Name: Nachweis Estrogenic Liganden in Körperpflege-Produkte mit einer Hefe Östrogen Bildschirm optimiert für Undergraduate Teaching Labor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 13 s
Description: Lernen Sie den optimierten Hefe-Östrogen-Screen zur Quantifizierung östrogenartiger Liganden in Körperpflegeprodukten. Diese kostengünstige Methode eignet sich ideal für die Lehre in Undergraduate-Laboren.

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Dieses Projekt wurde durch Anschubfinanzierung TME und AMR aus Louisiana Tech University und Furman University bzw. finanziert. Zusätzliche Mittel durch einen 2015 Fakultät Förderung Zuschuss an AMR und TME von The Associated Colleges des Südens, ein Stipendium TME von der National Science Foundation und des Louisiana Board of Regents und ein Reisestipendium zu TME aus Louisiana EPSCoR Pfund zur Verfügung gestellt wurde die University of the South. Wir danken Dr. David Eubanks (Furman) für die Unterstützung bei statistischen Analysen und Mr. Christopher Moore für"uns eine Hand" während der Dreharbeiten.

1. Herstellung Reagenzien
<ol>
	<li>Bereiten Sie Glukose und Galaktose Medien durch das Mischen von 6,7 g Hefe Stickstoff base, 20 g Traubenzucker oder Galaktose, 20 mg Adenin Sulfat (hinzugefügt als 10 mL einer wässrigen Vorratslösung 200 mg/100 mL), 20 mg Uracil (hinzugefügt als 10 mL einer wässrigen Vorratslösung 200 mg/100 mL) , 60 mg Leucin (hinzugefügt als 6 mL einer wässrigen Stammlösung 1 g/100 mL) und 20 mg Histidin (hinzugefügt als 2 mL einer wässrigen Stammlösung 1 g/100 mL) in entionisiertem Wasser zu einem Endvolumen von 1 L. entkeimen durch Filtration (0,2 µm-Filter). Datenträger kann für mehrere Wochen bei 4 ° C aufbewahrt werden.</li>
	<li>Bereiten Sie Estradiol (E2) Standards durch auflösende pulverisierte E2 in wasserfreiem Ethanol und mit den entsprechenden Arbeiten Konzentrationen verdünnt (227,5 nM &#38; 9,75 nM) in 50 % igem Ethanol. Hinweis: Wenn als ein Fläschchen von 1 mg Estradiol gekauft wird, fügen Sie 1 mL Ethanol direkt an das Fläschchen Estradiol Pulver aufzulösen hinzu. Dies ergibt eine 3,67 mM Lager #1.  Verdünnen Sie 10 μL des Vorrates #1 in 990 μl Ethanol zu 1 mL 36.71 μM Lager #2 zu machen.  Verdünnen Sie dann 10 μL des Vorrates #2 in 990 μL 50 % Ethanol zu 1 mL 367.13 nM Lager #3 machen.  Um funktionierende Aktien machen, verdünnen Sie 619.7 μL Lager #3 in 380,3 μL 50 % Ethanol zu 1 mL 227,5 nM arbeiten Lager Standardkurven mit Hefe mit dem Ausdruck ERα erstellt.  Verdünnen Sie 26.56 μL Lager #3 in 973.44 μL 50 % Ethanol zu 1 mL 9,75 nM arbeiten Lager Standardkurven mit Hefe mit dem Ausdruck ERβ erstellt. Dichtung mit Parafilm und bei-20 oder-70 ° C. Achtung: E2 ist ein Verdacht Karzinogen und reproduktive Schlüpfzeit. Es ist gesundheitsschädlich beim Einatmen, verschlucken oder durch die Haut absorbiert. E2 kann zu stillen Kinder und Föten schädigen. E2 ist sehr giftig für Wasserorganismen. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Abzugshaube, Staubmaske) und vermeiden Sie während der Schwangerschaft und Stillzeit. E2 als Sondermüll zu entsorgen und nicht in die Umwelt loslassen.</li>
	<li>Bereiten Sie LacZ Puffer durch Mischen von 8,52 g Na2HPO4, 5,52 g NaH2PO4•H2O, 95,21 mg MgCl2, 745,5 mg KCl, 2 g N-Lauroylsarcosine-Natriumsalz, und entweder ONPG (400 mg) oder CPRG (77,7 mg) in entionisiertem Wasser, um eine endgültige Volumen 1 L. Store LacZ-Puffers in 20 mL Aliquote bei-20 ° C. Hinweis: Eine aliquote 20 mL ist ausreichend für eine 96-Well-Platte.</li>
	<li>Bereiten Sie Natriumkarbonat durch Mischen 105,9 g Natriumcarbonat in entionisiertem Wasser zu einem Endvolumen von 1 L. Store bei RT</li>
	<li>Bereiten Sie 1 M Dithiothreitol (DTT) in Wasser. Einfrieren von 25 µL-Aliquots von DVB-t bei-20 ° C. Achtung: DVB-t ist eine akute Haut- und reizend. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Abzugshaube, Staubmaske), um Haut- und Augenkontakt, Inhalation und Verschlucken zu vermeiden. Hinweis: Jeder Aliquote ist ausreichend für eine 96-Well-Platte.</li>
</ol>
2. Vorbereitung der Proben und Kontrollen der Extraktion
<ol>
	<li>Wählen Sie Proben zu testen. Hinweis: Dieser Artikel stellt Daten für fünfzehn PCPs, wie Seife, Haarcreme, Shampoo, Sonnencreme, Lippenbalsam, Stiftung, Rasierschaum, Nagellack und Lotion.</li>
	<li>1 g der Probe mit 10 mL wasserfreiem Ethanol in einem 15 mL konische Röhrchen zu kombinieren. Bereiten Sie eine negative Extraktionskontrolle, bestehend aus 11 mL Ethanol in einem 15 mL konische Röhrchen. Bereiten Sie Wiederholungen, je nach Bedarf. Hinweis: Für die vorgestellten experimentellen Design, wurden drei Aliquote aller 15 PCP und dreifacher Extraktion Steuerungslösungen vorbereitet nachgeben insgesamt 48 Proben, von der jede in dreifacher Ausfertigung unter Verwendung des Protokolls in Abschnitt 4 analysiert wurde. Eine einzelne Platte bietet Platz für bis zu 23 Proben in Triplicates. Wasserfreiem Ethanol wird in diesem Schritt verwendet, da es leicht verdampft. Verwenden Sie negative Extraktion Steuerelemente, um sicherzustellen, dass Östrogene in Proben aus den konischen Rohren nicht ausgewaschen sind.</li>
	<li>Rohr-Inhalt für 30 min zu homogenisieren, durch eine Kombination von manueller schütteln und aufschütteln oder durch Schütteln Röhren auf einem Multi-Rohr Vortexer.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie konische Rohre bei der maximal zulässigen Geschwindigkeit in einer Zentrifuge Eimer für 10 min. Dekantieren des Überstands von jedes Rohr durch ein Sieb 40 µm Zelle in ein 50 mL konische Röhrchen. Leeren Inhalt jedes 50 mL-Röhrchen in eine Glasflasche funkeln.</li>
	<li>Lassen Sie Fläschchen öffnen in einem gelüfteten Abzug für eine Woche, um Ethanol zu vollständig zu verdampfen lassen. Alternativ trockenen Sie Proben in einem gelüfteten Abzug unter Stickstoff oder mit einem Drehverdampfer. Zur Vermeidung von Abbau von Licht empfindliche Bestandteile schützen Sie trocknen Proben vor Licht (z.B.Ort undurchsichtigen Stoff über belüftete Haube Tür).</li>
	<li>Bereiten Sie Proben in 1,0 mL 50 % Ethanol und Wirbel zu homogenisieren.</li>
</ol>
(3) kultiviert und Subkultivieren Hefe14
<ol>
	<li>Pflegen Sie aktiv Hefekulturen (rekombinante W303a Stamm von S. Cerevisiae14) durch Inkubation Hefe im Filter sterilisiert Glukose Medien bei 30 ° C. Subkultur Hefe wöchentlich frische Filter sterilisiert Glukose Medien.</li>
	<li>Zwei Nächte (ca. 42 h) vor der Vorbereitung der Platten ja Subkultur Hefe durch Zugabe von 0,1 mL aktive Hefekulturen bis 10 mL des Filter-sterilisiert Glukose Medien mit steriler Technik.  Zwei Nächte bei 30 ° C inkubieren.  Schütteln ist nicht erforderlich, wenn Hefe als flache Kulturen in sterilen 250 mL Erlenmeyer Kolben angebaut werden. Hinweis: Hefe kann auch auf gekühlte Agarplatten mehrere Monate aufbewahrt werden. Für längere Lagerung (Jahre), mit 15-50 % steriles Glyzerin, Wirbel und Einfrieren bei-70 ° c O/N Kulturen verbinden Um sterile Glycerin vorzubereiten, mithilfe einer Spritze um 300 µL Glycerin zu einem Cryoröhrchen und Autoklaven mit der Kappe gelockert zu übertragen. Fügen Sie dann 1.200 µL O/N Hefekultur mit steriler Technik.</li>
</ol>
4. Vorbereitung ja Platten (1. Tag des Tests)
<ol>
	<li>In einem sterilen Becher und mit steriler Technik, verdünnen Hefe aus Schritt 3.2 zu einer optischen Dichte von 0,065 ±0.005 bei 610 nm (OD610) in Filter-sterilisiert Galaktose Medien.<ol>
		<li>Optische Dichte durch Pipettieren 120 μL jeder Hefe-Probe in dreifacher Ausfertigung zusammen mit dreifacher Galaktose-Rohlinge in eine klare Polystyrol Platte bestätigen (Platte muss nicht steril sein).  Verwenden Sie eine Platte Spektralphotometer um zu überprüfen, ob die verdünnte Hefekultur hat ein Netto OD610 0,065 ±0.005 subtrahieren OD610 Lesungen von Galaktose Rohlinge aus Hefe OD610 Lesungen Netto OD610 der Hefe zu bestimmen. Jede 96-Well-Platte ein Endvolumen von mindestens 30 mL verdünnt Hefe vorbereiten. Hinweis: Spektralphotometer Filter Messung der Absorption von 595 bis 610 nm können für diese Messung verwendet werden.</li></ol></li></ol>Eine ungefähre 1:6 V: V Verhältnis von Hefe: Medien in der Regel ergibt sich ein OD-610 in der Nähe von 0,065, also zunächst 30 mL Medien 4,5 mL Hefe hinzu und füge mehr Hefe oder Medien als angebracht, ein NetOD610 0.060 bis 0,070 zu erreichen.
	
