Echtzeit-Iontophorese mit Tetramethylammonium zur Quantifizierung der Volumenfraktion und Tortuosität des Gehirns extrazellulären Raumes

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Volumenanteil und die Tortuosität des extrazellulären Raums im Hirngewebe zu quantifizieren. Diese Methode beantwortet zentrale Fragen zur Beziehung zwischen dem extrazellulären Raum und der Physiologie und Krankheit. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Echtzeit-Charakterisierung von zwei wichtigen Parametern des extrazellulären Raums ermöglicht.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die iontophoretische Mikroelektrode dazu neigt, ihre Eigenschaften während der Experimente zu ändern, und während der Experimente häufig eine Fehlerbehebung erfordert. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die präzise Manipulation einer ionenselektiven Mikroelektrode, einer iontophoretischen Elektrode über mehrere Schritte, erforderlich ist, um eine erfolgreiche Aufzeichnung zu erhalten. Um dieses Verfahren zu starten, führen Sie ACSF, das Tetramethylammonium oder TMA enthält, mit zwei Millilitern pro Minute durch die Tauchkammer.

Stellen Sie den Temperaturregler auf eine gewünschte Temperatur ein und sprudeln Sie den ACSF für die Dauer des Experiments mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid. Montieren Sie als Nächstes die Erdungselektrode auf einer Halterung und tauchen Sie ihre Spitze in das ACSF ein, das durch die Tauchkammer verläuft. Füllen Sie dann den porösen Becher mit 0,3 % Agarose, die TMA enthält, und stellen Sie ihn in die Tauchkammer.

Befestigen Sie nun eine Iontophorese-Mikroelektrode an der Pipettenhalterung eines Mikromanipulators. Verbinden Sie den Iontophorese-Mikroelektrodendraht mit dem Kopftisch der Iontophoreseeinheit. Befestigen Sie als Nächstes ein kalibriertes ISM an den zweiten Mikromanipulator und verbinden Sie das ISM mit seinen Kopftischen.

Schalten Sie anschließend den Computer ein, auf dem sich die Programme Wanda und Walter befinden. Klicken Sie in der Wanda-GUI auf Kalibrieren. Geben Sie dann im Feld Kalibrierung die während der ISM-Kalibrierung gemessenen Spannungen ein und klicken Sie auf Daten anpassen.

Klicken Sie anschließend im Feld Kalibrieren auf Akzeptieren, um die generierte Steigung und Interferenz automatisch an die Haupt-GUI zu übertragen. Stellen Sie sicher, dass auf der linken Seite der GUI alle experimentellen Parameter in den entsprechenden Einträgen festgelegt sind. Platzieren Sie anschließend einen Temperaturfühler in den Agarbecher.

Notieren Sie die gemessene Temperatur im Eintrag Temperatur im Feld Messelektrode der GUI. Senken Sie dann die Mikroelektroden mindestens 1.000 Mikrometer tief in die Agarose ab und zentrieren Sie sie in der Tasse. Visualisieren Sie sie unter dem Mikroskop mit einem 10-fachen Objektiv

Bewegen Sie am zweikanaligen Verstärker den ISM-Kanalstecker manuell zum Spannungssubtraktionsausgang, um die Subtraktion zwischen dem Referenz- und dem ISM-Kanal einzustellen. Zentrieren Sie die Spitzen in allen drei Richtungsachsen übereinander. Nullen Sie dann die relativen Positionen beider Mikroelektroden auf den Steuerkästen des Mikromanipulators und stellen Sie sicher, dass die Mikroelektroden genau und präzise zentriert sind.

Bewegen Sie dann das ISM in einer Achse 120 Mikrometer von der Iontophorese-Mikroelektrode weg. Starten Sie anschließend eine Aufnahme, indem Sie in der GUI auf Acquire klicken und lassen Sie das Programm für eine vollständige Aufnahme laufen. Öffnen Sie in diesem Verfahren das Walter-Programm auf dem Computer.

Klicken Sie im Menü "Null Datensätze von" auf die Schaltfläche Wanda Voltoro, um die von Wanda generierten Datensätze zu lesen. Wählen Sie im nächsten Popup-Fenster einen oder mehrere Datensätze aus, die gelesen werden sollen, und klicken Sie auf Öffnen. Klicken Sie im Menü One Write Excel auf Blatt 1.3 und folgen Sie den Anweisungen, bis die Datensätze automatisch grafisch dargestellt werden.

Um den Anpassungsvorgang zu starten, klicken Sie im Menü "Zwei Optionen" auf die Schaltfläche "Aufnahme auswählen". Bewegen Sie dann im Popup-Fenster in Abbildung zwei mit der Maus das Fadenkreuz über den ersten Datensatz, der verarbeitet werden soll, und drücken Sie eine der Maustasten, um den Datensatz auszuwählen. Klicken Sie danach im Menü auf Anpassungskurve und verwenden Sie mindestens 20 Iterationen der Anpassung, um eine genaue Anpassung der Daten zu erhalten.

Wählen Sie als Nächstes Alle aus, um alle Datenpunkte anzupassen, und wählen Sie Weiter aus. Das Programm passt sich der angezeigten Kurve an. Wählen Sie dann die Option aus, das Ergebnis in das entsprechende Tabellenkalkulationsprogramm zu schreiben, indem Sie im Menü mit den sieben Ergebnissen auf Excel klicken.

Benennen Sie die Excel-Datei. Notieren und protokollieren Sie die erzeugten Daten, die zur Bestimmung der Funktionalität der Iontophorese-Mikroelektrode verwendet werden. Wenn die Iontophorese-Mikroelektrode für das Experiment als geeignet erachtet wird, notieren Sie die durchschnittliche Transportzahl aus allen Versuchen im Endfeld TransportNum in der Wanda-GUI.

