierte Axolotl Rücken auf das Papiertuch im Polystyrol-Schaumstoffrahmen. </li></ol></li></ol> 2. Eröffnung der Axolotl Brust <ol><li> Benutze chirurgische Pinzette, um die Haut entlang der Mittelachse der Axolotl-Brust zu knacken, knapp unterhalb der Schulterlinie. Nach oben ziehen </li><li> Verwenden Sie ein Skalpell, um einen kleinen Schnitt zu machen, wo die Haut gezogen wurde. </li><li> Entfernen Sie einen quadratischen Fleck der Haut über die Brust, um zwei Knorpelplatten zu enthüllen. <ol><li> Entfernen Sie die Haut, um ein Fenster über die Thoraxhöhle zu öffnen, das groß genug ist, um das Herz deutlich zu sehen und ungefähr 5 mm der Aorta, die vom Herzen abzweigt. </li></ol></li><li> Das Bindegewebe sorgfältig mit einer Pinzette oder der geschlossenen Schere zerreißen, um das Entfernen von größeren Blutgefäßen zu vermeiden. </li><li> Heben Sie jede Knorpelplatte einzeln mit der Pinzette an und verbrauchen sie wMit der chirurgischen Schere. </li><li> Sorgfältig das Perikard mit der Pinzette einklemmen, hochziehen und mit der chirurgischen Schere punktieren; Dieser Einschnitt sollte gerade tief genug sein, um das sehr dünne Perikard zu durchstechen und sollte groß genug sein, um die Entfernung des Perikards zu ermöglichen. Achten Sie darauf, das Herz nicht zu schneiden. </li><li> Zartes das Perikard entfernen, um das Herz und die Aorta auszusetzen. Hinweis: Verwenden Sie eine Transferpipette, periodisch spülen Sie die Brusthöhle und die Kiemen mit Tricain-Lösung, um den Bereich klar zu halten und halten Sie die Axolotl anästhesiert. </li></ol> 3. Perfusion des Axolotl <ol><li> Legen Sie den Klemmenständer mit der beladenen Schmetterlingsnadel neben dem Polystyrol-Schaumstoffrahmen, so dass der Arm der Klemme leicht manipuliert werden kann, um die Nadel in die Axolotl-Aorta einzuführen. Richten Sie die Nadelspitze auf den rostralen Aspekt des Tieres während der Insertion und halten Sie die Nadel parallel zur Aorta, um zu vermeiden, dass sie durch die opPosite Seite. </li><li> Schalten Sie die peristaltische Pumpe ein. 0,7x PBS sollte weiterhin durch Schlauch fließen. </li><li> Setzen Sie die Nadel in die Aorta ein. <ol><li> Schieben Sie die Pinzette unter den Aortenbogen und ziehen Sie leicht nach unten, um einen leichten Zugang zu ermöglichen. </li><li> Manövrieren Sie die Nadel-Klemm-Kombination, so dass die Nadel entlang der Länge der Aorta läuft und nach oben zum Kopf zeigt. Setzen Sie die Nadel ein, während Sie die Pinzette für die Unterstützung hinter der Aorta verwenden. Hinweis: Die Nadel sollte tief genug in die Aorta eingesetzt werden, um sicherzustellen, dass sie während der Perfusion nicht ausrutscht. Dies kann etwa 5 mm für ein 15 cm Axolotl sein. Stellen Sie sicher, dass die Nadel perfekt mit der Aorta in Einklang steht, um eine vollständige Punktion des Schiffes zu vermeiden. Durch-und-Durchgangsdurchgänge können massive Blutung verursachen und die Erfolgsquoten der Perfusion verringern. Eine erfolgreiche Einfügung kann durch eine sichtbare Vergrößerung der Herzmuster des Herzens bestätigt werden. </li></ol></li><li> Schnell zerreißt ein Atrium mit dem sciSsors und lassen Blut abtropfen lassen. <ol><li> Spülen Sie mit Tricain-Lösung, um Blutansammlung und Gerinnselbildung in der Brusthöhle zu verhindern. </li></ol></li><li> Perfekt das Axolot mit etwa 20-30 ml PBS. Das Tier sollte von hellrosa in Farbe zu Weiß in einer erfolgreichen Perfusion wechseln. </li><li> Pausieren Sie die peristaltische Pumpe und bewegen Sie das freie Ende des Schlauches in das 15 ml Rohr der DiI-Lösung. Starten Sie die Pumpe neu, achten Sie darauf, keine Luftblasen im Schlauch zu erzeugen. </li><li> Setzen Sie den Axolotl mit dem gesamten Arbeitsmaterial von DiI ein. Anmerkung: In einer erfolgreichen Perfusion, die Axolotl mit Veränderung Farbe auf die helle rosa der DiI. Das wird am deutlichsten in den Kiemen. </li><li> Pausieren Sie die Pumpe, nachdem die Perfusion mit DiI abgeschlossen ist und legen Sie das freie Ende des Schlauches in 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung, um das Gewebe zu fixieren. Starten Sie die Pumpe neu und benachrichtigen Sie mindestens 10 ml PFA. Achtung: PFA ist giftig und sollte gehandhabt und dispo seinSed von angemessenem. Handschuhe und Schutzbrillen sollten getragen werden, und Lösungen sollten in einer Dunstabzugshaube hergestellt werden. Die Perfusion des Axolotls mit PFA zur Fixierung des Gewebes führt zum Tod des Tieres. </li></ol> 4. Beenden der Perfusion und Visualisierung Vorbereitung <ol><li> Stoppen Sie die peristaltische Pumpe und entfernen Sie die Nadel aus der Axolotl-Aorta. </li><li> Legen Sie das Axolotl auf eine Plastikplatte. Anmerkung: Die Verwendung einer Hälfte einer großen Petrischale funktioniert gut und ermöglicht das Gießen einer kleinen Menge Tricaine oder PBS auf das Axolotl, um seine Haut nass zu halten und die Visualisierungsqualität zu verbessern. </li><li> Entsorgen Sie alle verwendeten Materialien in den entsprechenden Abfallbehältern. Saubere chirurgische Werkzeuge mit 70% Ethanol, desinfizieren mit einem Glasperlen-Sterilisator zwischen den Tieren und sterilisieren durch Autoklavieren nach dem Verfahren. Schlauch mit der PBS-Lösung spülen und abtropfen lassen, vollständig abtrocknen und zur weiteren Verwendung aufbewahren. </li></ol> 5. Visualisierung der perfundierten Axolotl <oL&gt; <li> Lege das Axolotl unter ein fluoreszierendes konfokales Mikroskop. </li><li> Schalten Sie die Lichter aus, da die Visualisierung der DiI-gefärbten Gefäße durch Licht beeinträchtigt wird. </li><li> Verwenden Sie einen grünen Fluoreszenz-Emissionsfilter-Würfel ( zB ET-CY3) mit dem konfokalen Mikroskop, um die Vaskulatur des Axolotls zu visualisieren. Verwenden Sie Anregungslicht der Wellenlänge 545 nm. Hinweis: Um ein Bild von hoher Qualität zu erhalten, können folgende Parameter verwendet werden: Belichtung für 1,1 s, Verstärkung von 1x, Sättigung von 1,0, Vergrößerung von 2X. </li></ol>

