Vorbereitung von Plasmamembran-Vesikeln aus Knochenmark Mesenchymale Stammzellen für potentielle Zytoplasma-Ersatztherapie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, dem Gastrocnemius-Muskel von Mäusen eine neuartige Zytoplasmaersatztherapie unter Verwendung von Plasmamembranvesikeln (PMVs) zu liefern, die aus mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks der Maus oder BMSCs gewonnen werden. Diese Methode kann helfen, Fragen zu beantworten: Die Supplementierung von Zellen mit jungem Zytoplasma aus anderen BMSC mittels PMV-Fusion kann die altersassoziativen Phänotypen verbessern oder sogar umkehren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die PMV-Verkapselung von BMSC-Zytosol sofort durch eine mechanische Extrusion induziert werden kann.

Wenn Sie diese Methode demonstrieren, ist dies von entscheidender Bedeutung, da Sie extrudieren und Konstruktionsschritte nur schwer erlernen können, indem Sie testen, um sie tatsächlich zu besitzen. Zur Erzeugung der PMVs werden zunächst Maus-BMSCs in vollständigem DMEM-Kulturmedium in einer Vertiefung einer Sechs-Well-Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid kultiviert. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreicht haben, spülen Sie die Vertiefung mit 0,5 Millilitern kalziumfreiem PBS und lösen Sie die Zellen mit 0,5 Millilitern 0,25 % Trypsin-EDTA ab.

Nach drei Minuten bei 37 Grad Celsius klopfen Sie einige Male mit der Handfläche auf die Platte, um die Zelldissoziation zu erleichtern und die Verdauung mit einem Milliliter Nährmedium zu stoppen. Übertragen Sie die Zellen zur Zentrifugation in ein konisches Fünf-Milliliter-Röhrchen und resuspendieren Sie das Pellet in vier Millilitern frischem Kulturmedium. Teilen Sie dann die Zellen auf zwei Vertiefungen einer neuen Sechs-Well-Platte auf und stellen Sie die Platte für 24 Stunden wieder in den Zellkultur-Inkubator.

Ernten Sie am nächsten Tag die Zellen aus einer Vertiefung durch Trypsinverdauung, wie gerade gezeigt. Resuspendieren des Pellets in 0,5 Millilitern frischem Nährmedium nach der Entnahme durch Zentrifugation. Laden Sie die Zellen in eine Ein-Milliliter-Insulinspritze und befestigen Sie die Spritze an einer Filtereinheit.

Drücken Sie schnell auf den Kolben, um die Zellen durch den Filter zu drücken, und verwerfen Sie das extrudierte Medium. Laden und dosieren Sie dann 0,5 Milliliter zusätzliches Kulturmedium durch den Filter, wie gerade gezeigt, und sammeln Sie das Medium aus der zweiten Extrusion. 150 Mikroliter des gesammelten Mediums in eine 35-Milliliter-Glasbodenschale säen und die Vesikel etwa 10 Minuten ruhen lassen.

Bestätigen Sie dann das Vorhandensein von PMVs unter einem inversen Phasenkontrastmikroskop, das mit einer CCD-Kamera ausgestattet ist, unter Verwendung eines 20-fach-Objektivs. Um das mitochondriale Gehäuse und das Membranpotenzial in den PMVs zu verfolgen, färben Sie eine 90%ige konfluente BMSC-Kultur mit einem geeigneten mitochondrialen Farbstoff bzw. einer mitochondrialen Membranpotentialsonde in frischem Kulturmedium für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Spülen Sie dann die Zellen dreimal mit 0,5 Millilitern PBS pro Waschgang und ernten Sie die Zellen durch Trypsinverdau zur PMV-Erzeugung, wie gerade für ihre Visualisierung durch konfokale Mikroskopie gezeigt

Um die zytoplasmatische Lokalisation der PMV-Proteine zu verfolgen, verdünnen Sie zunächst zwei Mikrogramm supercoiled Plasmid-DNA für eine EGFP-Expressionskassette und sechs Mikroliter kationisches Transfektionsreagenz in einzelnen 0,5-Milliliter-Röhrchen, die 50 Mikroliter serumfreies DMEM enthalten. Die Röhrchen werden mit einem Wirbel verwirbelt, gefolgt von einer kurzen Zentrifugation. Geben Sie dann das Transfektionsreagenz tropfenweise in das Röhrchen mit der verdünnten DNA-Lösung.