Bei diesem Verfahren wird eine 400 Mikrometer dicke Hirnscheibe in die Aufnahmekammer gelegt und so sichergestellt, dass sie vollständig in den fließenden ACSF eingetaucht ist. Bewegen Sie als Nächstes sowohl die Iontophorese-Mikroelektrode als auch das ISM über das Interessenfeld auf der Hirnscheibe. Tauchen Sie beide Elektroden in die fließende ACSF, aber über der Scheibe.

Versetzen Sie dann die Spannung sowohl für den Referenz- als auch für den Ionensensorkanal auf null Millivolt. Warten Sie, bis sich die Spannung in beiden Kanälen stabilisiert hat. Markieren Sie auf dem Schreiber die Spannung, die am Ionenmesskanal des ISM gemessen wurde.

Platzieren Sie anschließend die ISM- und Iontophorese-Mikroelektroden 200 Mikrometer tief in der Scheibe und 120 Mikrometer voneinander entfernt. Berechnen Sie die Spannungsdifferenz zwischen den TMA-Signalen, die im fließenden ACSF und im Gehirn gemessen werden, und geben Sie diesen Wert in das Feld Basisvolt Millivolt in der Messelektrodenbox der Wanda-GUI ein. Stellen Sie auf der linken Seite der GUI sicher, dass alle experimentellen Parameter korrekt eingegeben wurden.

Starten Sie die Aufnahme, indem Sie auf "Erfassen" klicken, und lassen Sie sie eine vollständige Aufnahme aufnehmen. Nachdem Sie beide Mikroelektroden aus der Scheibe genommen haben, verwenden Sie den Diagrammschreiber, um jede Änderung zwischen der jetzt gemessenen Spannung und der vorherigen Messung zu bestimmen. Um die Aufzeichnungen aus dem Gehirn zu analysieren, wiederholen Sie die Verfahren zur Agarose-Datenanalyse mit dem Walter-Programm.

Schreiben Sie die Daten in das Tabellenkalkulationsprogramm, indem Sie im Walter-Menü auf Excel klicken. Erfassen Sie dann den Volumenanteil des Gehirn-ECS, die Tortuosität des Gehirn-ECS und die unspezifische Clearance. Um die Transportnummer zu überprüfen, machen Sie neue Aufnahmen in agarose und wiederholen Sie die Vorgänge im Walter-Programm, um die Transportnummer zu erhalten.

Überprüfen Sie die Tabelle und prüfen Sie, ob sich die Transportnummer um mehr als 10 % von der Transportnummer geändert hat, die vor den Gehirnmessungen erhalten wurde. Wenn ja, sind die mit der iontophoretischen Mikroelektrode gewonnenen Daten nicht zuverlässig. Die in diesem Schritt gemessene Transportzahl muss genau mit der vor den Hirnmessungen ermittelten Zahl übereinstimmen, da sonst der Volumenanteil nicht als genau angesehen werden kann.

Verwenden Sie neu erhaltene ISM-Kalibrierungsdaten als Eingabe in das Wanda-Kalibrierfeld und überprüfen Sie, ob der Steigungswert um weniger als 10 % von der vorherigen Kalibrierung abweicht. Hier sind die repräsentativen Daten aus einer einzigen Studie mit Agar dargestellt, die die Konzentrationskurve von TMA zeigt. Und das ist eine angepasste Kurve, die aus der Datenverarbeitung in Walter gewonnen wurde.

Die Überlappung der Daten in der angepassten Kurve zeigt, dass die von Walter durchgeführte Kurvenanpassung die Diffusion in diesem Versuch genau modelliert. Hier ist die Tabelle der Agar-Messungen vor dem Experimentieren im Gehirn. Hier ist eine Zusammenfassung der Messungen, die in einem Maushirnschnitt unter Kontroll- und Versuchsbedingungen durchgeführt wurden.

Alpha nahm während einer hypoosmolaren Herausforderung ab, während die Tortuosität wie erwartet zunahm. Alpha hat die Kontrollwerte in den Wiederherstellungsbedingungen überschritten. Und hier ist die Tabelle der Agra-Messungen nach Experimenten im Gehirn.

Die durchschnittlichen Transportzahlen vor und nach dem Experiment lagen innerhalb von 10 % voneinander, was darauf hindeutet, dass die im Gehirn aufgezeichneten Werte zuverlässig waren. Einmal gemeistert, kann dieses Verfahren in 14 Stunden über zwei Tage durchgeführt werden. Am ersten Tag werden die ISMs hergestellt und kalibriert.

Am zweiten Tag werden die ISMs neu kalibriert und eine Echtzeit-Iontophorese durchgeführt. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, dass Sie zunächst genau den Abstand Ihrer Elektroden festlegen. Zweitens ist es wichtig, ein Experiment nur dann anzunehmen, wenn die Transportnummer der iontophoretischen Mikroelektrode während des gesamten Experimentverlaufs stabil bleibt.

Nach diesem Verfahren, das die Diffusion kleiner Kationen im extrazellulären Raum charakterisiert, können Sie andere Techniken wie das integrative optische Bildgebungsverfahren anwenden, mit dem Sie die Frage beantworten können, wie sich große Mikromoleküle im extrazellulären Raum bewegen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Echtzeit-Iontophorese-Methode zur Quantifizierung des extrazellulären Raumvolumens und der Tortuosität des Gehirns im lebenden Gehirn bei Gesundheit und Krankheit durchführen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.