<ol><li>Giuvarasteanu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy+of+vascular+corrosion+casts+-+standard+method+for+studying+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Rom+J+Morphol+Embryo%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels.</a> Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).</li>
<li>Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+perfusion+of+carbon+black+ink+allows+reliable+visualization+of+cerebral+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels.</a> J Vis Exp. (71), e4374(2013).</li>
<li>Minnich, B., Lametschwandtner, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23328838"> Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues.</a> Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).</li>
<li>Honig, M., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.formatex.info/microscopy4/29-39.pdf"> DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).</li>
<li>Schwartz, M., Agranoff, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outgrowth+and+maintenance+of+neurites+from+cultured+goldfish+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells.</a> Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).</li>
<li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li>
<li>Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4895330/">Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl.</a> Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).</li>
<li>Brockes, J. P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appendage+Regeneration+in+Adult+Vertebrates+and+Implications+for+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine.</a> Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).</li>
<li>Smith, A. R., Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerves+and+angiogenesis+in+amphibian+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration.</a> Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Visualisierung der Vaskulatur des Axolotls kann erfolgreich durch Perfusion mit dem lipophilen Carbocyaninfarbstoff DiI erreicht werden. In dieser Studie beschreiben wir ein neuartiges Protokoll für die Perfusion des Axolotls mit DiI mit einer peristaltischen Pumpe. Wir zeigen auch die anschließende Visualisierung des Axolotl-Gefäßsystems mit einem fluoreszierenden konfokalen Mikroskop. Dieses Protokoll war eine Anpassung des Nagetier-DiI-Perfusionsprotokolls, das in Li et al. 7 , ab...

