Nachweis Estrogenic Liganden in Körperpflege-Produkte mit einer Hefe Östrogen Bildschirm optimiert für Undergraduate Teaching Labor

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe eines Hefe-Östrogen-Screens menschliche Östrogenrezeptor-Agonisten zu quantifizieren, die aus Körperpflegeprodukten extrahiert wurden. Diese Methode kann wichtige Fragen auf dem Gebiet der Toxikologie, der endokrinen Störungen und der Ökophysiologie beantworten, da sie Umweltöstrogene in Wasser, Lebensmitteln und Körperpflegeprodukten nachweist und quantifiziert. Die wesentlichen Vorteile dieser In-vitro-Technik liegen in ihrer Kostengünstigkeit, ihrer weiten Verbreitung und der hervorragenden Eignung als Lehrplattform für laborwissenschaftliche Fertigkeiten.

Der Nachweis von Umweltöstrogenen ist entscheidend, da sie hormonelle Signalwege beeinflussen können, insbesondere während der fetalen Entwicklung und in Phasen physiologischer Übergänge wie der Pubertät. Die schwierigsten Teile dieser Methode sind die Berechnungen und die Datenanalyse, die wir durch die Entwicklung einer benutzerfreundlichen Anwendung vereinfacht haben. Außerdem ist ein genaues Pipettieren unerlässlich.

Dieses Protokoll beginnt mit der Herstellung der Reagenzien. Bereiten Sie Glucose- und Galactose-Medien, Fahrzeugkontrollen mit 50 % Ethanol sowie Estradiol-Standards vor, die am ersten Tag des Assays verwendet werden, sowie LacZ-Puffer, Dithiothreitol und Natriumcarbonat für den zweiten Tag. Sterilisieren Sie die Glucose- und Galactose-Medien durch Filtration über einen 0,2-Mikrometer-Filter.

Bis zu 23 verschiedene Körperpflegeprodukte oder PCPs und Extraktionskontrollen können in einer 96-Well-Platte im Dreifachansatz getestet werden. Zu den PCPs gehören Seife, Haarcreme, Shampoo, Sonnenschutzmittel, Make-up, Rasiercreme und Lotion. Für die Dreharbeiten werden Proben aus lediglich acht PCPs vorbereitet.

Vereinigen Sie ein Gramm jeder Probe mit 10 Millilitern wasserfreiem Ethanol in einem 15-Milliliter-Konischkolben. Bereiten Sie zusätzlich eine negative Extraktionskontrolle aus 11 Millilitern wasserfreiem Ethanol in einem 15-Milliliter-Konischkolben vor. Homogenisieren Sie den Inhalt jedes Konischkolbens 30 Minuten lang durch Kombination von manuellem Schütteln und Vortexen.

Zentrifugieren Sie die kegelförmigen Röhrchen mit der maximal zulässigen Geschwindigkeit in einer Schwenkköbelzentrifuge für 10 Minuten. Gießen Sie das Überstandvolumen aus jedem Röhrchen über einen 40-Mikrometer-Zellfilter in ein 50-Milliliter-Kegelröhrchen. Übertragen Sie anschließend den Inhalt jedes 50-Milliliter-Röhrchens in ein Glas-Szintillationsfläschchen.

Lassen Sie das Ethanol vollständig verdunsten, indem Sie die Gefäße eine Woche lang offen in einer belüfteten Abzugshaube stehen lassen. Schützen Sie die trocknenden Proben vor Licht, um eine Zersetzung lichtempfindlicher Bestandteile zu vermeiden. Wenn die Proben trocken sind, lösen Sie jede Probe in einem Milliliter 50%igem Ethanol wieder auf und mischen sie anschließend durch Vortexen, um eine Homogenisierung zu erreichen.

Zwei Nächte oder etwa 42 Stunden vor der Herstellung der Hefe-Östrogen-Screening- oder YES-Platten die Hefe mittels steriler Technik unter Zugabe von jeweils 0,1 Milliliter jeder aktiven Hefekultur zu 10 Milliliter filtersterilisiertem Glucose-Medium in einem sterilen Erlenmeyerkolben unterkultivieren. Bei 30 Grad Celsius inkubieren und die ursprünglichen Kulturen als Stammlösungen weiter inkubieren. Zwei Tage später, am ersten Tag des YES-Assays, die suspendierten Hefekulturen unter Verwendung steriler Technik sowie das filtersterilisierte Galactose-Medium in einem sterilen Becher verdünnen.

Überprüfen Sie die optische Dichte, indem Sie jeweils 120 Mikroliter jeder Hefe-Probe im Triplikat sowie Triplikate von Galactose-Medien-Blanks in eine klare Polystyrolplatte pipettieren. Verwenden Sie ein Platten-Spektrophotometer, um zu bestätigen, dass die verdünnte Hefe-Kultur eine netto optische Dichte von 0,065 ± 0,005 bei einer Wellenlänge von 610 Nanometern aufweist. Bestimmen Sie die netto OD610 der Hefe, indem Sie die OD610 der Galactose-Medien-Blanks subtrahieren.

