Auswirkungen der allogenen Platelet-Rich Plasma (PRP) auf den Heilungsprozess des geschnittenen Achillessehnen von Ratten: eine methodische Beschreibung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Auswirkungen einer einzigen Injektion von plättchenreichem Plasma (PRP) auf die Widerstandsfähigkeit und den Heilungsprozess von chirurgisch durchtrennten Achillessehnen von Ratten zu verschiedenen Zeitpunkten zu beobachten. Diese Methode kann helfen, schnelle Fragen zum Muskel-Skelett-Bereich zu Sehnenläsionen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die chirurgischen, biomechanischen und PRP-Progressionsverfahren gut standardisiert sind.

Die Implikationen dieser Techniken erstrecken sich auch auf die Verwendung von PRP beim Menschen, da diese Arten von Läsionen und der Sehnenheilungsprozess bei Ratten und Menschen ähnlich sind. Obwohl diese Methode einen Einblick in die PRP-Vorbereitung bei Muskel-Skelett-Verletzungen geben kann, kann diese Injektionstechnik auch auf andere Systeme wie Herz- oder Hauterkrankungen angewendet werden. Die visuelle Demonstration der Methode ist sehr wichtig, da chirurgische und biomechanische Schritte eine gleichbleibende Reproduzierbarkeit erfordern, um optimale Ergebnisse zu erzielen.

Beginnen Sie damit, die Ratte zu wiegen und mit Ohrmarken zu versehen. Nachdem Sie den geeigneten Sedierungsgrad durch Zehenkneifen bestätigt haben, tragen Sie Wassertropfen auf die Hornhaut des Tieres auf und entfernen Sie die Haare von der linken Hintergliedmaße. Desinfizieren Sie die exponierte Haut mit einer Verdünnung von iso-Betadin-Lösung von eins zu 10 und legen Sie das Tier auf ein 20 Grad Celsius heißes Heizkissen unter einem Präpariermikroskop in der lateralen Dekubitusposition, wobei sich die linke Hintergliedmaße in der oberen Position befindet.

Fassen Sie die linke Pfote der Hintergliedmaße mit einer Pinzette und machen Sie einen 20 bis 25 Millimeter langen seitlichen Hautschnitt um die Achillessehne. Präparieren Sie mit einer feinen Schere die Faszie, um den Achillessehnenkomplex freizulegen und die Plantarsehne zu entfernen. Schneiden Sie die Achillessehne quer durch, fünf Millimeter proximal des Fersenbeinansatzes, und entfernen Sie einen fünf Millimeter langen Abschnitt.

Verwenden Sie dann resorbierbares Garn und fahren Sie mit Nähten fort, um die Faszie und die Haut zu schließen, und setzen Sie die Ratte bis zur vollständigen Genesung unter eine Wärmequelle mit Überwachung. Während sich die Empfängertiere erholen, werden 20 Milliliter Vollblut von einem Spenderherz einer Ratte pro Versuchstier in einzelne Röhrchen mit 3,2 % gepuffertem Natriumcitrat entnommen. Um das plättchenreiche Plasma zu erhalten, zentrifugieren Sie das Blut und ernten Sie mit einer Kunststoff-Transferpipette vorsichtig die obere PRP-haltige Phase in ein zweites Kunststoffröhrchen.

Bestimmen Sie das Volumen des gesammelten PRP und messen Sie die Thrombozytenzahl auf einem Hämatologie-Analysator. Zentrifugieren Sie das PRP erneut und überführen Sie den Überstand vorsichtig in ein neues Kunststoffröhrchen. Das verbleibende Volumen im PRP-Röhrchen sollte etwa 2/3 des Volumens betragen, das erforderlich ist, um 2,5 mal 10 bis sechs Blutplättchen pro Mikroliter zu erreichen.