	
	<li>Fügen Sie diese verdünnte Hefesuspension mithilfe sterilen Technik zum Brunnen von einem sterilen, Polypropylen, 96-Well Mikrotestplatte gemäß der Platte Layout (Abbildung 1). Die Quelle zu halten während pipettieren, Hefe Wanderprediger kontinuierlich wirbeln die Container oder mischen mit der Pipette. Für diesen Schritt ist es hilfreich, eine sich wiederholende Pipette mit einer sterilen Spritze Spitze zu verwenden. Hinweis: Polypropylen-Platten sind durch Autoklavieren zwei gestapelten Platten in Folie verpackt sterilisiert.  Die obere Platte dient als Deckel für Probenteller kann gewaschen, Re-autoklaviert werden und wiederverwendet.</li>
	<li>3 weitere Brunnen (H10 - 12) nach der Platte Layout (Abbildung 1) 120 µL Filter sterilisiert Galaktose Medien hinzufügen. Diese Vertiefungen dienen als Media-Steuerelemente, um Absorption von den Medien allein beigetragen zu berücksichtigen.</li>
	<li>Eine Standardkurve in jeder Platte durch Verdünnung seriell Triplicates E2 Arbeitsstandards zu konstruieren (227,5 nM für ERα, 9,75 nM für ERβ) in Brunnen mit Hefesuspension (A1 - G3) gemäß der Platte Layout (Abbildung 1).  Zunächst durch Zugabe von 5 µL E2 Standards zu Wells A1 bis A3. Mischen Sie Microwell Inhalt durch pipettieren, und dann seriell verdünnen Sie diese Aussetzung durch den Umstieg von 205 µL von Brunnen A1 - 3 in Vertiefungen B1 - 3. Wiederholen Sie die Vermischung und Übertragung von 205 µL durch Zeile G. Hinweis: Nachdem die serielle Verdünnung abgeschlossen ist, verwerfen Sie 205 μL aus Brunnen G1 - 3. Am Ende dieses Schrittes sollte alle standard Wells 120 μL enthalten. Die serielle Verdünnung erbringt die Endkonzentrationen E2 in Tabelle 1aufgeführt. Für die serielle Verdünnung Schritte ist es hilfreich, eine Mehrkanal-Pipette mit sterilen Tipps zu verwenden.</li>
	<li>Fahrzeug-Kontroll-Vertiefungen mit Hefesuspension (H1 - 3) nach der Platte Layout (Abbildung 1) fügen Sie 5 µL des Fahrzeugs (50 % Ethanol hinzu). Hinweis: Fahrzeug-Kontroll-Vertiefungen dienen zum Hintergrund Extinktion Hefezellen und Medien zugeordnet zu quantifizieren. Zudem testen Zytotoxizität oder Wachstum fördern Effekte Test Proben nachgewiesen werden können, durch den Vergleich der OD-610 -Werte der Brunnen mit der Fahrzeug-Kontroll-Vertiefungen.</li>
	<li>Brunnen mit Hefesuspension gemäß der Platte Layout (Abbildung 1) fügen Sie 5 µL Triplicates von Proben und negative Extraktion Steuerelemente hinzu. Hinweis: Notieren Sie sich die Proben oder negative Extraktion Steuerelemente hinzugefügt in jede Vertiefung.  Überblick zu behalten welche Brunnen Proben müssen und welche nicht, beginnen Sie mit einer frischen Box Tipps und Tipps aus den gleichen Positionen im Feld als die Standorte der entsprechenden Vertiefungen in der Platte. Eine 96-Well-Platte bietet Platz für bis zu 23 Proben in dreifacher Ausfertigung.</li>
	<li>Mischen Sie den Inhalt der Probe, Extraktionskontrolle und Fahrzeug-Kontroll-Vertiefungen durch pipettieren. Einstellen Sie Mengen an diesen Brunnen zu 120 µL durch 205 µL voneinander entfernen, wie in der Legende für Abbildung 1beschrieben.</li>
	<li>Versiegeln Sie Chicoréeblätter mit einer sterilen, Klebstoff, poröse Folie. Platten-Label und 17 h bei 30 ° c inkubieren Die Platte muss nicht geschüttelt werden, während der Inkubation</li>

5. Verarbeitung ja Platten (Tag 2 des Tests)
<ol>
	<li>Entfernen Sie nach der 17 h Inkubation bei 30 ° C Platten aus dem Inkubator. Wenn Platten sofort verarbeitet werden, fahren Sie mit Schritt 5.1.1. Wenn Platten zu einem späteren Zeitpunkt verarbeitet werden, fahren Sie mit Schritt 5.1.2.<ol>
		<li>Verwenden Sie, eine Mehrkanal-Pipette, um den Inhalt jeder Zeile der Brunnen zu mischen, und dann übertragen Sie 50 µL Hefesuspension aus jedem Brunnen auf den entsprechenden gut von einer klaren, Polystyrol, 96-Well Mikrotestplatte. Hinweis: Polystyrol-Platten nicht steril sein müssen, sondern sollte einen Deckel haben. Verwenden Sie neue Pipettieren Tipps für jede Zeile von Brunnen, um Kreuz-Kontamination Brunnen zu vermeiden, obwohl wenn über Triplicates mit einem 8-Tip Mehrkanal-Pipette pipettieren, Tipps nur zwischen dreifacher Sätze geändert werden müssen.<ol>
			<li>Beschriften Sie die neue Platte. Fahren Sie mit Schritt 5.2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Um Platten vor der Verarbeitung zu speichern, wickeln Sie sie in Folie eingeschweißt. Kühlen Sie verpackte Platten bei 4 ° C für 6 d. danach die Platten aus dem Kühlschrank nehmen, packen Sie sie und übertragen den Inhalt alle Vertiefungen Pipettieren wie in Schritt 5.1.1. Fahren Sie mit Schritt 5.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>20 mL aufgetaut, Raumtemperatur LacZ Puffer für eine Endkonzentration von 1 mM DTT 20 µL 1 m DTT hinzufügen. Mix LacZ Puffer gut. Wenn eine Multi-Kanal-Pipette verwenden, in ein Reagenz Reservoir zu verzichten. Achtung: Tragen Sie Handschuhe und arbeiten mit DVB-t in eine Haube, wenn möglich</li>
	<li>Mit entweder einer Mehrkanal-Pipette oder Pipette zu wiederholen, fügen Sie 200 µL des LacZ-Puffer mit DVB-t und ONPG oder CPRG in alle Vertiefungen der Polystyrol Platte hinzu und sofort messen Sie und zeichnen Sie der OD-610 von allen Brunnen mit einer Platte Spektralphotometer auf. Wiederholen Sie bei Bedarf für zusätzliche Platten. Hinweis: Die OD-610 -Lesungen sind im Nenner des LacZ-Berechnung (Schritt 6.1) verwendet. Aus diesem Grund erhalten die Messwerte sofort nach dem Pipettieren und vor Zellen absetzen oder durch LacZ Puffer lysiert werden. Wenn OD-610 -Werte für Probe-Brunnen merklich höher oder niedriger als OD-610 -Werte für Fahrzeug-Kontroll-Vertiefungen sind, sind die Probe-Extrakte wachstumsfördernde oder zytotoxische, Hefe, beziehungsweise. LacZ, die Berechnung zu korrigieren wird für kleine Unterschiede in der Zelldichten über Brunnen, aber, wenn Unterschiede 30 % in beide Richtungen übersteigen, dann die rekonstituierte Probe (ab Schritt 2,6) in zusätzliche 50 % Ethanol verdünnen und erneut testen die Probe durch die Rückkehr zu Schritt 3.2 12.</li>
	<li>Platten mit einem Deckel abdecken. Inkubieren Sie Platten, die Hefe, dass ausdrückliche ERα14 bei 30 ° C für 40 min (für ONPG) oder 3 h (für CPRG). Inkubieren Sie Platten, die Hefe, dass ausdrückliche ERβ14 bei 30 ° C für 70 min (für ONPG) bzw. 4 h (für CPRG). Hinweis: Wenn Sie mit CPRG arbeiten, sind Inkubationszeiten flexibel; für 2-4 h Inkubation Ergebnissen geeignet mit beide Rezeptoren mit längeren Inkubationen Assay Empfindlichkeit zu erhöhen.</li>
	<li>Nach Inkubation Platten, mithilfe einer Mehrkanal-Pipette oder wiederholten Pipette 100 µL Natriumcarbonat in jede Vertiefung hinzufügen. Natriumcarbonat erhöht den pH-Wert und die β-Galaktosidase Reaktion anhält.</li>
	<li>Messung und Aufzeichnung der OD405 (für ONPG) oder OD574 (für CPRG) von allen Brunnen mit einer Platte Spektralphotometer.</li>
</ol>
6.LacZ-Werte berechnen
Hinweis: LacZ Werte quantifizieren den Grad der Farbenänderung für jede Probe und bieten eine normalisierte Methode für den Vergleich der Werte unter separaten Assays Buchhaltung für mehrere Variablen (z.B., Hefe optische Dichte Medien optische Dichte und Inkubation Zeit wenn Dies unterscheidet sich unter den Brunnen auf der gleichen Platte)12.
<ol>
	<li>Mittel, dreifacher OD-610 -Werte für Medien (Galaktose) Kontroll-Vertiefungen (H10-12) zu berechnen und Transportmittel dreifacher OD405 oder OD-574 -Werte für Fahrzeug (50 % Ethanol) Steuerelemente (H1-3) zu berechnen. Verwenden Sie diese Mittel und die Inkubationszeit (t) in Stunden für die Platte um zu verfärben (Schritt 5.5) zur Berechnung LacZ-Werte (entsprechend dem Grad der Farbänderung in jede Vertiefung) für alle Standard und Probe Brunnen mit den folgenden Gleichungen: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/55754/55754eq1.jpg"> 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/55754/55754eq2.jpg">
	<ol>
		<li>Alternativ verwenden Sie die automatisierte Anwendung in Anhang 1 LacZ Werte für Standards und Proben zu berechnen. Hinweis: Mit der Anwendung verwendete Platte-Layout muss identisch mit der Platte Layout in Abbildung 1dargestellt. Wenn einige Probe-Brunnen nicht verwendet wurden, behalten Sie Extinktion Lesungen aus den leeren Brunnen als Platzhalter in der Extinktion Dataset wird in Anhang 1 LacZ Anwendung eingefügt.  Dadurch werden die räumliche Anordnung der die Platte in der Anwendung und sorgt dafür, dass Medien-Kontroll-Vertiefungen in ihrem gewünschten Ort.  Darüber hinaus wird die Anwendung nicht ausgeführt, wenn leere Zellen vorhanden sind.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mittel, dreifacher LacZ-Werte für jede E2-Norm und jede Probe zu berechnen. Bericht LacZ-Mittelwerte als µL-1h-1. Log-Transformation die Konzentrationen der einzelnen E2 standard, und erzeugen ein Tabellenkalkulationsdokument formatiert wie in der template.csv-Datei (Anhang 2).</li>
</ol>
7. Beispiel Estradiol-Äquivalente (EEQs) 4-Parameter logistische Regression mit Interpolation
Hinweis: EEQs LacZ Beispielwerte (Farbwechsel) beziehen sich auf die LacZ-Werte der Standardkurve erstellt mit E2. EEQs bestimmen, also wieviel Probe erforderlich, um die gleiche Farbe Änderung Antwort als eine bekannte Konzentration von E2 zu entlocken.
<ol>
	<li>Zum Berechnen der EEQs für Prüflinge zuerst plot der Standardkurve. Passen Sie LacZ-Mittelwerte für E2-Standards (y-Achse) und die entsprechenden Log-transformierten E2 Konzentrationen (x-Achse) auf ein vier-Parameter logistische Regressionsmodell.</li>
	<li>Verwenden Sie das Modell zur EEQs für Test Probe LacZ Werte interpolieren. Führen Sie logistische Regressionsberechnungen von EEQs mit Statistiksoftware wie in Anhang 2dargestellt.</li>
</ol>
8. EEQs (ng/mL), PCP Probe Masse Standardisierung
<ol>
	<li>EEQs beziehen sich auf die Menge der PCP Probe hinzugefügt, um jeweils gut im Schritt 4.5, das Gesamtvolumen in die Probe Vertiefungen (325 µL) plattiert EEQ (ng/mL) multiplizieren und dividieren durch das Volumen des extrahierten Probe hinzugefügt in jede Vertiefung (5 µL). Hinweis: Diese Werte repräsentieren EEQ pro mL der entnommenen Probe. Wenn Proben 1 g von PCP zubereitet wurden, repräsentieren diese Werte auch EEQ pro Gramm von PCP (ng/g). Auf diese Weise ausgedrückt, können EEQ Werte (ng/g) über verschiedene PCPs EEQ (ng/g) Werte verglichen werden für die Körperpflege-Produkten getestet in dieser Studie sind in Tabelle 2gezeigt, und Sample-Daten gesammelt, während das gesamte Protokoll sind im enthalten Anhang 3.</li>
</ol>