Die DNA-Transfektionsmischung eine Minute lang robust vortexen, gefolgt von einem kurzen Schleudern in einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur. Füttern Sie als Nächstes eine 30%ige konfluente BMSC-Kultur in einer Sechs-Well-Platte mit zwei Millilitern frischem Kulturmedium und geben Sie die DNA-Mischung tropfenweise in die Zellen. 48 Stunden nach ihrer Transfektion wird das BMSC durch Trypsinverdau geerntet und die PMVs wie gerade gezeigt hergestellt.

Die PMVs können dann durch konfokale Mikroskopie mit einem 100-fach-Ölobjektiv analysiert werden. Vor der Injektion der PMVs wird eine BMSC-Kultur mit einem membranfärbenden fluoreszierenden Zelltracker-Farbstoff in einem Milliliter frischem Kulturmedium bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten markiert und die Zellen durch Trypsinverdau geerntet. Resuspendieren Sie die markierten Zellen in 0,5 Millilitern frischem Kulturmedium, das mit einem Mikrogramm Polyethylenamin ergänzt wird, und bereiten Sie PMVs wie gezeigt vor.

Konzentrieren Sie dann die PMVs durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern frischem Nährmedium unter leichtem Schwenken. Als nächstes laden Sie die Zellen in eine Ein-Milliliter-Insulinspritze, die mit einer 30-Gauge-Nadel ausgestattet ist, und desinfizieren Sie die Außenseite des Gastrocnemius-Muskels einer anästhesierten BALB/c-Maus mit 75%Ethanol. Injizieren Sie dann langsam das gesamte Volumen der PMVs in den Muskel und lassen Sie das Tier unter einer Wärmelampe genesen.

Streuen Sie nach 12 Stunden 75% Ethanol über den Muskel, öffnen Sie die Haut mit einer Schere und entnehmen Sie den gesamten Gastrocnemius-Muskel an beiden Enden. Spülen Sie den Muskel mit PBS und legen Sie ihn unter ein Fluoreszenzmikroskop. Mit der 20-fach-Objektivlinse die nicht fluoreszierenden Muskelgewebsstücke mit einer scharfen Rasierklinge entfernen und die restlichen stark rot fluoreszierenden Stücke in etwa neun Kubikmillimeter große Würfel zerkleinern.

Betten Sie jeden Würfel in ein Medium mit optimaler Schnitttemperatur ein. Tauchen Sie die Würfel dann fünf Minuten lang in flüssigen Stickstoff. Und lagern Sie die Gewebeproben bis zu ihrer Analyse bei minus 20 Grad Celsius.

PMVs, die aus BMSCs erzeugt wurden, weisen überwiegend eine Größe im Bereich von etwa drei Mikrometern Durchmesser auf, wie sie in der Phasenkontrastmikroskopie mit dem 20-fach-Objektiv untersucht wurde. Die BMSC-Transfektion mit einer fluoreszierenden Expressionskassette für 48 Stunden veranschaulicht die zytoplasmatische Verkapselung des EGFP-Proteins durch die PMVs. Darüber hinaus zeigt sich bei einem fluoreszierenden mitochondrialen Farbstoff, dass ein großer Teil der PMVs Mitochondrien enthält.

Die Mehrzahl von ihnen ist positiv für einen mitochondrialen Membranpotentialfarbstoff, der auf die Funktionalität der Mitochondrien hinweist. Die Behandlung mit Polyethylen-Aminen vor der En-vivo-Verabreichung verhindert die PMV-Aggregation während ihrer Zentrifugalkonzentration zur Entfernung zellulärer Bestandteile. Die Membranfarbstoffmarkierung der BMSCs vor der PMV-Generierung erleichtert die Erzeugung von fluoreszenzverfolgbaren PMVs.

In der Tat deutet die Visualisierung von gefrorenen Schnitten des Musculus gastrocnemius nach intramuskulärer Verabreichung von markierten PMVs auf eine PMV-Abgabe an das Zytoplasma der Muskelzellen hin, wahrscheinlich über Endozytose. Wenn Sie versuchen, das PMV-Erzeugungsverfahren durchzuführen, ist es wichtig, daran zu denken, die Spritze mit der richtigen Anzahl von Zellen zu befüllen, um den Kolben schnell zu drücken, wenn die Zellen durch den Filter gespült werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Stammzelltherapie, um die Behandlung von altersbedingten Krankheiten bei Mäusen zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie PMV aus BMSC für die Abgabe von Zytoplasma in den Gastrocnemius-Muskel von Mäusen vorbereiten können.