Die Visualisierung der Vaskulatur spielt eine wesentliche Rolle beim Verständnis der Struktur und Funktion von Organismen über viele Arten hinweg. Ab dem 16. Jahrhundert mit Leonardo da Vinci wurden Modelle und grafische Darstellungen der Zirkulation untersucht 1 . Mit Hilfe von Wachs und Gummi-Formen wurden Gewebe perfundiert, um dreidimensionale Modelle des Gefäßsystems zu schaffen, die das Studium der Organogenese und Pathogenese 1 , 2 erlaubten. Harze und Wachse wurden mit Farbstoffen wie Indien Tinte oder Karminrot gefärbt, um ihre einfache Visualisierung zu ermöglichen 1 , 2 . Allerdings verursachten diese Techniken viele Probleme, weil ihre hohen Viskositäten eine vollständige Perfusion des interessierenden Gewebes verhinderten. Als das Feld anspruchsvoller wurde, kam die Verwendung von konfokalen und Elektronenmikroskopen ins Spiel, indem er die Perfusionstechnologie bewegte<html> Ues weg von Gussformen und zu flüssigen Perfusionen des Gefäßsystems, von denen einige die Perfusion und Bildgebung von Blutgefäßen erlaubt haben, ohne das anfängliche Gewebe 3 zu zerstören. DiI, ein fluoreszierender Carbocyaninfarbstoff, ist ein solcher Fleck, der die Perfusion von Tieren ohne Beschädigung des Gefäßgewebes ermöglicht. Carbocyaninfarbstoffe sind lipophile Farbstoffe, die bei Kontakt in Zellmembranen einfließen. Diese Farbstoffe ermöglichen eine einfache und sofortige Färbung von vaskulären Endothelzellen, die dann unter einem fluoreszierenden konfokalen Mikroskop betrachtet werden können. DiI bewegt sich über laterale Diffusion in der Lipidmembran von Zellen, wie in der Markierung und Verfolgung von Neuronen gezeigt 4 . Chemikalisch geben die beiden Alkylketten von DiI dem Farbstoff seine hohe Affinität für Zellmembranen, während zwei konjugierte Ringe aus einem Fluorochrom, das für die Emission einer roten Wellenlänge verantwortlich ist, wenn es durch grüne Fluoreszenzlichtfilter angeregt wird&gt; 4 DiI wurde in vielen Kapazitäten eingesetzt, darunter die erfolgreiche Markierung der Plasmamembran und sowohl die anterograde als auch die retrograde Markierung in den Neuronen 5 , 6 . DiI wurde zuvor in Perfusionsprotokollen verwendet, während das Vaskulatur von Mäusen sichtbar gemacht wurde 7 . Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) sind Salamander, die exklusiv in Brackseen in der Nähe von Mexiko-Stadt, Mexiko leben. Diese Tiere sind zu einem wichtigen Modell für das Verständnis von regenerativen Prozessen geworden, da sie ganze Gliedmaßen, Schwanz (einschließlich Nervenkabel), Teile des Herzens und anderer innerer Organe und Teile des Auges als Erwachsene 8 , 9 regenerieren können . Darüber hinaus ist mit der jüngsten Anwendung von genetischen Werkzeugen in Axolotten ein beispielloser Einblick in die Moleküle und Zellen, die diese Prozesse durchführen, nun möglich 8 . Das erfolgreiche regeneDie Ration eines ganzen Gliedes erfordert einen umfangreichen Revaskularisierungsprozess, der bei der Regeneration eine wesentliche Rolle spielen kann, die über die traditionellen Funktionen der Blutgefäße bei der Bereitstellung von Sauerstoff und Nährstoffen hinausgeht. Das Verständnis der Revaskularisierung im Kontext der Geweberegeneration ist zwingend erforderlich. Axolotl-Blutgefäße wurden zuvor mit India Ink visualisiert, und während die Ergebnisse faszinierend waren, wurde dieser Prozess in den folgenden Jahrzehnten nicht erneut besucht 10 . Wir suchten ein DiI-Perfusionsprotokoll anzupassen, das für den Einsatz in Säugetieren entwickelt wurde, um eine vollständige Perfusion und Visualisierung des Axolotl-Gefäßsystems zu ermöglichen. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die erfolgreich durchgeführt wurden, um die Axolotl-Zirkulation erfolgreich mit einer DiI-Färbetechnik zu visualisieren und anschließend zu visualisieren. Diese Vorgehensweise ermöglicht eine genaue Visualisierung von Patentblutgefäßen in homöostatischen Geweben sowie in regenerierenden Geweben und stellt eine neuartige Methode zur Visualisierung zur VerfügungN und Analyse des Revaskularisierungsprozesses im Axolotl.

