Reinigung von biotinylierten Zelloberflächenproteinen aus Rhipicephalus microplus Epithel-Darmzellen

Reinigung von biotinyliertem Zelloberflächenprotein aus Rhipicephalus microplus epithelialen Darmzellen. Im Rahmen dieser Studie wurde eine modifizierte Percoll-Gradienten-basierte Methodik verwendet, um einzelne Epithelzellen aus Rhipicephalus microplus Darmgewebe zu isolieren. Oberflächengebundene Proteine wurden biotinyliert und durch Streptavidin-Magnetbeads für den Einsatz in Downstream-Anwendungen aufgereinigt.

Dissektion des Darmepithels aus halbgeschwollenem Rhipicephalus microplus. Sie benötigen die folgenden Materialien. Kleben Sie einen Streifen Klebeband auf den Boden einer Petrischale.

Gib einen Tropfen Sekundenkleber auf das Klebeband. Lege die Zecke mit der Bauchseite nach unten auf den Sekundenkleber und lass sie trocknen. Tauchen Sie die Zecke vollständig in 100 ml PBS ein.

Schneiden Sie mit einem Skalpell der Größe 11 von der Oberseite der Augen bis zu den unteren Girlanden auf beiden Seiten der Zecke. Entfernen Sie mit einer sterilen Pinzette das Scutum und das Alloscutum vollständig, um die inneren Organe freizulegen. Entferne die feinen weißen, fadenförmigen Organe und andere Membranen.

Entfernen Sie den Darm mit einer Pinzette. Lagern Sie den Darm in eiskaltem HBSS und PIC. Dissoziation von Epithelzellen.

Sie benötigen die folgenden Materialien. Gießen Sie den präparierten Darm auf ein 70-Mikron-Zellsieb in einem 50-ml-Falcon-Röhrchen. Da sich im Falcon-Rohr ein Vakuum bilden kann, heben Sie den Filter an, um die Luftzirkulation zu ermöglichen.

Spülen Sie das Darmgewebe mit 50 mL eiskaltem HBSS mit PIC. Resuspendieren Sie den Darm in 30 mL eiskaltem HBSS mit PIC. Verwenden Sie bei Bedarf einen sterilen Schaber, um die Darmresuspension zu unterstützen.

Bei 500 g zentrifugieren. Den Überstand entfernen und den Waschvorgang dreimal wiederholen. Resuspendieren Sie die Darmzellen in 10 ml DMEM, 2 % FCS, 5 Millimolar EDTA, einem Millimolar TCEP und PIC.

Vorsichtig mischen. 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius unter langsamer Rotation mit einer Walze inkubieren. Filtern Sie die Suspension durch ein 250-Mikron-Zellsieb.

Wirbeln Sie die Strömung durch. Und filtrieren Sie durch ein 70-Mikron-Zellsieb und sammeln Sie den restlichen Durchfluss. Die Suspension zentrifugieren.

Isolierung einzelner Epithelzellen mit Hilfe eines Percoll-Gradienten. Sie benötigen die folgenden Materialien. Durch Filtrieren durch AP15-Vorfilterpapier werden 40 % und 20 % Percoll in Milli-Q Wasser zubereitet.

Laden Sie eine sterile Spritze mit der Percoll-Lösung. Tragen Sie es auf das Filterrigg auf und entleeren Sie langsam das Percoll. Kühlen Sie eine Stunde lang bei vier Grad Celsius ab, bevor Sie den Farbverlauf schichten.

Richten Sie die Schlauchpumpe wie abgebildet ein. Mit einem Schlauchpumpenset bei niedrigster Drehzahl drei ml 40 % Percoll in ein 16 mL Ultrazentrifugenröhrchen schichten. Lassen Sie es 15 Minuten auf Eis ruhen.

Die Drehzahl der Pumpe sollte zu einer Durchflussrate von weniger als einem ml pro Minute führen. Kippen Sie den Schlauch in einem Winkel von 45 Grad und verwenden Sie die Peristaltikpumpe, um das 20%ige Percoll auf die 40%ige Schicht zu schichten. Stellen Sie sicher, dass das Ausgangsrohr am Zentrifugenröhrchen anliegt, um zu verhindern, dass sich Tröpfchen mit den unteren Schichten vermischen.

Die Drehzahl der Pumpe sollte zu einer Durchflussrate von weniger als einem ml pro Minute führen. Lassen Sie die Schichten 15 Minuten lang auf dem Eis ruhen. Verwendung der Peristaltikpumpe mit einer Durchflussrate von weniger als einem ml pro Minute zur Schicht von drei ml DMEM-Lösung, die die isolierten Epithelzellen enthält, über den Percoll-Gradienten von 20 bis 40 %.