Als nächstes suspendieren Sie das Plättchenpellet vorsichtig wieder durch Pipettieren. Messen Sie die Thrombozytenzahl dieses konzentrierten plättchenreichen Plasmas und fügen Sie das entsprechende Volumen an autologem plättchenarmem Plasma wieder hinzu, um bei Bedarf die Zielkonzentration zu erreichen. Aktivieren Sie die Blutplättchen mit 50 Mikrolitern Calciumchlorid pro Milliliter PRP für etwa eine Stunde bei Raumtemperatur.

Laden Sie dann die Blutplättchen in eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 21-Gauge-Nadel ausgestattet ist, und injizieren Sie 50 Mikroliter der Blutplättchen direkt in die Nahtstelle jedes Tieres. Am entsprechenden experimentellen Endpunkt wird die linke Hintergliedmaße des anästhesierten Versuchstieres rasiert und die Ratte wie gerade gezeigt unter einem Präpariermikroskop positioniert. Halten Sie die Pfote mit den Fingern fest und machen Sie einen 10-Millimeter-Schnitt in der Operationsstelle, um den Trizeps suralis freizulegen.

Um die Achillessehne zu entfernen, schneiden Sie den Fersenbein quer durch, fünf bis 10 Millimeter distal zu seinem Ansatz, und präparieren Sie ein Stück des Trizeps suralis, das groß genug ist, um in den Kryokiefer zu passen. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Probe sofort in den Oberkiefer des Kryokiefers zu platzieren und das Instrument zu schließen. Setzen Sie den Kryo-Kiefer senkrecht in eine Universalprüfmaschine ein und fixieren Sie den Fersenbein zwischen den unteren Klemmen.

Um die Querschnittsfläche zu berechnen, platzieren Sie die Kameras senkrecht zueinander. Geben Sie flüssigen Stickstoff in beide Oberkieferbecken, um den Muskel um eine Größenordnung steifer als die Sehne einzufrieren, damit er sich während des Zugversuchs nicht verformt. Wenn die Gefrierzone den Rand der Metallklemme erreicht, stellen Sie die Verschiebungsrate der Maschine auf eine konstante Geschwindigkeit von einem Millimeter pro Sekunde bis zum Bruch ein und beginnen Sie mit dem Zugversuch, indem Sie mit einem Computer die endgültige Zugfestigkeit in Newton aufzeichnen.

Um Unterschiede in den Querschnittsbereichen der heilenden Sehnen zu berücksichtigen, normalisieren Sie die Zugfestigkeit auf eine Flächeneinheit, die die mechanische Belastung des Gewebes darstellt. Wenn die Sehne reißt, frieren Sie die gerissenen Sehnenproben in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius bis zur RNA-Extraktion und RTPCR-Analyse. In diesem repräsentativen Experiment war zu jedem getesteten Zeitpunkt eine größere Kraft erforderlich, um eine Sehnenruptur in der PRP-injizierten Gruppe zu induzieren als in der Kontrollgruppe, die mit Kochsalzlösung behandelt wurde, was auf einen robusteren Heilungsprozess oder bessere mechanische Eigenschaften bei den PRP-behandelten Tieren hindeutet.

Obwohl die PRP-Gruppe eine höhere Streuung innerhalb der Gruppe aufwies als die Kochsalzlösungsgruppe, wurde festgestellt, dass die Querschnittsfläche der Sehnen in der PRP-injizierten Gruppe an den Tagen 15 und 30 nach der Läsionsinduktion größer war. Darüber hinaus zeigte die Trichromfärbung von Masson bei PRP-behandelten Tieren an den Tagen fünf und 15 ein höheres Vorhandensein von fibrillärem Kollagen, einer Schlüsselkomponente für die Sehnenmorphologie und -stärke, mit einer ähnlichen Intensität der Färbung, die in beiden Gruppen am Tag 30 nach der Injektion beobachtet wurde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Standardläsion an der Ratte induziert und die Sehne entnimmt, um ihren Heilungsprozess nach einer PRP-Injektion zu bewerten.