<table><tbody><tr><td>Peristaltische Pumpe&nbsp;</td><td>Marshall Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>RD-RP1</td><td></td></tr><tr><td>Perfusionsschlauch</td><td>Excelon Lab & Vakuumschlauch</td><td>436901705</td><td>Größe S1A</td></tr><tr><td>27g Schmetterlingsnadel</td><td>EXELint Medical Products</td><td>26709</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AmericanBio</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>AmericanBio</td><td>7747-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>AmericanBio</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>AmericanBio</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>AmericanBio</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>ThermoFischer</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>1,1&prime;-Dioctadecyl-3,3,3&prime;,3&prime;- Tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (100% vol/vol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Foreceps&nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDG0748741</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrolschaum Rahmen</td><td></td><td></td><td>jedes Polystyrolschaum Quadrat mit einem Axolotl-förmigen&nbsp; ausgeschnittenen</td></tr><tr><td>Chirurgischen Schere</td><td>Medline</td><td>DYND04025</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell&nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDS15210</td><td></td></tr><tr><td>Saugfähige Unterlage</td><td>Avacare Medical</td><td>PKUFSx</td><td></td></tr><tr><td>Papierhandtücher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard Einweg-Transferpipette</td><td>Fisherbrand</td><td>50216954</td><td></td></tr><tr><td>Klemmständer</td><td>Adafruit</td><td>291</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>Tricain Pulver</td></tr><tr><td>Erwachsene Axolotl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>AmericanBio</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kunststofftanks</td><td></td><td></td><td>Unterschiedliche Größe passend für den Axolotl</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Axolotl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Mikroskop</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>ET-CY3 Fluoreszenzfilter</td><td>Leica</td><td>M205FA/M165FC</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dii perfusion als methode zur vaskulären visualisierung in<em&gt; ambystoma mexicanum</em

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfusionstechniken wurden seit Jahrhunderten verwendet, um die Zirkulation von Geweben zu visualisieren. Axolotl (Ambystoma mexicanum) ist eine Spezies von Salamander, die als ein wesentliches Modell für Regenerationsstudien entstanden ist. Es ist wenig bekannt, wie die Revaskularisierung im Zusammenhang mit der Regeneration bei diesen Tieren auftritt. Hier berichten wir über eine einfache Methode zur Visualisierung des Gefäßsystems in Axolotl über Perfusion von 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanin perchlorat (DiI). DiI ist ein lipophiler Carbocyaninfarbstoff, der sofort in die Plasmamembran von Endothelzellen eindringt. Die Perfusion erfolgt mit einer peristaltischen Pumpe, so dass DiI durch die Aorta in die Zirkulation gelangt. Während der Perfusion fließt der Farbstoff durch die Blutgefäße des Axolotls und schließt sich bei Kontakt in die Lipiddoppelschicht von vaskulären Endothelzellen ein. Das Perfusionsverfahren dauert etwa eine Stunde für ein Acht-Zoll-Axolotl. Unmittelbar nach Perfusion wiDas Diolotl kann mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop visualisiert werden. Der DiI emittiert Licht im rot-orange Bereich, wenn er mit einem grünen Fluoreszenzfilter angeregt wird. Dieses DiI-Perfusionsverfahren kann verwendet werden, um die vaskuläre Struktur von Axolotten zu visualisieren oder Muster der Revaskularisierung in regenerierenden Geweben zu demonstrieren.