<ol><li>Agradi, E., Vegeto, E., Sozzi, A., Fico, G., Regondi, S., Tome, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+healthy+Mediterranean+diet%3A+estrogenic+activity+of+plants+used+as+food+and+flavoring+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Phytother+Res%22%5BJournal%5D)">Traditional healthy Mediterranean diet: estrogenic activity of plants used as food and flavoring agents.</a> Phytother Res. 20 (8), 670-675 (2006).</li>
<li>Morgan, H. E., Dillaway, D., Edwards, T. M. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/full/10.4161/endo.28490">Estrogenicity of soybeans (Glycine max) varies by plant organ and developmental stage.</a> Endocr Disruptors. 2 (1), (2014).</li>
<li>Myers, S. L., Yang, C. Z., Bittner, G. D., Witt, K. L., Tice, R. R., Baird, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+and+anti-estrogenic+activity+of+off-the-shelf+hair+and+skin+care+products%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp.+Sci+Environ+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Estrogenic and anti-estrogenic activity of off-the-shelf hair and skin care products.</a> J Exp. Sci Environ Epidemiol. 25 (3), 271-277 (2015).</li>
<li>Wagner, M., Oehlmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+disruptors+in+bottled+mineral+water%3A+estrogenic+activity+in+the+E-Screen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Steroid+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocrine disruptors in bottled mineral water: estrogenic activity in the E-Screen.</a> J Steroid Biochem Mol Biol. 127 (1-2), 128-135 (2011).</li>
<li>Arnold, S. F., Robinson, M. K., Notides, A. C., Guillette, L. J. Jr, McLachlan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+estrogen+screen+for+examining+the+relative+exposure+of+cells+to+natural+and+xenoestrogens%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">A yeast estrogen screen for examining the relative exposure of cells to natural and xenoestrogens.</a> Environ Health Perspect. 104 (5), 544-548 (1996).</li>
<li>Odum, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rodent+uterotrophic+assay%3A+critical+protocol+features%2C+studies+with+nonyl+phenols%2C+and+comparison+with+a+yeast+estrogenicity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The rodent uterotrophic assay: critical protocol features, studies with nonyl phenols, and comparison with a yeast estrogenicity assay.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 25 (2), 176-188 (1997).</li>
<li>Mellanen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wood-derived+estrogens%3A+studies+in+vitro+with+breast+cancer+cell+lines+and+in+vivo+in+trout%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Wood-derived estrogens: studies in vitro with breast cancer cell lines and in vivo in trout.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 136 (2), 381-388 (1996).</li>
<li>Bergman, A., Heindel, J. J., Jobling, S., Kidd, K. A., Zoeller, R. T. State of the science of endocrine disrupting chemicals – 2012. Inter-Organisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC). , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/ceh/publications/endocrine/en/">http://www.who.int/ceh/publications/endocrine/en/</a> (2013).</li>
<li>Balsiger, H. A., de la Torre, R., Lee, W. Y., Cox, M. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20074779">A four-hour yeast bioassay for the direct measure of estrogenic activity in wastewater without sample extraction, concentration, or sterilization.</a> Sci Total Environ. 408 (6), 1422-1429 (2010).</li>
<li>Coldham, N. G., Dave, M., Sivapathasundaram, S., McDonnell, D. P., Connor, C., Sauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+recombinant+yeast+cell+estrogen+screening+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a recombinant yeast cell estrogen screening assay.</a> Environ Health Perspect. 105 (7), 734-742 (1997).</li>
<li>De Boever, P., Demaré, W., Vanderperren, E., Cooreman, K., Bossier, P., Verstraete, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+yeast+estrogen+screen+and+its+applicability+to+study+the+release+of+estrogenic+isoflavones+from+a+soygerm+powder%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Optimization of a yeast estrogen screen and its applicability to study the release of estrogenic isoflavones from a soygerm powder.</a> Environ Health Perspect. 109 (7), 691-697 (2001).</li>
<li>Fox, J. E., Burow, M. E., McLachlan, J. A., Miller, C. A. 3d <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+ligands+and+dissecting+nuclear+receptor-signaling+pathways+using+recombinant+strains+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detecting ligands and dissecting nuclear receptor-signaling pathways using recombinant strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat Protoc. 3 (3), 637-645 (2008).</li>
<li>Routledge, E. J., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/etc.5620150303/full">Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen.</a> Environ Toxicol Chem. 15 (3), 241-248 (1996).</li>
<li>Miller, C. A. 3d, Tan, X., Wilson, M., Bhattacharyya, S., Ludwig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+plasmids+expressing+human+steroid+hormone+receptors+and+a+reporter+gene+for+use+in+yeast+signaling+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Single plasmids expressing human steroid hormone receptors and a reporter gene for use in yeast signaling assays.</a> Plasmid. 63 (2), 73-78 (2010).</li>
<li>Delfosse, V., Grimaldi, M., Cavaillès, V., Balaguer, P., Bourguet, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+profiling+of+environmental+ligands+for+estrogen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Structural and functional profiling of environmental ligands for estrogen receptors.</a> Environ Health Perspect. 122 (12), 1306-1313 (2014).</li>
<li>Environmental Working Group. Skin Deep Cosmetics Database. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ewg.org/skindeep">http://www.ewg.org/skindeep</a> (2016).</li>
<li>Eustice, D. C., Feldman, P. A., Colberg-Poley, A. M., Buckery, R. M., Neubauer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+the+detection+of+beta-galactosidase+in+transfected+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for the detection of beta-galactosidase in transfected mammalian cells.</a> Biotechniques. 11 (6), (1991).</li>
<li>Buller, C., Zang, X. P., Howard, E. W., Pento, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+beta-galactosidase+tissue+levels+in+a+tumor+cell+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Find+Exp+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Measurement of beta-galactosidase tissue levels in a tumor cell xenograft model.</a> Methods Find Exp Clin Pharmacol. 25 (9), 713-716 (2003).</li>
<li>Pelisek, J., Armeanu, S., Nikol, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+beta-galactosidase+activity+in+tissue+in+the+presence+of+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of beta-galactosidase activity in tissue in the presence of blood.</a> J Vasc Res. 37 (6), 585-593 (2000).</li>
<li>Gray, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+alcohol+tolerance+of+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Studies on the alcohol tolerance of yeasts.</a> J Bacteriol. 42 (5), 561-574 (1941).</li>
<li>Schug, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+endocrine+disruption+out+of+the+next+generation+of+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Green+Chem%22%5BJournal%5D)">Designing endocrine disruption out of the next generation of chemicals.</a> Green Chem. 15 (1), 181-198 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das ja ist eine kostengünstige Methode um Östrogene Liganden in Umweltproben, wie Wasser, Nahrung, Pflanzengewebe oder Körperpflege-Produkte zu erkennen. Daten hier vorgestellten vergleichen 2 Östrogen-Rezeptoren (ERα und ERβ), 2 Substrate (ONPG und CPRG) und 2 Fristen (2 d Protokoll ohne Kühlung) und sieben-Tage-Protokoll mit Kühlung für die Messung von Östrogenität in Körperpflegeprodukten über ja-Assay. Die 7D, gekühlte Protokoll mit CPRG und Hefe mit dem Ausdruck ERα und ERβ am besten quantifiziert EEQs, während auch kompatibel mit dem Zeitdruck durch Bachelor Laborkursen aufgezwungen, die nur einmal erfüllen / Woche für mehrere Stunden. In der Tat war im Vergleich zu den 2 d-Assay ohne Kühlung, die siebentägige gekühlte Assay verbunden mit geringeren Varianz über Platte repliziert. Darüber hinaus wurde der lineare Teil der Standardkurve für Daten, die mit der gekühlten Test leicht erweitert. Die lineare Teil der Standardkurve Assay Erfassungsbereich definiert und ist der einzige Teil der Standardkurve, die verwendet werden kann, zum Beispiel EEQs zu interpolieren.
