In-vitro- Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in funktionellen Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens ist es, die kardiomyogene Induktion von mesenchymalen Stammzellen zu induzieren und zu beobachten. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der mesenchymalen Stammzellen zu beantworten, z. B. welche Heilmittel durch Umweltsignale induziert werden können, um funktionelle Kardiomyozyten zu erzeugen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Aggregatbildung und die kardialen fetalen Schichten anstelle von pharmakologischen Wirkstoffen oder genetischem Material verwendet.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, da sie das kardiomyogene Potenzial mesenchymaler Stammzellen auslotet. Dieses Verfahren wird mit mir von Frau Farwah Iqbal, einer Doktorandin unseres Labors, Max Librach und Nadav Gasner, beide Auszubildende unseres Labors, demonstriert. Nachdem Sie die Teile des Rattenwelpen gemäß dem Textprotokoll isoliert haben, schneiden Sie die Ventrikula in zwei Hälften und geben Sie sie in eine 10 Zentimeter große Schale mit 10 Millilitern PBS und Nadelstreifen auf Eis, damit das Blut ausgewaschen werden kann.

Schneiden Sie dann mit einer gebogenen Schere die Ventrikelwände in kleine Stücke mit einem Durchmesser von zwei bis drei Millimetern. Mit einer serologischen Pipette die Herzstücke von 10 bis 12 Tieren in ein 50-Milliliter-Röhrchen geben und absetzen lassen. Entfernen Sie so viel PBS P/S wie möglich, ohne Herzstücke zu entfernen.

Fügen Sie dann 10 Millimeter frisches PBS P/S hinzu. Um die Kardiomyozyten zu isolieren, verwenden Sie nach dem Absetzen der Herzstücke 0,15 % Trypsin in PBS, um das PBS P/S zu ersetzen und das Gewebe bei 37 Grad Celsius unter Schütteln 10 Minuten lang zu inkubieren. Entsorgen Sie den Überstand.

Wiederholen Sie dann den Trypsinaufschluss noch dreimal, außer dass Sie die Überstände in 50-Milliliter-Sammelröhrchen mit 10 Millilitern 100 % FBS dekantieren. Als nächstes zentrifugieren Sie die Röhrchen der Zellen und aspirieren den Überstand. Verwenden Sie dann DMEM-F12 mit 10 % FBS und 1 % P/S, um die Zellen zu resuspendieren und auf eine Sechs-Well-Platte zu säen.

Sobald sich die Zellen anheftet haben, ersetzen Sie das Medium durch zwei Milliliter frisches Medium. Um vorgefärbte MSCs herzustellen, entfernen Sie das Medium aus MSC-Kulturen, die eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreicht haben, in 10-Zentimeter-Schalen und fügen Sie drei Milliliter Zelldissoziationslösung hinzu. Inkubieren Sie die Gerichte fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Die dissoziierten Zellen werden in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführt und fünf Minuten lang bei 400 x G zentrifugiert. Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören, und suspendieren Sie die Zellen erneut. Verwenden Sie dann einen automatisierten Zellzähler, um die Zellen zu zählen.

Verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 1 x 10 bis zum sechsten MSC pro Milliliter in DMEM-F12, das 10 % FBS und 1 % P/S enthält. Geben Sie dann in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu den Zellen einen lebensfähigen, nicht übertragbaren Fluoreszenzfarbstoff und inkubieren Sie die MSCs eine halbe Stunde lang. Nach dem Zentrifugieren der Röhrchen bei 400 x G für fünf Minuten wird der Überstand abgesaugt und das Pellet in einer Konzentration von 1 x 10 auf den sechsten MSC pro Milliliter wieder suspendiert.

Übertragen Sie dann die MSCs in einer Konzentration von 10 x 10 auf Kardiomyozyten in die vierten Zellen pro Vertiefung der Sechs-Well-Platte. Um Aggregat-Cokulturen herzustellen, bereiten Sie eine Einzelzellsuspension von MSCs in alpha MEM vor, ergänzt mit einem 10 % FBS und 1 % P/S. Initiieren Sie die Aggregatbildung, indem Sie 25 Mikroliter Tropfen Zellsuspension auf die Innenfläche der Deckel von 10 Zentimeter großen Gewebekulturschalen geben.