<html> Mit der DiI-Färbung kann die Vaskulatur des Axolotls leicht sichtbar gemacht werden. Blutgefäße von Tieren, die mit dem lipophilen Farbstoff perfundiert wurden, sind sofort unter einem fluoreszierenden konfokalen Mikroskop sichtbar. Abbildung 1: 1-1.5 ist eine schematische Darstellung des Perfusionsprotokolls. Nach der Perfusion mit dem hellen rosa Farbstoff wird ein erfolgreich perfundiertes Axolotl rosa erscheinen. M...

Unter Verwendung einer lipophilen 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanin-perchlorat (DiI) -Färbetechnik kann Ambystoma mexicanum eine vaskuläre Perfusion durchlaufen, um eine leichte Visualisierung des Gefäßsystems zu ermöglichen.

DiI Perfusion als Methode zur vaskulären Visualisierung in<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Gefäße des Axolotl sichtbar zu machen. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der regenerativen Medizin bezüglich der komplexen Neubildung von Blutgefäßen in regenerierendem Gewebe des Axolotl zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik zur Visualisierung der Gefäße liegt darin, dass alle Blutgefäße des Tieres einfach mit einem standardmäßigen Fluoreszenzmikroskop abgebildet werden können.Obwohl diese Methode Einblicke in die Gliedmaßenregeneration des Axolotls ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Gewebe wie den Schwanz, das Herz, die Augen, die Kiemen oder andere Organe anwendbar. Bevor die Brust des Axolotls geöffnet wird, bestätigen Sie zunächst den angemessenen Sedierungszustand durch einen Zehenquetschtest. Anschließend verwenden Sie chirurgische Pinzette, um die Haut entlang der Mittelachse der Brust, knapp unterhalb der Schulterlinie, zu quetschen.Erstellen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt an der Stelle, an der die Haut nach oben gezogen wurde, und entfernen Sie ein quadratisches Hautareal über der Brust, um zwei Knorpelplatten freizulegen. Öffnen Sie anschließend ein Fenster über der Brusthöhle und lösen Sie vorsichtig das Bindegewebe, ohne größere Blutgefäße zu verletzen. Heben Sie mit einer Pinzette jede Knorpelplatte einzeln an und entfernen Sie sie mit einer chirurgischen Schere.Pinzieren Sie das freigelegte Perikard vorsichtig mit der Pinzette. Heben Sie das Gewebe leicht an und durchtrennen Sie es mit der chirurgischen Schere, dabei nur so tief einstechen, dass das Perikard entfernt werden kann, ohne das Herz zu verletzen. Entfernen Sie anschließend das Perikard vorsichtig, um das Herz und die Aorta freizulegen, sodass das Herz im Bereich von etwa fünf Millimetern der Aorta, die vom Herzen abzweigt, gut sichtbar ist.Um den Axolotl zu perfundieren, stellen Sie einen Klemmständer mit einer beladenen Butterfly-Kanüle neben einen Polystyrolrahmen, sodass der Arm der Klemme leicht für die Kanüleninsertion manipuliert werden kann. Schalten Sie eine peristaltische Pumpe ein, um 0,7x PBS durch die Schlauchleitung der Pumpe zu spülen, und richten Sie die Kanülesspitze in Richtung des rostralen Bereichs aus. Führen Sie die Pinzette unter den Aortenbogen und heben Sie leicht an.Bewegen Sie dann die Nadel-Klemm-Kombination so, dass die Nadel entlang der Länge der Aorta in Richtung des Tierkopfes verläuft, und führen Sie die Nadel etwa fünf Millimeter in die Aorta ein, wobei die Pinzette zur Unterstützung hinter der Aorta verbleibt. Ein erfolgreicher Einstich kann durch eine sichtbare Vergrößerung der Herzvorhöfe bestätigt werden. Schlagen Sie umgehend einen Vorhof an und lassen