Alles in allem aber eines der getesteten Proben waren EEQs CPRG anhand niedriger als die mit ONPG quantifiziert. Mit einem höheren Aussterben Koeffizienten und untere Km und Vmaxist CPRG zehnmal empfindlicher als ONPG17. So CPRG bei niedrigeren Konzentrationen eingesetzt werden und kann verwendet werden, um geringere Mengen an β-Galaktosidase zu erkennen. Aus diesen Gründen ist ONPG18,19CPRG in der Regel vorzuziehen. Mehr Substrat Sensibilität erklärt jedoch nicht die niedrigeren EEQ-Werten mit CPRG erkannt. Die höheren EEQ Werte erkannt mit ONPG könnte aufgrund einer Störung der Matrix mit dem Assay, wie bereits von anderen Autoren2,18. Gelbe Pigmente aus Körperpflege Produkt Extrakte konnte EEQ Werte erkannt mit ONPG aufzublasen. Andere haben dieses Problem umgangen, indem einschließlich der Pigment-Kontrollen in ihrer experimentellen Design2, ein Ansatz, der die Anzahl der Platten in einem Experiment verdoppelt. Wenn Matrix Störungen problematisch sein kann, möglicherweise CPRG vorzuziehen Substrat für die ja-Assay, obwohl es teurer und längere Inkubationszeiten als ONPG erfordert. Darüber hinaus ist der Farbwechsel, induziert durch die Spaltung des Substrats durch β-Galaktosidase dramatischer mit CPRG, machen es einfacher für Studenten, Ergebnisse zu visualisieren.
Miller Et al. (2010), wer entwickelt, die in diesem Protokoll verwendeten Hefe, zur Kenntnis genommen, dass Hefe mit dem Ausdruck ERβ 30 X empfindlicher auf 17β-Estradiol als Hefe ERα, untermauert durch unsere Daten14Feststellung zum Ausdruck zu bringen waren. Abgesehen von möglichen Nuancen im Plasmid Bau, Miller Et al. (2010) konnte nicht erklären, dass dieser Unterschied in der Empfindlichkeit14. Ein Unterschied zwischen den beiden Plasmid-Konstrukte ist, dass Galaktose, ERα Ausdruck geregelt ist, ERβ Ausdruck von Glukose oder Galaktose geregelt ist. Die Hefe in den ja-Assay verwendet werden in Glukose Medien kultiviert und Galaktose nur gegeben, wenn sie zu Beginn des Tests verdünnt werden. Hefe mit dem Ausdruck ERβ könnte daher höhere Heftnummern der Rezeptor-Proteine vor Beginn des Tests, dadurch höhere Empfindlichkeit gegenüber Östrogenen Liganden konferieren ansammeln.
Die geringere Empfindlichkeit des ERα exprimierenden Hefe mag erklären, die höheren Preise der nicht-Erkennung von Östrogenität in Proben mit ERα im Vergleich zu ERβ. Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen wird, die Probe EEQs erkannt, Benutzer beschäftigen verschiedene Extraktionslösungsmittel und Methoden oder die Hefe höhere Volumen der Probe hinzufügen könnte. Wenn höhere Probenvolumina verwendet werden, sollte die Konzentrationen von E2-Standards angepasst werden, so dass die gleiche Menge an Standards und Proben im Test verwendet werden kann. Eine Einschränkung der Zugabe mehr Probe ist, dass Hefe nur 6-10 % Ethanol, mit besseren Verträglichkeit bei Inkubation Temperaturen von 30 Vs. 35 ° C20tolerieren kann. Um Effekte von Ethanol auf Hefe zu steuern, sollte Ermittler die Platte Layout dreifacher "Hefe nur" Quellen hinzufügen und bestätigen, dass der OD-610 "Hefe nur" Brunnen vergleichbar mit der OD-610 von Fahrzeug-Kontroll-Vertiefungen sofort nach der Zugabe des LacZ-Puffers. Alternativ können Proben in Ethanol gelöst hinzugefügt werden, zu den trockenen Microwell-Platten und das Ethanol verdampft ausschalten bevor Hefe hinzugefügt. Dimethylsulfoxide (DMSO) dient auch als Probe Lösungsmittel in ja Tests, aber die Endkonzentration Arbeiten von DMSO mit Hefe auf 1 %12beschränkt werden sollte.
Die ja-Assay ist ein leistungsfähiges Screening-Instrument zur Erfassung von Östrogenität in Umweltproben. Insbesondere erkennt das ja Liganden, die nukleare Östrogen-Rezeptoren binden, die mit Östrogen-Response-Elemente gen Ausdruck14direkt interagieren. Allerdings hat das ja auch wichtige Einschränkungen. Das ja erkennt keine EBS, die Arbeiten durch nicht-nuklearen Mechanismen wie Membran Östrogen-Rezeptoren oder Mechanismen, bei denen zusätzliche Elemente wie Transkriptionsfaktoren Activator Protein 1 (AP-1). Darüber hinaus da Hefe haben nicht die gleichen metabolische Kapazität als Säugerzellen, kann das ja Liganden nicht erkennen, die Stoffwechselaktivierung Östrogene zu erfordern.
Darüber hinaus kann nicht der Test ja Östrogene und Anti-Östrogene Liganden in komplexen Proben leicht unterscheiden. Stattdessen misst es net Östrogenität, die Summe der Östrogene und Anti-Östrogene Liganden bewirkt. Um die Konzentration von ER-Antagonisten zu quantifizieren oder bewerten der inhibitorischen Aktivität von Mischungen, kann der Test durch Inkubation Hefe mit der standard-Agonist (17β-Estradiol) und eine Reihe von Test Probe Konzentrationen12geändert werden. Dieser Prozess stellt fest, ob Antagonisten in den Proben Reporter Agonist-induzierte Aktivität vermindern können und bietet eine nützliche-Bildschirm für das Vorhandensein von ER-Antagonisten in Proben zu identifizieren.
Die hier vorgestellten Protokoll kann eine Vielzahl von Probenarten, unterbringen, obwohl einige Proben Änderungen an die Extraktion und Probe Vorbereitungsschritte erfordern. Beispielsweise EEQs sehr unterschiedlich zu der einige Körperpflegeprodukte repliziert. Variablen Proben tendenziell Öltröpfchen enthalten oder anderweitig nicht völlig homogen ist, darauf hinweist, dass mehr lipophilen Lösungsmittel wie Diethylether hilfreich wäre. Alternativ könnten Ölen und Wachs in Körperpflege-Produkten ausgeschlossen werden, durch die Gewinnung von Proben mit 50 % Ethanol anstelle von 100 % igem Ethanol.Eine 50 %-Ethanol-Extraktion wird auch mehr Wasser lösliche Östrogene Liganden (z.B. einige Pigmente) erfassen. Allerdings 50 % Ethanol langsamer als 100 % Ethanol verdampft und somit Extraktionszeit verlängern kann. Darüber hinaus wurden einige Proben (z. B. Seifen) zytotoxische, Hefe, was zu reduzierten Zelle Dichtemessungen (OD610). Fox Et al. (2008) deuten darauf hin, dass solche Proben sollten verdünnt und erneut getestet, wenn Zelle Dichteunterschiede mehr 30 als % im Vergleich zum Fahrzeug Kontrolle Brunnen12.
Wenn ja-Assay für analytische Zwecke verwendet wird, können Kurven Verdünnung der Probe Pools getestet werden soll präventiv entsprechende Mengen an Extrakt, Hefe im Schritt 4.5 hinzugefügt werden soll. Alternativ können Auszüge gleichzeitig auf mehrere Volumes (z.B., 5 µL und 20 µL Extrakt, Hefe im Schritt 4.5 hinzugefügt) getestet oder Verdünnungen, die Größenordnungen (z.B., 0,2 µL 2 µL und 20 µL) umfassen. "Angemessen" Bände des Extraktes sind diejenigen, die Östrogenität zu identifizieren, indem passende LacZ Werte entlang den linearen Teil der Standardkurve. Optimierung wird verhindert, dass Probleme, die durch Zugabe von zu viel oder zu wenig Probe auf der Hefe, wie Zytotoxizität, falsche negative oder Östrogenität, die die Standardkurve überschreitet. Wie oben erwähnt, sollte die Volumen der Proben und E2 Standards angepasst werden, wenn unterschiedliche Mengen an Liganden verwendet werden, so dass Hefe ausgesetzt sind eine einheitliche Lautstärke und Konzentration von Ethanol oder ein anderes Fahrzeug auf den Teller legen.
Trotz des Potenzials für falsche negative wurde ja Assay als einem Tier 3-Test-Tool für endokrine Disruptoren durch Schug Et Al. identifiziert (2013), entwickelt, die eine umfassende Tiered Protokoll für endokrine Störungen (TiPED)21. Für undergraduate-Ausbildung ist der Test für Unterrichtskonzepte im Zusammenhang mit endokrinen Störungen, Zellkultur, Rezeptorbindung, Enzymaktivität, Gentechnik, Statistik und Versuchsplanung. Studierende, die den Test verwenden üben auch grundlegende und breit anwendbar Labor wie seriell verdünnen Normen; Gewinnung von Proben; Herstellung von Lösungen; Bau und Interpolation Standardkurven; Berechnung der Konzentrationen; Herstellung von Lösungen; sterilen Technik demonstrieren; Kultivierung von Zellen; Ermittlung von Variablen und Kontrollen; sammeln, organisieren und analysieren von Daten; Aufbau und Interpretation der Graphen; und mit gemeinsamen Laborgeräte wie Mikroliterpipetten und Spektralphotometer.