Setzen Sie die Deckel auf die unteren Gegenstücke, die PBS P/S enthalten. Inkubieren Sie die Schalen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Beobachten Sie unter einem Stereomikroskop die Aggregatbildung in den Tropfen nach drei Tagen.

Wenn mehr als 80 % der Tropfen gebildete Aggregate enthielten, verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Mikropipette, um die Tropfen von den Deckeln zu sammeln, und übertragen Sie die Aggregate direkt auf primäre Kardiomyozyten-Monoschichten der Ratte. Inkubieren Sie die aggregierten Co-Kulturen bis zu zwei Wochen lang. Ändern der vollen Lautstärke des Mediums alle 72 Stunden.

Verwenden Sie täglich die Hellfeldmikroskopie, um Aggregate zu beobachten, die sich an fötale Zellschichten anlagern. Erfassen Sie Vertragsaggregate, wenn sie beobachtet werden. Die aktiven Aggregate ziehen sich synchronisiert zusammen, wir schlagen eine Leitfähigkeit zwischen ihnen in der gesamten fötalen Schicht vor, die keine körperliche Aktivität aufweist.

Aspirieren Sie das Medium und fügen Sie zwei Milliliter PBS pro Vertiefung der Sechs-Well-Schale hinzu. Entfernen Sie dann das PBS und fügen Sie zwei Milliliter Dissoziationslösung pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Gerichte drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Wie hier gezeigt, zeigten HMSCs von drei verschiedenen Typen in direkten Kokulturen eine ähnliche Häufigkeit und ein ähnliches Aussehen. Zwei bis drei Tage nach der Übertragung hängender Tropfen auf Herzzellen in aggregierten Co-Kulturen traten FTMs und Term Huck PBCs in größeren Aggregaten auf als bei BMSCs. In diesem Experiment zeigte die durchflusszytometrische Analyse der CD49F-Expression in undifferenzierten MSCs, dass 96% der FTM-Huck-PBCs, also 89% der Huck-PBCs und 53% der BMSCs, positiv für die Zelloberflächen-CD49F waren.

Die Durchflusszytometrie an TRA gewann 85 Zellen, zeigte die Hochregulation des Kardiomyozyten-assoziierten Markers SIRPA in FTM-Huck-PBCs und Term-Huck-PBCs, aber nicht in BMSCs aus direkten Kardiomyozyten-Cokulturen. Wie hier zu sehen ist, war die Hochregulation von cx43 in FTM-Huck-PBCs signifikant höher als in Term-Huck-PBCs oder BMSCs in direkten Co-Kulturen. Die fluoreszierende mikroskopische Analyse zeigte, dass die Unterscheidung von FTM- und Term-Huck-PBCs cx43 hochregulierte.

Mit Term Huck PBCs zu einem höheren Anteil als FTMs. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigte jedoch, dass cx43-positive puncta in der Zellmembran von FTM-Huck-PBCs beobachtet wurden und sie überwiegend zytoplasmatisch in Terminzellen waren. Schließlich wurde, wie hier zu sehen, eine Fluoreszenzmikroskopie mit hoher Vergrößerung an sortierten menschlichen Zellen durchgeführt, nachdem die Co-Kultivierung durchgeführt und die hohe Häufigkeit von cx43 in der Plasmamembran bestätigt wurde.

Einmal gemeistert, können die wichtigsten Schritte dieses Verfahrens in jeweils einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, aseptische Vorsichtsmaßnahmen einzuhalten. Es handelt sich um primäre tierische Gewebe, die bei unsachgemäßer Handhabung zu einer Kontamination führen können.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die weitere Kultivierung von kontraktiven Gesteinskörnungen, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie z.B. die Langlebigkeit dieser Strukturen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ermöglicht diese Technik Forschern auf dem Gebiet der MSCs, das Differenzierungspotenzial jüngerer Quellen mesenchymaler Stammzellen, wie z. B. extraembryonaler Gewebe, zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man MSC-Aggregate vorbereitet und sie mit direkten primären Gewebeschichten des Fötus kombiniert, und zwar auf eine Weise, die eine angemessene Induktion für die kardiomyogene Differenzierung bietet.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit BRDU äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie der ordnungsgemäße Umgang mit zytotoxischen Abfällen getroffen werden sollten.