Stellen Sie sicher, dass das Ausgangsrohr am Zentrifugenröhrchen anliegt, um zu verhindern, dass sich Tröpfchen mit den unteren Schichten vermischen und den Gradienten stören. Bei 600 g 10 Minuten zentrifugieren. Sammeln Sie Interphasen zwischen dem DMEM, dem 20%Percoll-Gradienten und den 20%40%Percoll-Gradienten, um epitheliale Einzelzellen zu isolieren.

Biotinylierung von Zelloberflächenproteinen und die Isolierung von biotinylierten Oberflächenproteinen. Sie benötigen die folgenden Materialien. Biotinylat 100 Mikroliter einzelliger Epithelzellen mit dem Biotin Typ A Konjugationskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Geben Sie 100 Mikroliter PBS, 1% Triton X-100, 10% Glycerin, 100 Mikromol oxidiertes Glutathion und PIC zu den biotinylierten Zellen. Eine Stunde lang auf Eis inkubieren und alle 10 Minuten sanft mischen. Den Zellextrakt bei 20.000 g bei vier Grad Celsius 20 Minuten zentrifugieren und beiseite stellen.

Bereiten Sie 50 Mikroliter magnetische Streptavidin-Kügelchen vor, indem Sie sie mit 1.000 Mikrolitern TBS 1%Tween-20 waschen. Vorsichtig mischen, indem Sie mit dem Finger schnippen. Legen Sie das Rohr in einen Magnetständer und sammeln Sie die Perlen an der Seite des Rohrs.

Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Kombinieren Sie 300 Mikroliter biotinylierte Zelloberflächenproteine mit gewaschenen magnetischen Kügelchen. Zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren inkubieren.

Sammeln Sie die Perlen mit dem Magnetständer, entfernen Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn. Geben Sie 300 Mikroliter TBS 1%Tween-20 in das Röhrchen und mischen Sie vorsichtig, um die Kügelchen wieder zu resuspendieren. Sammle Perlen, entferne und entsorge den Überstand.

Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal. Geben Sie 100 Mikroliter des 1 molaren Glycins pH zwei zu den magnetischen Kügelchen. Und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Sammeln Sie Kügelchen und entfernen Sie Überstände, die eluierte biotinylierte Oberflächenproteine enthalten. Abbildung eins zeigt eine Darstellung des Protokolls, das zur Isolierung von Epithelzellen und ihren Oberflächenproteinen aus einer ganzen Zecke verwendet wird. Unter Verwendung dieses Protokolls können etwa 1,2 x 10 bis sieben Zellen pro ml mit einer Lebensfähigkeit von 75 bis 80 % und 20 bis 24 Mikrogramm gereinigter biotinylierter Oberflächenproteine aus einer anfänglichen Dissektion von 50 Zecken gereinigt werden.

Repräsentative Fluoreszenzmikroskopie-Bilder von Zecken-Epithelzellen, die mit diesem Protokoll hergestellt wurden, sind in den Abbildungen 2A und 2B dargestellt. Die Zellen erscheinen als singuläre, kugelförmige, glatte Oberflächenmorphologie und eine konsistente Größe in der gesamten Probe. Es wird visualisiert, dass schlechte Isolierungen eine unvollständige Dissoziation einzelner Epithelzellen mit unterschiedlichen Zellpopulationen enthalten, die durch die unterschiedlichen Zellgrößen und Morphologien identifiziert werden.

Die Kreuzkontamination durch Wirtsproteine, Abbildung 3A, kann minimiert werden, indem Zeckendärme ausreichend gespült werden, um einen weißen oder klaren Percoll-Gradienten zu erzeugen, Abbildung 3B. Der Vergleich von Proteinen mittels SDS-PAGE, Abbildung 4A, Silberfärbung, Abbildung 4B, Dot Blot, Abbildung fünf, und ELISA, Abbildung sechs, zeigt, dass die beschriebenen Methoden erfolgreich biotinylierte Oberflächenproteine aus einzelnen Epithelzellen gereinigt haben, die aus Rhipicephalus microplus Zeckendärmen isoliert wurden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in dieser Studie verwendeten Methoden erfolgreich einzelne Epithelzellen aus dem gesamten Darm von Rhipicephalus microplus isoliert haben.

Proteine von der Oberfläche von Rhipicephalus microplus-Epithelzellen wurden für weitere Analysen und Studien gewonnen. Schließlich hat das entwickelte Protokoll die potenzielle Ausbeute einzelner Epithelzellen aus dem Zeckendarm und die Effizienz von biotinylierten Oberflächenproteinen der Zelle demonstriert. Das entwickelte Protokoll kann bei jeder Zeckenart von wirtschaftlicher Bedeutung eingesetzt werden, um Zecken-Wirt-Wechselwirkungen zu untersuchen, indem die Membranproteinzusammensetzung des Darms untersucht wird.