Die Hefe Östrogen Bildschirm (ja) ist weit verbreitet, Liganden zu quantifizieren, die Estradiol (E2 oder 17β-Estradiol) in einer Vielzahl von Matrizen, einschließlich Wasser, Pflanzengewebe, Konsumgüter und Lebensmittel1,2,3zu imitieren, 4. Gemeinsam werden solche Liganden bezeichnet "Environmental Östrogene (EBS)." Die ja ursprünglich als eine niedrige Kosten, in-vitro- Alternative zu in-Vivo -Tests wie die Nager Uterotropher assay5,6 und die Regenbogenforelle Fütterung Assay7entwickelt. Das Ziel dieser Tests ist es, festzustellen, ob ein Produkt enthält Chemikalien, die stimulieren oder blockieren Östrogen-abhängigen Mechanismen. Erkennung von EBS ist kritisch, weil sie die normale körpereigene Östrogen Signaltechnik, besonders während der fetalen Entwicklung beeinträchtigen können. Diese Störung beeinträchtigt Gesundheit erhöht Risiko für Fettleibigkeit, Unfruchtbarkeit, Krebs und kognitive Verlust8.
Trotz der Bedeutung der EBS und andere endokrine Disruptoren für die öffentliche Gesundheit endokrine Störung nicht allgemein Bachelor Curricula gehört. Dieser Mangel ist zum Teil auf einen Mangel an Aktivitäten, die die Grundsätze zu veranschaulichen beteiligt, aber auch für Studenten zugänglich. Darüber hinaus mehrere Varianten des Protokolls ja gibt es9,10,11,12,13, und diese Vielfalt macht Assay Optimierung für zeitaufwendig Labor-Koordinatoren nicht speziell in den relevanten Techniken geschult. Schließlich sind ja Assays in der Regel über 1 langen Tag oder 2 aufeinander folgenden Tagen mit einer O/N Inkubation abgeschlossen. Dieses Timing ist nicht kompatibel mit dem Format der Bachelor Laborübungen, entsprechen in der Regel einmal / Woche für mehrere Stunden.
In Reaktion auf diese Bedürfnisse berichtet dieses Manuskript eine optimierte 96-Well-ja-Protokoll, die ethanolische Extraktionsmethoden für Körperpflegeprodukte (PCP)3 und eine 6-Tage-Kältetechnik Schritt, wöchentliche Labor treffen unterzubringen umfasst. Absoluter Ethanol ist eine vielseitige organischen Lösungsmittel, das eine Vielzahl von polaren und unpolaren solute auflösen kann. Darüber hinaus ist es geeignet für grundständige Studiengänge, weil es leicht verfügbar, relativ ungiftig, erschwinglich und mit Wasser mischbar ist; Es verdunstet auch leicht ohne spezielle Ausrüstung. Allerdings Ethanol eignet sich nicht für das Extrahieren von stark hydrophobe endokrine Disruptoren oder viele Öle und Wachse, die beiden letzteren werden häufige Zutaten in PCPs. schlechte Extraktionseffizienz erhöht das Risiko von falsch negativen Befund. Mit dieser Einschränkung im Auge sollte Ermittler wählen Sie Extraktionsverfahren (z.B., ethanolische Extraktion oder Festphasenextraktion), dass Adresse Probe Merkmale und Ziele der Studie (Forschung versus Bachelor Anleitung).
Das ja setzt auf rekombinante Saccharomyces Cerevisiae ursprünglich von Dr. Charles Miller an der Tulane University. Bitte siehe Miller Et al. (2010) für eine komplette Karte von veränderter Plasmid-14. Hefe verwandelt sich diese Plasmide konstitutiv Ausdruck menschlichen nukleare ERα und ERβ (auch genannt ESR1 und ESR2, beziehungsweise) Wenn Sie in Medien, die Galaktose (für ERα) oder Glukose oder Galaktose (für ERβ) angebaut. Wenn Östrogene Chemikalien in den Medien präsent sind, binden sie an die Rezeptoren, Erstellen von Ligand-Rezeptor-komplexe, die β-Galaktosidase (LacZ) Ausdruck auf eine Ebene proportional zur Konzentration von Östrogenen Chemikalien zu aktivieren. Hefezellen sind dann lysiert, um die angesammelten β-Galaktosidase zu lösen. Der Lyse Puffer enthält entweder ONPG oder CPRG, die durch β-Galaktosidase zu gelben oder roten Produkten, bzw. gespalten werden. Farbmetrische Produkte können durch Messung der Extinktion mit einer Microwell Platte Spektralphotometer quantifiziert werden. Der Grad der Farbwechsel ist proportional zur Konzentration der Östrogene Liganden, die die Hefe ausgesetzt war.
Die Wahl des Substrats (CPRG oder ONPG) hängt das Potenzial für Hintergrund-Absorption aus den Proben. Z. B. Pflanzenextrakte werden oft hinzufügen einen gelben Farbton auf die Medien, die künstlich Östrogenität Maßnahmen wenn bläst ONPG (quantifiziert bei 405 nm) dient als Substrat für β-Galaktosidase. Mit Pflanzenextrakte, CPRG (quantifiziert auf 574 nm) möglicherweise eine geeignetere farbmetrischen Substrat. CPRG ist teurer als ONPG sondern dient bei einem Zehntel der Molarity. Dieser Artikel stellt Estrogenicities von PCP Extrakte quantifiziert mit ONPG und CPRG.
Quantifizierung der Östrogenität von Umweltproben mit ERα und ERβ ist ein umfassender Ansatz als mit nur einer dieser Rezeptoren. Bei Tieren weisen diese Rezeptoren differential Gewebeverteilung, Regulierungstätigkeiten und verbindliche Affinitäten für Östrogene und Anti-Östrogene Liganden15. Zum Beispiel binden pflanzliche Phytoöstrogene in der Regel ERβ mehr stark2, während synthetische Chemikalien Vorliebe für ERα und ERβ zeigen können oder beide Rezeptoren gleichermaßen gut15binden können. Daher Vorhersagen Bindung an einem Östrogen-Rezeptor nicht notwendigerweise, Bindung an das andere.
Obwohl die EBS in viele Consumer-Produkte (z.B., Pestizide, Waschmittel, Klebstoffe, Schmierstoffe, Kunststoffe, Nahrungsmittel und Pharma) sowie Pflanzen zu finden sind, stammen die dargestellten Daten mit einer Auswahl an PCP. PCPs sind überzeugend, leicht zur Verfügung, Budget-freundlichen und umweltrelevanten für Studierende. Studenten können eingeladen werden, bringen Sie ihre Lieblings PCPs von zu Hause, im Labor zu testen. Sie können auch suchen die Skin Deep Datenbank zu generieren Hypothese-driven Vergleiche von PCP mit hoher und geringer Toxizität Partituren von der Environmental Working Group16 entwickelt. Auf diese Weise können Schüler gleichzeitig erweiterte Labor Fähigkeiten entwickeln; Tätigung von selbstgesteuertes, Anfrage-basierten Lernens; und entdecken Sie neue Fragen in Umweltwissenschaften und Gesundheit.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer (für einzelne oder mehrere Röhrchen)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>02-215-365</td><td>Jeder Mischer reicht aus.</td></tr><tr><td>Schaufelzentrifuge</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>75-063-839</td><td>Jede Schaufelzentrifuge ist ausreichend, wenn sie in der Lage ist, konische Röhrchen bei 4000 U/min zu zentrifugieren.</td></tr><tr><td>Bunsenbrenner</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>17-012-823</td><td>Jeder Bunsenbrenner reicht aus, oder es kann ein Alkoholbrenner (Fisher Scientific 04-245-1) verwendet werden.</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>50125590H</td><td>Jeder Inkubator ist ausreichend, wenn er in der Lage ist, 30 °C zu halten.</td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader</td><td>BioTek (www.biotek.com)</td><td>EPOCH2</td><td>Ein Platten-Reader einer anderen Marke reicht aus, wenn er die Absorption bei Wellenlängen von 405, 574 und 610 nm messen kann.</td></tr><tr><td>Software für Mikroplatten-Reader und Imager der 5. Generation</td><td>BioTek (www.biotek.com)</td><td>GEN5</td><td>Die erforderliche Software hängt von der Marke und dem Modell des Plattenlesegeräts ab. Die GEN5-Software ist für die Verwendung mit dem BioTek-Plattenleser vorgesehen.</td></tr><tr><td>Kühlschrank</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>05LREEFSA</td><td>Jeder Kühlschrank ist ausreichend, wenn er in der Lage ist, 4 °C zu halten.</td></tr><tr><td>Pipette oder PipetAid kompatibel mit 1 - 10 mL serologischen Pipetten</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>13-681-15E</td><td>Alle Pipettierer sind ausreichend, wenn sie mit 1 & 10 mL serologischen Pipetten kompatibel sind.</td></tr><tr><td>P10 Mikropipette</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>F144562G</td><td>Jede Mikropipette reicht aus, wenn sie in der Lage ist, 5 μl zu dispensieren.</td></tr><tr><td>P200 Mikropipette</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>F144565G</td><td>Jede Mikropipette reicht aus, wenn sie in der Lage ist, bis zu 200 μl zu dispensieren.</td></tr><tr><td>P300 Mehrkanalpipette</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>FBE1200300</td><td>Jedes Mehrkanalpipettengerät reicht aus, wenn es in der Lage ist, 50 - 205 μl zu dispensieren.</td></tr><tr><td>Repetierpipette</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>F164001G</td><td>Muss in der Lage sein, 100 - 320 & Mikro zu liefern. l; Diese Pipette ist optional, da stattdessen eine Mehrkanalpipette verwendet werden kann.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile 15 mL konische Röhrchen mit Verschlüssen</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>05-539-801</td><td></td></tr><tr><td>Szintillationsfläschchen aus Glas</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>03-337-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatten aus Polystyrol 96 Wells mit flachem Boden und Deckel (unsteril)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatten aus Polypropylen 96 mit flachem Boden und ohne Deckel</td><td>Cole-Parmer (www.coleparmer.com)</td><td>EW-01728-81</td><td></td></tr><tr><td>100 mL Glasbecher</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>02-539H</td><td>Alle Glasbecher sind ausreichend, wenn sie autoklavierbar sind.</td></tr><tr><td>250 mL Erlenmeyerkolben aus Glas</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>FB500250</td><td>Erlenmeyerkolben aus Glas sind ausreichend, wenn sie autoklavierbar sind.</td></tr><tr><td>Steriler, klebender, poröser Film&nbsp;</td><td>VWR (www.vwr.com)</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>Metallzange</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>12-000-157</td><td>Jede Metallzange reicht aus.</td></tr><tr><td>Reagenzreservoir</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>07-200-127</td><td></td></tr><tr><td>Filtrationseinheiten (0,2 & Mikro; m)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>09-761-52</td><td></td></tr><tr><td>Spritzflasche (für Ethanol)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>02-897-10</td><td>Alle Laborspritzflaschen reichen aus.</td></tr><tr><td>Autoklavierbare Vorratsflaschen</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>06-414-1D</td><td>Alle autoklavierbaren Vorratsflaschen aus Glas sind ausreichend.</td></tr><tr><td>Serologische Glaspipetten mit 10 ml (steril)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>13-678-27F</td><td>Serologische Glaspipetten sind ausreichend.</td></tr><tr><td>Serologische Glaspipetten für 1 ml (steril)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>13-678-27C</td><td>Serologische Glaspipetten sind ausreichend.</td></tr><tr><td>P10 Mikropipettenspitzen</td><td>USA Scientific (www.usascientific.com)</td><td>1120-3810</td><td>Alle Spitzen sind ausreichend, wenn sie mit der oben genannten Mikropipette kompatibel sind.</td></tr><tr><td>P200 Mikropipettenspitzen</td><td>USA Scientific (www.usascientific.com)</td><td>1120-8810</td><td>Alle Spitzen sind ausreichend, wenn sie mit der oben genannten Mikropipette kompatibel sind.</td></tr><tr><td>P300 Mikropipettenspitzen</td><td>USA Scientific (www.usascientific.com)</td><td>1120-9810</td><td>Alle Spitzen sind ausreichend, wenn sie mit der oben genannten Mikropipette kompatibel sind.</td></tr><tr><td>Spritzenspitzen für Repetierpipetten</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>F164150G</td><td>Nur erforderlich, wenn eine Repetierpipette verwendet wird.</td></tr><tr><td>Sterile Petrischalen</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>FB0875712</td><td>Sterile Petrischalen sind ausreichend.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>S37440<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td><>Kommentare</td></tr><tr><td>Hefe&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae Stämme, denen das TRP1-Genprodukt fehlt (z.B. , W303a)</td><td>American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org)</td><td>MYA-151</td><td>Rekombinante Hefe sind auf Anfrage bei den Autoren ebenfalls erhältlich.</td></tr><tr><td>Rezeptor/Reporter-Plasmid für ER&alpha;</td><td>Addgen (www.addgene.org)</td><td>pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rezeptor/Reporter-Plasmid für ER&beta;</td><td>Addgen (www.addgene.org)</td><td>pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td><>Unternehmen</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td><>ChemicalsDifco</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>agar</td><td>BD (www.bd.com)</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>D0632</td><td>VORSICHT:&nbsp; Dithiothreitol ist ein akuter Haut- und Augenreizstoff. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Abzug, Staubmaske), um Haut- und Augenkontakt, Einatmen und Verschlucken zu vermeiden.</td></tr><tr><td>Ortho-Nitrophenyl-&beta;-D-Galactopyranosid</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>N1127</td><td></td></tr><tr><td>Chlorphenolrot-&beta;-D-Galactopyranosid</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>10884308001</td><td></td></tr><tr><td>Hefestickstoffbase</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>Y0626</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Galaktose</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>G5388</td><td></td></tr><tr><td>Adeninsulfat</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>A9126</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Leucin</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>Histidin</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>17 &beta;-Östradiol& nbsp;</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; MP Biomedizin&nbsp;</td><td>E8875-250 mg&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 0219456401 - 1 mg</td><td>VORSICHT:&nbsp; Östradiol steht im Verdacht, krebserregend und reproduktionstoxisch zu sein. Es ist schädlich, wenn es eingeatmet, verschluckt oder über die Haut aufgenommen wird. Östradiol kann gestillte Kinder und Föten schädigen. Östradiol ist sehr giftig für Wasserlebewesen. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzvorrichtungen (Handschuhe, Abzug, Staubmaske) und vermeiden Sie eine Exposition während der Schwangerschaft und Stillzeit. Östradiol sollte als Sondermüll entsorgt und nicht in die Umwelt abgegeben werden.</td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com)</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Monobasisches Natriumphosphat-Monohydrat</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch (wasserfrei)</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Sarkosyl (N-Lauroylsarcosin-Natriumsalz)</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>L5125</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcarbonat</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>S7795</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</strong</td><td><>strong>Comments </td></tr><tr><td>SoftwareExcel-Tabellenkalkulationssoftware</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Microsoft&nbsp;</td><td></td><td>Excel ist eine praktische Tabellenkalkulationssoftware zum Verwalten von Datenausgaben und zum Generieren von .csv Dateien für die R-Analyse.</td></tr><tr><td>Java-Software (erforderlich für die Anwendung nach Anhang 1)&nbsp;</td><td>Oracle Corporation</td><td></td><td>Um LacZ-Werte mit der Anwendung in Anhang 1 zu berechnen, laden Sie zuerst die kostenlose Java-Software (https://www.java.com/en/download/) herunter und öffnen Sie dann die LacZ-Anwendung in Anhang 1. Die von der Anwendung erstellten LacZ-Ergebnisse können kopiert werden, indem Sie "Strg (Strg) + c" auf PC-Tastaturen oder "Befehl + c" auf Mac-Tastaturen drücken.</td></tr><tr><td>JMP Statistical Software Version 13.0.0</td><td>SAS</td><td></td><td>Institute Anhang 2 enthält Anweisungen zur Verwendung von JMP zur Anpassung von LacZ-Daten an eine logistische Regressionskurve mit vier Parametern. Die Kurve wird verwendet, um die Östradioläquivalente (EEQs) der Prüfproben relativ zur Östradiol-Standardkurve zu interpolieren.</td></tr><tr><td>R Statistical Computing and Grafik Software</td><td>R Foundation</td><td></td><td>Kostenlose R Software kann von https://www.r-project.org/.&nbsp heruntergeladen werden; Anweisungen und Code für die Verwendung von R zur Anpassung von LacZ-Daten an eine logistische Regressionskurve mit vier Parametern sind in Anhang 2 enthalten.</td></tr></tbody></table>