Sie das Blut abfließen.Anschließend spülen Sie den Axolotl mit etwa 20 bis 30 Milliliter PBS durch. Nach einer erfolgreichen Durchspülung sollte sich die Farbe des Tieres von hellrosa zu weiß verändern. Sobald der gesamte PBS durchgespült ist, stoppen Sie die peristaltische Pumpe und bringen das freie Ende des Schlauchs in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit Dil-Lösung.Starten Sie die Pumpe erneut und achten Sie darauf, keine Blasen in der Schlauchleitung zu erzeugen. Perfundieren Sie das Tier mit der gesamten verfügbaren Dil-Stammlösung. Bei einer erfolgreichen Perfusion verändert sich die Farbe des Axolotls zu einem hellen Rosa, was besonders an den Kiemen deutlich wird. Sobald die gesamte Dil-Lösung perfundiert ist, stoppen Sie die Pumpe und legen Sie das freie Ende der Schlauchleitung in eine 4 %ige Paraformaldehydlösung.Starten Sie dann die Pumpe erneut und perfundieren Sie mindestens 10 Milliliter des Fixativs. Sobald das gesamte Paraformaldehyd verabreicht wurde, stoppen Sie die Pumpe und entfernen Sie die Nadel. Überführen Sie den Axolotl in eine Plastikschale und stellen Sie die Schale auf den Objekttisch eines Fluoreszenzmikroskops.Danach bei ausgeschaltetem Licht einen Filter auswählen, der die Anregung von Dil ermöglicht, welches ein rot-oranges Licht emittiert. Nach einer erfolgreichen Perfusion ist die Dil-Färbung als rotes Emissionsignal in allen Geweben des Axolotl sichtbar, einschließlich Schwanz, Gliedmaßen, Kiemen und Augen. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb einer Stunde abgeschlossen werden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, die großen Blutgefäße oder das Herz nicht zu verletzen, wenn die Brusthöhle geöffnet wird, und die Nadel entlang der Aorta einzuführen, um Durchstichverletzungen zu vermeiden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie beispielsweise Skelettaufbereitungen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu untersuchen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern im biomedizinischen Bereich den Weg, die Gefäßversorgung verschiedener Arten zu erforschen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Herzdurchspülung des Axolotl mit dem Carbocyaninfarbstoff Dil durchführt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Nadeln und Paraformaldehyd äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, beispielsweise das Tragen der geeigneten persönlichen Schutzausrüstung, während des Durchführens des Verfahrens.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die modifizierte Landis-Technik ermöglicht die paarweise Messung der hydraulischen Leitfähigkeit einzelner Mikrogefäße im Mesenterium von normalen und genetisch veränderten Ratten unter Kontroll- und Testbedingungen unter Verwendung von Mikroperfusionstechniken. Es bietet eine bequeme Methode zur Bewertung von Mechanismen, die die Durchlässigkeit von Mikrogefäßen und den transvaskulären Austausch unter physiologischen Bedingungen regulieren.

Mikroperfusion Technik zur Untersuchung von Mikrogefäßdurchlässigkeit Verordnung in Rattengekröse

Dieses Protokoll zeigt eine fluoreszenzbasierte Methode zur Visualisierung der Vaskulatur und zur Quantifizierung ihrer Komplexität in Xenopus tropicalis . Blutgefäße können nach der Injektion eines fluoreszierenden Farbstoffs in das schlagende Herz eines Embryos nach genetischen und / oder pharmakologischen Manipulationen abgebildet werden, um die kardiovaskuläre Entwicklung in vivo zu untersuchen.