Unter Verwendung eines Wiederholungspipettiers mit einer sterilen Spritzenpitette geben Sie die verdünnte Hefesuspension gemäß diesem Plattenlayout in die Vertiefungen einer sterilen 96-Loch-Mikrotiterplatte aus Polypropylen. Während des Pipettierens halten Sie die Hefe in der Ausgangssuspension durch kontinuierliches Schwenken des Bechers oder Durchmischen mit der Pipette. Zuletzt geben Sie 120 Mikroliter filtersterilisiertes Galactosemedium in die Vertiefungen H10 bis H12, die im Plattenlayout grün markiert sind, um als Medienkontrollen zu dienen, die für Absorbanzen korrigieren, die allein durch das Medium verursacht werden.

Stellen Sie separate Platten für jede Kombination von Hefe-Stamm und kalorimetrischem Substrat her, die getestet werden soll. Erstellen Sie anschließend in jeder Platte eine Standardkurve durch serielle Verdünnung gemäß dem Plattenlayout. Verwenden Sie einen Ein-Kanal-Pipettierer mit sterilen Spitzen, um fünf Mikroliter Estradiol-Standard in die Wells A2, A2 und A3 zu geben. Mischen Sie den Inhalt der Wells mit einem Mehrkanal-Pipettierer durch Auf- und Abpipettieren und übertragen Sie anschließend 205 Mikroliter von den Wells A1 bis A3 in die Wells B1 bis B3. Wiederholen Sie die Übertragung von 205 Mikrolitern bis zur Reihe G. Nach Abschluss der seriellen Verdünnung entsorgen Sie 205 Mikroliter aus den Wells G1 bis G3. Am Ende dieses Schritts sollten alle Standard-Well 120 Mikroliter enthalten.

Geben Sie fünf µL 50 % Ethanol zu jedem Fahrzeugkontrollbrunnen hinzu, der die Hefesuspension enthält, die Brunnen H1, H2 und H3, die in diesem Plattenlayout blau markiert sind. Im nächsten Schritt werden je fünf µL der Proben oder negativen Extraktionskontrollen in dreifachen Ansätzen zu den Brunnen hinzugefügt, die die Hefesuspension enthalten und im Plattenlayout lila markiert sind. Notieren Sie, welche Proben oder Extraktionskontrollen in welche Brunnen gegeben wurden.

Um im Überblick zu behalten, welche Wells Proben enthalten und welche nicht, beginnen Sie mit einer neuen Tipp-Box und verwenden Sie Tipp-Spitzen an denselben Positionen in der Box, wie die entsprechenden Wells in der Platte angeordnet sind. Mischen Sie den Inhalt der Probe-, Extraktionskontroll- und Fahrzeugkontroll-Wells durch Pipettieren. Stellen Sie die Volumina dieser Wells auf 120 Mikroliter ein, indem Sie jeweils 205 Mikroliter entfernen.

Versiegeln Sie jede Platte mit einem sterilen, klebenden, porösen Film, beschriften Sie sie und inkubieren Sie sie 17 Stunden lang bei 30 Grad Celsius. Entfernen Sie die Platten nach der 17-stündigen Inkubation aus dem Inkubator. Falls die Platten nicht sofort verarbeitet werden können, wickeln Sie sie in Frischhaltefolie ein und lagern Sie die verpackten Platten sechs Tage lang bei vier Grad Celsius im Kühlschrank.

Wenn die Platten verarbeitet werden sollen, nehmen Sie die Verpackung ab. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette den Inhalt jeder Reihe von Vertiefungen frei und übertragen anschließend 50 µL Hefesuspension von jeder Vertiefung in die entsprechende Vertiefung einer klaren Polystyrol-96-Well-Mikrotiterplatte. Beschriften Sie die neue Platte.

Um eine Kreuzkontamination der Vertiefungen zu vermeiden, verwenden Sie für jede Vertiefung eine neue Pipettenspitze; die Spitzen müssen jedoch nicht steril sein. Geben Sie in einem Abzug 20 Mikroliter einer einmolaren DTT-Lösung zu 20 Millilitern aufgetautem LacZ-Puffer mit Raumtemperatur, um eine Endkonzentration von einem Millimolar DTT zu erreichen. Mischen Sie den LacZ-Puffer gründlich.

Unter Verwendung eines Wiederholungspipettiers geben Sie 200 Mikroliter LacZ-Puffer, der DTT und entweder ONPG oder CPRG enthält, in alle Vertiefungen der Polystyrolplatte und messen sofort die optische Dichte bei 610 Nanometern aller Vertiefungen mithilfe eines Plattenlesegeräts. Wiederholen Sie dies bei Bedarf für zusätzliche Platten. Decken Sie die Platten mit einem Deckel ab und inkubieren Sie sie für die angegebenen Zeiträume bei 30 Grad Celsius.

Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator. Geben Sie mithilfe einer Mehrfachpipette 100 Mikroliter Natriumcarbonat in jedes Loch, um die Beta-Galactosidase-Reaktion zu stoppen. Messen und notieren Sie die optische Dichte bei 405 Nanometern für ONPG oder bei 574 Nanometern für CPRG aller Löcher mit einem Plattenspektrophotometer.

Die Berechnung von LacZ-Werten kann mithilfe einer automatisierten Anwendung durchgeführt werden, für die Java installiert sein muss. Öffnen Sie zunächst die in Anhang eins beschriebene automatisierte LacZ-Anwendung. Fügen Sie die Messwerte der optischen Dichte bei 405 Nanometern für ONPG bzw. bei 574 Nanometern für CPRG aller Vertiefungen ein, wobei ein Plattenlayout verwendet werden muss, das dem in Abbildung eins gezeigten entspricht.

Geben Sie die Inkubationszeit und die Stunden ein, die der Assay zur Farbentwicklung benötigt, und klicken Sie auf Weiter. Fügen Sie die Messwerte der optischen Dichte bei 610 Nanometern für alle Vertiefungen ein. Klicken Sie auf Senden, um die LacZ-Ergebnisse anzuzeigen.

Die LacZ-Ergebnisse können mithilfe von Tastaturbefehlen kopiert und bei Bedarf in eine Tabellenkalkulation oder andere Dateien eingefügt werden. Beginnen Sie diese Analyse, indem Sie die Online-YES-Assay-Datenanalyseanwendung öffnen. Laden Sie eine CSV-Datendatei hoch, die gemäß der Beschreibung auf dem ersten Tabulatorreiter formatiert ist.

Digitalisieren Sie die Estradiol-Standardkurve auf der zweiten Registerkarte und schätzen Sie die Regressionsparameter. Sehen Sie sich die Ergebnisse des Regressionsmodells auf der dritten Registerkarte an und ermitteln Sie dann auf der vierten Registerkarte die interpolierten x-Achsen-Werte, die den LacZ-Werten der Proben entsprechen. Klicken Sie auf die fünfte Registerkarte, um die östrogänenäquivalenten Werte (EEQ) der Proben anzuzeigen.

Schließlich standardisieren Sie die EEQ-Werte entsprechend der ursprünglichen Probenmasse, wie im textbasierten Protokoll beschrieben. Dargestellt sind Beispiele von Standardkurven nach einer 17-stündigen Inkubation von Hefe mit 17-Beta-Estradiol. Aus in der Arbeit diskutierten Gründen ist CPRG oft eine bessere Substratwahl als ONPG.

In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen waren die Assays mit ER-Beta-exprimierenden Hefen um mehr als eine Größenordnung empfindlicher als die Assays mit ER-Alpha-exprimierenden Hefen. Daher wurde eine östrogene Aktivität häufiger in Hefen nachgewiesen, die ER Beta exprimieren. Ein zusätzliches Ziel der Studie bestand darin, Inkubationszeiten zu testen, die mit dem Zeitplan eines Praktikums für Studierende vereinbar sind.

Wenn nach der 17-stündigen Inkubation eine Kühlung für sechs Tage eingeführt wurde, waren die Standardkurven von gekühlten Platten vergleichbar mit denen von nicht gekühlten Platten. Die Standardfehler der Parameter, die mithilfe von vierparametrigen logistischen Regressionsmodellen geschätzt wurden, waren bei gekühlten Platten sämtlich geringer als bei nicht gekühlten Platten. Daher verringert die sechstägige Lagerung der Platten im Kühlschrank den Fehler und verbessert die Genauigkeit der EEQ-Schätzungen.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in zwei bis drei bis vierstündigen Sitzungen abgeschlossen werden. Während des Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, für alle Schritte vor der 17-stündigen Inkubationsphase sterile Technik anzuwenden, sorgfältig und genau zu pipettieren und dem in Abbildung eins dargestellten Plattenlayout zu folgen. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie In-vivo-Tierassays durchgeführt werden, um zusätzliche Mechanismen der östrogenen Wirkung und Effekte auf den gesamten Organismus zu untersuchen.

Nach ihrer Entwicklung hat sich der Hefestest für Östrogene als kostengünstige Methode zur Bestimmung östrogenartiger Liganden in Umweltproben wie Lebensmitteln, Pflanzengeweben und Körperpflegeprodukten etabliert. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie einfache Extraktionen von Körperpflegeprodukten durchgeführt werden, Hefe kultiviert wird, Standardverdünnungskurven vorbereitet werden, der YES-Test in einer 96-Loch-Platte durchgeführt wird und die dazugehörigen Berechnungen abgeschlossen werden. Und vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Estradiol äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und anderer persönlicher Schutzausrüstung sowie die sicherstellung einer ordnungsgemäßen Entsorgung stets beachtet werden sollten, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.