nachweis estrogenic liganden in körperpflege-produkte mit einer hefe Östrogen bildschirm optimiert für undergraduate teaching labor

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

Die Hefe Östrogen Bildschirm (ja) wird verwendet, um Östrogene Liganden in Umweltproben zu erkennen und im großen und ganzen in Studien von endokrinen Störungen angewendet wurde. Östrogene Liganden sind natürliche und künstliche "Environmental Östrogene" (EBS) in vielen Konsumgütern wie Körperpflegeprodukte (PCP), Kunststoffe, Pestizide und Lebensmitteln gefunden. EBS stören Hormon Signalisierung bei Menschen und anderen Tieren, potenziell Fruchtbarkeit reduzieren und erhöhen Erkrankungsrisiko. Trotz der Bedeutung der EBS und andere endokrine Störung Chemikalien (EDZ) für die öffentliche Gesundheit endokrine Störung nicht in der Regel Bachelor Curricula gehört. Dieses Manko ist teilweise ein Mangel an entsprechenden Labor-Aktivitäten, die die Grundsätze zu veranschaulichen beteiligt, aber auch für Studenten zugänglich. Dieser Artikel stellt eine optimierte ja zur Quantifizierung der Liganden in Körperpflegeprodukten, die Östrogen-Rezeptoren Alpha (ERα) und/oder Beta (ERβ) binden. Die Methode beinhaltet eines der beiden farbmetrischen Substrate (ortho- Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside (ONPG) oder Chlorphenol rot-β-D-Galactopyranoside (CPRG)), die durch β-Galaktosidase gespalten sind, treten Sie einer 6-tägigen gekühlten Inkubation erleichtern Sie Einsatz in undergraduate Laborübungen, eine automatisierte Anwendung für LacZ Berechnungen und R-Code für die damit verbundenen 4-Parameter logistische Regressionsanalyse. Das Protokoll wurde entwickelt, um Studenten zu entwickeln und führen Experimente, in denen sie Produkte ihrer Wahl für Östrogen imitiert Bildschirm, zu ermöglichen. Sie lernen dabei endokrine, Zellkultur, Rezeptorbindung, Enzymaktivität, Gentechnik, Statistik und Versuchsplanung. Gleichzeitig, sie auch üben Labor für grundlegende und breit anwendbar, wie z. B.: Berechnung der Konzentrationen; Herstellung von Lösungen; sterilen Technik demonstrieren; seriell verdünnen Normen; Bau und Interpolation Standardkurven; Ermittlung von Variablen und Kontrollen; sammeln, organisieren und analysieren von Daten; Aufbau und Interpretation der Graphen; und mit gemeinsamen Laborgeräte wie Mikroliterpipetten und Spektralphotometer. So fördert die Umsetzung dieser Assay Studenten in Inquiry-based Learning™ beim erkunden von neuen Themen in Umweltwissenschaften und Gesundheit engagieren.