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Hier präsentieren wir Ihnen Echokardiographie Protokolle für zwei- und dreidimensionale Bilderfassung des schlagenden Herzens der Axolotl Salamander (Z.B. geschieht), ein Modell-Arten im Herzen Regeneration. Diese Methoden ermöglichen längs-Beurteilung der Herzfunktion mit einer hohen räumlich-zeitliche Auflösung.

2D und 3D Echokardiographie in der Axolotl (Z.B. geschieht)

Der Artikel beschreibt ein schnelles Protokoll für die Beschriftung von Blutgefäßen in einem teleost Fisch durch Herzvermischung von DiI verdünnt in Fixierung, mit medaka(Oryziaslatipes) als Modell und die Konzentration auf Gehirn und Hypophyse Gewebe.

Kennzeichnung von Blutgefäßen im Teleost Gehirn und Pituitary mit Herz-Perfusion mit einem DiI-Fixative

Ein Protokoll wird für die In-situ-Perfusion des Unterkörpers der Maus beschrieben, einschließlich der Blase, der Prostata, der Geschlechtsorgane, des Knochens, des Muskels und der Fußhaut.

Etablierung von In Situ Closed Circuit Perfusion von unteren Bauchorganen und Hinterbeinen bei Mäusen

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein einzigartiges, klinisch relevantes Modell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit, das die Elektrokoagulation der Oberschenkelarterie und der Venen mit der Verabreichung eines Stickstoffmonoxid-Synthase-Inhibitors kombiniert, um bei FVB-Mäusen Gangrän der Hintergliedmaßen zu induzieren. Die intrakardiale DiI-Perfusion wird dann für die hochauflösende, dreidimensionale Bildgebung des Gefäßes des Fußpolsters verwendet.

Hochauflösende dreidimensionale Abbildung der Fußpolstervaskulatur in einem murinen Hinterbein-Gangränmodell

Hier wird ein effektives Protokoll zur schnellen Blutperfusion vorgestellt, um Gewebeproben von afrikanischen Krallenfröschen für Transkriptomik- und Proteomik-Studien vorzubereiten.

Effektive schnelle Blutdurchblutung bei Xenopus

Dieses Protokoll stellt ein physiologisch relevantes Tumor-on-a-Chip-Modell vor, um Hochdurchsatz-Grundlagen- und translationale Krebsforschung am Menschen durchzuführen und das Arzneimittel-Screening, die Krankheitsmodellierung und Ansätze der personalisierten Medizin mit einer Beschreibung von Lade-, Wartungs- und Bewertungsverfahren voranzutreiben.

Etablierung eines physiologischen humanen vaskularisierten Mikrotumormodells für die Krebsforschung

Dieses Protokoll stellt eine schnelle Methode für die quantitative dreidimensionale Gefäßbildgebung mit Hilfe der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie vor. Die Wirksamkeit der Methode wird anhand des pharyngealen Bogenarteriensystems des Hühnerembryomodells demonstriert, wobei die hämodynamischen Kräfte mittels Computational Fluid Dynamics quantifiziert werden.

Schnelle hochauflösende Bildgebung des Gefäßsystems von Kleintieren für quantitative Studien

Dieses Protokoll enthält eine ausführliche Beschreibung eines Schritt-für-Schritt-Ansatzes für ein chronisches Schädelfenster- und mikrovaskuläres Embolismus-Mausmodell, das für die in vivo Zweiphotonenmikroskopie mit fluoreszierenden Polystyrol-Mikrosphären optimiert ist.

Mikrovaskuläres Embolismus-Mausmodell für die In-vivo-Zweiphotonenmikroskopie mit fluoreszierenden Polystyrol-Mikrosphären

Lernen Sie die DiI-Perfusionsmethode zur vaskulären Visualisierung bei Ambystoma mexicanum. Diese Technik ermöglicht die Fluoreszenzmikroskopie aller Blutgefäße und liefert wertvolle Erkenntnisse für die regenerative Medizin.

DiI Perfusion als Methode zur vaskulären Visualisierung in

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