Dieser Artikel stellt einen optimierte Hefe Östrogen Bildschirm zur Quantifizierung der Liganden in Körperpflegeprodukten (PCP), die Östrogen-Rezeptoren Alpha (ERα) und/oder Beta (ERβ) binden. Die Methode umfasst zwei farbmetrischen Substrat Optionen einer sechstägigen gekühlten Inkubation für den Einsatz in grundständige Studiengänge und statistische Werkzeuge zur Datenanalyse.

Nachweis Estrogenic Liganden in Körperpflege-Produkte mit einer Hefe Östrogen Bildschirm optimiert für Undergraduate Teaching Labor

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe eines Hefe-Östrogen-Screens menschliche Östrogenrezeptor-Agonisten zu quantifizieren, die aus Körperpflegeprodukten extrahiert wurden. Diese Methode kann wichtige Fragen auf dem Gebiet der Toxikologie, der endokrinen Störungen und der Ökophysiologie beantworten, da sie Umweltöstrogene in Wasser, Lebensmitteln und Körperpflegeprodukten nachweist und quantifiziert. Die wesentlichen Vorteile dieser In-vitro-Technik liegen in ihrer Kostengünstigkeit, ihrer weiten Verbreitung und der hervorragenden Eignung als Lehrplattform für laborwissenschaftliche Fertigkeiten.Der Nachweis von Umweltöstrogenen ist entscheidend, da sie hormonelle Signalwege beeinflussen können, insbesondere während der fetalen Entwicklung und in Phasen physiologischer Übergänge wie der Pubertät. Die schwierigsten Teile dieser Methode sind die Berechnungen und die Datenanalyse, die wir durch die Entwicklung einer benutzerfreundlichen Anwendung vereinfacht haben. Außerdem ist ein genaues Pipettieren unerlässlich.Dieses Protokoll beginnt mit der Herstellung der Reagenzien. Bereiten Sie Glucose- und Galactose-Medien, Fahrzeugkontrollen mit 50 % Ethanol sowie Estradiol-Standards vor, die am ersten Tag des Assays verwendet werden, sowie LacZ-Puffer, Dithiothreitol und Natriumcarbonat für den zweiten Tag. Sterilisieren Sie die Glucose- und Galactose-Medien durch Filtration über einen 0,2-Mikrometer-Filter. Bis zu 23 verschiedene Körperpflegeprodukte oder PCPs und Extraktionskontrollen können in einer 96-Well-Platte im Dreifachansatz getestet werden. Zu den PCPs gehören Seife, Haarcreme, Shampoo, Sonnenschutzmittel, Make-up, Rasiercreme und Lotion. Für die Dreharbeiten werden Proben aus lediglich acht PCPs vorbereitet.Vereinigen Sie ein Gramm jeder Probe mit 10 Millilitern wasserfreiem Ethanol in einem 15-Milliliter-Konischkolben. Bereiten Sie zusätzlich eine negative Extraktionskontrolle aus 11 Millilitern wasserfreiem Ethanol in einem 15-Milliliter-Konischkolben vor. Homogenisieren Sie den Inhalt jedes Konischkolbens 30 Minuten lang durch Kombination von manuellem Schütteln und Vortexen.Zentrifugieren Sie die kegelförmigen Röhrchen mit der maximal zulässigen Geschwindigkeit in einer Schwenkköbelzentrifuge für 10 Minuten. Gießen Sie das Überstandvolumen aus jedem Röhrchen über einen 40-Mikrometer-Zellfilter in ein 50-Milliliter-Kegelröhrchen. Übertragen Sie anschließend den Inhalt jedes 50-Milliliter-Röhrchens in ein Glas-Szintillationsfläschchen.Lassen Sie das Ethanol vollständig verdunsten, indem Sie die Gefäße eine Woche lang offen in einer belüfteten Abzugshaube stehen lassen. Schützen Sie die trocknenden Proben vor Licht, um eine Zersetzung lichtempfindlicher Bestandteile zu vermeiden. Wenn die Proben trocken sind, lösen Sie jede Probe in einem Milliliter 50%igem Ethanol wieder auf und mischen sie anschließend durch Vortexen, um eine Homogenisierung zu erreichen.Zwei Nächte oder etwa 42 Stunden vor der Herstellung der Hefe-Östrogen-Screening- oder YES-Platten die Hefe mittels steriler Technik unter Zugabe von jeweils 0,1 Milliliter jeder aktiven Hefekultur zu 10 Milliliter filtersterilisiertem Glucose-Medium in einem sterilen Erlenmeyerkolben unterkultivieren. Bei 30 Grad Celsius inkubieren und die ursprünglichen Kulturen als Stammlösungen weiter inkubieren. Zwei Tage später, am ersten Tag des YES-Assays, die suspendierten Hefekulturen unter Verwendung steriler Technik sowie das filtersterilisierte Galactose-Medium in einem sterilen Becher verdünnen.Überprüfen Sie die optische Dichte, indem Sie jeweils 120 Mikroliter jeder Hefe-Probe im Triplikat sowie Triplikate von Galactose-Medien-Blanks in eine klare Polystyrolplatte pipettieren. Verwenden Sie ein Platten-Spektrophotometer, um zu bestätigen, dass die verdünnte Hefe-Kultur eine netto optische Dichte von 0,065 ± 0,005 bei einer Wellenlänge von 610 Nanometern aufweist. Bestimmen Sie die netto OD610 der Hefe, indem Sie die OD610 der Galactose-Medien-Blanks subtrahieren.Unter Verwendung eines Wiederholungspipettiers mit einer sterilen Spritzenpitette geben Sie die verdünnte Hefesuspension gemäß diesem Plattenlayout in die Vertiefungen einer sterilen 96-Loch-Mikrotiterplatte aus Polypropylen. Während des Pipettierens halten Sie die Hefe in der Ausgangssuspension durch kontinuierliches Schwenken des Bechers oder Durchmischen mit der Pipette. Zuletzt geben Sie 120 Mikroliter filtersterilisiertes Galactosemedium in die Vertiefungen H10 bis H12, die im Plattenlayout grün markiert sind, um als Medienkontrollen zu dienen, die für Absorbanzen korrigieren, die allein durch das Medium verursacht werden.Stellen Sie separate Platten für jede Kombination von Hefe-Stamm und kalorimetrischem Substrat her, die getestet werden soll. Erstellen Sie anschließend in jeder Platte eine Standardkurve durch serielle Verdünnung gemäß dem Plattenlayout. Verwenden Sie einen Ein-Kanal-Pipettierer mit sterilen Spitzen, um fünf Mikroliter Estradiol-Standard in die Wells A2, A2 und A3 zu geben. Mischen Sie den Inhalt der Wells mit einem Mehrkanal-Pipettierer durch Auf- und Abpipettieren und übertragen Sie anschließend 205 Mikroliter von den Wells A1 bis A3 in die Wells B1 bis B3. Wiederholen Sie die Übertragung von 205 Mikrolitern bis zur Reihe G. Nach Abschluss der seriellen Verdünnung entsorgen Sie 205 Mikroliter aus den Wells G1 bis G3. Am Ende dieses Schritts sollten alle Standard-Well 120 Mikroliter enthalten.Geben Sie fünf µL 50 % Ethanol zu jedem Fahrzeugkontrollbrunnen hinzu, der die Hefesuspension enthält, die Brunnen H1, H2 und H3, die in diesem Plattenlayout blau markiert sind. Im nächsten Schritt werden je fünf µL der Proben oder negativen Extraktionskontrollen in dreifachen Ansätzen zu den Brunnen hinzugefügt, die die Hefesuspension enthalten und im Plattenlayout lila markiert sind. Notieren Sie, welche Proben oder Extraktionskontrollen in welche Brunnen gegeben wurden.Um im Überblick zu behalten, welche Wells Proben enthalten und welche nicht, beginnen Sie mit einer neuen Tipp-Box und verwenden Sie Tipp-Spitzen an denselben Positionen in der Box, wie die entsprechenden Wells in der Platte angeordnet sind. Mischen Sie den Inhalt der Probe-, Extraktionskontroll- und Fahrzeugkontroll-Wells durch Pipettieren. Stellen Sie die Volumina dieser Wells auf 120 Mikroliter ein, indem Sie jeweils 205 Mikroliter entfernen.Versiegeln Sie jede Platte mit einem sterilen, klebenden, porösen Film, beschriften Sie sie und inkubieren Sie sie 17 Stunden lang bei 30 Grad Celsius. Entfernen Sie die Platten nach der 17-stündigen Inkubation aus dem Inkubator. Falls die Platten nicht sofort verarbeitet werden können, wickeln Sie sie in Frischhaltefolie ein und lagern Sie die verpackten Platten sechs Tage lang bei vier Grad Celsius im Kühlschrank.Wenn die Platten verarbeitet werden sollen, nehmen Sie die Verpackung ab. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette den Inhalt jeder Reihe von Vertiefungen frei und übertragen anschließend 50 µL Hefesuspension von jeder Vertiefung in die entsprechende Vertiefung einer klaren Polystyrol-96-Well-Mikrotiterplatte. Beschriften Sie die neue Platte.Um eine Kreuzkontamination der Vertiefungen zu vermeiden, verwenden Sie für jede Vertiefung eine neue Pipettenspitze; die Spitzen müssen jedoch nicht steril sein. Geben Sie in einem Abzug 20 Mikroliter einer einmolaren DTT-Lösung zu 20 Millilitern aufgetautem LacZ-Puffer mit Raumtemperatur, um eine Endkonzentration von einem Millimolar DTT zu erreichen. Mischen Sie den LacZ-Puffer gründlich. Unter Verwendung eines Wiederholungspipettiers geben Sie 200 Mikroliter LacZ-Puffer, der DTT und entweder ONPG oder CPRG enthält, in alle Vertiefungen der Polystyrolplatte und messen sofort die optische Dichte bei 610 Nanometern aller Vertiefungen mithilfe eines Plattenlesegeräts. Wiederholen Sie dies bei Bedarf für zusätzliche Platten. Decken Sie die Platten mit einem Deckel ab und inkubieren Sie sie für die angegebenen Zeiträume bei 30 Grad Celsius.Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator. Geben Sie mithilfe einer Mehrfachpipette 100 Mikroliter Natriumcarbonat in jedes Loch, um die Beta-Galactosidase-Reaktion zu stoppen. Messen und notieren Sie die optische Dichte bei 405 Nanometern für ONPG oder bei 574 Nanometern für CPRG aller Löcher mit einem Plattenspektrophotometer.Die Berechnung von LacZ-Werten kann mithilfe einer automatisierten Anwendung durchgeführt werden, für die Java installiert sein muss. Öffnen Sie zunächst die in Anhang eins beschriebene automatisierte LacZ-Anwendung. Fügen Sie die Messwerte der optischen Dichte bei 405 Nanometern für ONPG bzw. bei 574 Nanometern für CPRG aller Vertiefungen ein, wobei ein Plattenlayout verwendet werden muss, das dem in Abbildung eins gezeigten entspricht.Geben Sie die Inkubationszeit und die Stunden ein, die der Assay zur Farbentwicklung benötigt, und klicken Sie auf Weiter. Fügen Sie die Messwerte der optischen Dichte bei 610 Nanometern für alle Vertiefungen ein. Klicken Sie auf Senden, um die LacZ-Ergebnisse anzuzeigen.Die LacZ-Ergebnisse können mithilfe von Tastaturbefehlen kopiert und bei Bedarf in eine Tabellenkalkulation oder andere Dateien eingefügt werden. Beginnen Sie diese Analyse, indem Sie die Online-YES-Assay-Datenanalyseanwendung öffnen. Laden Sie eine CSV-Datendatei hoch, die gemäß der Beschreibung auf dem ersten Tabulatorreiter formatiert ist.Digitalisieren Sie die Estradiol-Standardkurve auf der zweiten Registerkarte und schätzen Sie die Regressionsparameter. Sehen Sie sich die Ergebnisse des Regressionsmodells auf der dritten Registerkarte an und ermitteln Sie dann auf der vierten Registerkarte die interpolierten x-Achsen-Werte, die den LacZ-Werten der Proben entsprechen. Klicken Sie auf die fünfte Registerkarte, um die östrogänenäquivalenten Werte (EEQ) der Proben anzuzeigen.Schließlich standardisieren Sie die EEQ-Werte entsprechend der ursprünglichen Probenmasse, wie im textbasierten Protokoll beschrieben. Dargestellt sind Beispiele von Standardkurven nach einer 17-stündigen Inkubation von Hefe mit 17-Beta-Estradiol. Aus in der Arbeit diskutierten Gründen ist CPRG oft eine bessere Substratwahl als ONPG.In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen waren die Assays mit ER-Beta-exprimierenden Hefen um mehr als eine Größenordnung empfindlicher als die Assays mit ER-Alpha-exprimierenden Hefen. Daher wurde eine östrogene Aktivität häufiger in Hefen nachgewiesen, die ER Beta exprimieren. Ein zusätzliches Ziel der Studie bestand darin, Inkubationszeiten zu testen, die mit dem Zeitplan eines Praktikums für Studierende vereinbar sind.Wenn nach der 17-stündigen Inkubation eine Kühlung für sechs Tage eingeführt wurde, waren die Standardkurven von gekühlten Platten vergleichbar mit denen von nicht gekühlten Platten. Die Standardfehler der Parameter, die mithilfe von vierparametrigen logistischen Regressionsmodellen geschätzt wurden, waren bei gekühlten Platten sämtlich geringer als bei nicht gekühlten Platten. Daher verringert die sechstägige Lagerung der Platten im Kühlschrank den Fehler und verbessert die Genauigkeit der EEQ-Schätzungen.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in zwei bis drei bis vierstündigen Sitzungen abgeschlossen werden. Während des Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, für alle Schritte vor der 17-stündigen Inkubationsphase sterile Technik anzuwenden, sorgfältig und genau zu pipettieren und dem in Abbildung eins dargestellten Plattenlayout zu folgen. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie In-vivo-Tierassays durchgeführt werden, um zusätzliche Mechanismen der östrogenen Wirkung und Effekte auf den gesamten Organismus zu untersuchen.Nach ihrer Entwicklung hat sich der Hefestest für Östrogene als kostengünstige Methode zur Bestimmung östrogenartiger Liganden in Umweltproben wie Lebensmitteln, Pflanzengeweben und Körperpflegeprodukten etabliert. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie einfache Extraktionen von Körperpflegeprodukten durchgeführt werden, Hefe kultiviert wird, Standardverdünnungskurven vorbereitet werden, der YES-Test in einer 96-Loch-Platte durchgeführt wird und die dazugehörigen Berechnungen abgeschlossen werden. Und vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Estradiol äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und anderer persönlicher Schutzausrüstung sowie die sicherstellung einer ordnungsgemäßen Entsorgung stets beachtet werden sollten, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video beschreibt einen zellbasierten Reporter-Assay zur Bestimmung der östrogenen Aktivität von pflanzlichen Verbindungen. Eine Verbindung mit östrogenähnlicher Aktivität ahmt ihre Bindung an Östrogenrezeptoren nach und treibt die nachgeschaltete Transkription von Reporterenzym-Genen voran. Das Reporterenzym erzeugt in einer Reaktion Biolumineszenz, was auf die östrogene Aktivität der Verbindung hinweist.

Östrogenrezeptor-Reporter-Aktivitätsassay zum Screening der östrogenen Aktivität von Phytoöstrogen

Endokrin wirksame Stoffe (EDC) stellen ein erhebliches Risiko für die aquatische Umwelt. Kommunale Kläranlagen leisten einen wesentlichen Beitrag zur östrogene Potenz von Oberflächengewässern. Die Methodik in diesem Papier geliefert wird, ermöglicht eine Beurteilung der Wirksamkeit und Eignung von Abwasserbehandlungsverfahren in Bezug auf EDC Entfernung.

Die Verwendung einer Batterie von chemischen und ökotoxikologischen Methoden zur Beurteilung der Wirksamkeit von Abwasserbehandlungsprozesse zu entfernen Estrogenic Potency

Ein Protokoll zum Screening auf endokrine Aktivität in organischen Extrakten von Wasserproben, einschließlich aufbereitetem Abwasser und Oberflächenwasser (aufnehmendem Wasser), wurde unter Verwendung kommerziell erhältlicher in vitro Transaktivierungs-Bioassays angepasst.

Screening für Endokrine Aktivität in Wasser unter Verwendung von handelsüblichen<em&gt; In Vitro</em&gt; Trans Biotests

Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Analyse der 4-hydroxy-Tamoxifen-abhängigen Rezeptor alpha Liganden-bindende Domäne Dimerisierung Östrogenaktivität mit Säugetieren Zweimischling Assays.

Erkennung der Liganden-bindende Domäne Dimerisierung Aktivitäten von Östrogen-Rezeptor Alpha mit den Säugetieren Zweimischling Assay

Wir haben einen kommerziell erhältlichen Östrogenrezeptor β Reporter-Assays für das Screening menschlicher und nichtmenschlicher Primatennahrung auf östrogene Aktivität optimiert. Wir validierten diesen Test, indem wir zeigten, dass die bekannten östrogene soja-Lebensmittel hoch registriert sind, während andere Lebensmittel keine Aktivität aufweisen.

Screening auf Phytoöstrogene mit einem Zell-basierten Östrogen-Rezeptor β Reporter Assay

Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte enzymgebundene Immun-Sorbent-Methode (ELISA) zur Nachweisung und Quantifizierung von 17β-Estradiol und Testosteron in menschlicher Tränenflüssigkeit, die über Mikrokapillarröhrchen gesammelt wird. Dieser Ansatz ermöglicht eine minimalinvasive Messung der Tränenhormonspiegel.

Nachweis von Sexualhormonen im menschlichen Tränenfilm mittels enzymgebundener Immunsorbent-Assays

Mikrovolumen Proben werden mit einem Spektrophotometer, das natürliche Oberflächenspannung verwendet, um Proben ohne den Einsatz von Küvetten oder Kapillaren behalten quantifiziert. Der dynamische Bereich des Protein-Konzentrationen und die Geschwindigkeit, mit denen sie gemessen werden können, sind stark mit dieser Methode erhöht.

Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem NanoDrop 2000c Spektrophotometer

Hier beschreiben wir ein Plasmid Überexpression Bildschirm...

High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm

Das Ziel dieses Artikels ist es, ein Verfahren zu demonstrieren Immunfluoreszenz Detektion von Östrogen-Rezeptor-α (ERa) in Ratten Pia arteriellen Scheiben mit einem digitalen Immunfluoreszenz-Mikroskop zu optimieren.

Imaging von Estrogen Receptor-α in Rat Pial Arteriolen mit einem Digital-Immunfluoreszenz-Mikroskop

Dieses Protokoll beschreibt die regelmäßige Wartung und Pflege, um optimale Bedingungen für die Zebrafisch Haltung beizubehalten. Das Video veranschaulicht das Protokoll, für die Systemwartung, regelmäßige Haltung, Fütterung, Zucht und Aufzucht von Zebrafisch-Larven.

Regelmäßige Pflege und Wartung eines Zebrafisch (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Labor: Eine Einführung

Lernen Sie den optimierten Hefe-Östrogen-Screen zur Quantifizierung östrogenartiger Liganden in Körperpflegeprodukten. Diese kostengünstige Methode eignet sich ideal für die Lehre in Undergraduate-Laboren.

Nachweis Estrogenic Liganden in Körperpflege-Produkte mit einer Hefe Östrogen Bildschirm optimiert für Undergraduate Teaching Labor (Video) | JoVE Journal

Nachweis Estrogenic Liganden in Körperpflege-Produkte mit einer Hefe Östrogen Bildschirm optimiert für Undergraduate Teaching Labor

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