Labortechniken zur Aufrechterhaltung und Differenzierung von Biotypen von Vibrio cholerae Klinische und umweltliche Isolate

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, eine Sammlung von Protokollen bereitzustellen, die einfach durchzuführen sind und jedem Untersucher helfen können, ein bestimmtes klinisches oder umweltbedingtes Isolat von Vibrio cholerae zu charakterisieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Bakteriologie zu beantworten, wie z. B. die spezifischen genotypischen und phänotypischen Eigenschaften von Vibrio cholerae-Isolaten, insbesondere solche, die klinisch relevant sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es jedem Untersucher ermöglicht, diese Sammlung von Assays zu verwenden, um klinische oder umweltbedingte Vibrio cholerae-Isolate zuverlässig zu charakterisieren und zu unterscheiden.

Zusammen bieten diese Assays einen systematischen Ansatz, der als Alternative oder zusätzlich zu kostspieligen, arbeitsintensiven Experimenten und der Charakterisierung von klinischen und Umweltisolaten von Vibrio cholerae verwendet werden kann. Obwohl diese Methode Einblicke in die Charakterisierung von Vibrio cholerae-Biotypen geben kann, kann sie auch zur Charakterisierung der biochemischen und metabolischen Fähigkeiten anderer enterischer Bakterien angewendet werden. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten mit dem Zeitmanagement, da die Inkubationszeiten, die erforderlich sind, um optimale Ergebnisse zu gewährleisten, zwischen den biochemischen Assays variieren.

Visuelle Demonstrationen der Flecken- und Stichprotokolle sind von entscheidender Bedeutung, da Spritzer oft zu Kreuzkontaminationen führen können und ein maximaler Abstand erforderlich ist, um eine Verschmelzung zwischen den Kulturen zu verhindern. Beginnen Sie das Protokoll, indem Sie 1,8 ml flüssige Übernachtkultur für zwei Minuten durch Zentrifugation mit mindestens 8.600 xG in einem sterilen 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen pelletieren. Nach der Zentrifugation wird der Überstand entfernt und das Zellpellet durch Pipettieren in 900 μl frischer Luria-Bertani- oder LB-Bouillon wieder suspendiert.

Geben Sie anschließend 900 μl steriles Glycerin mit 60 % Volumenprozent in die Kultur und mischen Sie es durch Vortexen. Füllen Sie die Mischung in ein steriles 2-ml-Kryoröhrchen und lagern Sie die Stammkultur bei 80 Grad Celsius. Um die Brühe mit einer sterilen Impfschlaufe zu verwenden, entfernen Sie eine kleine Menge gefrorener Brühe und streifen Sie die Bakterien, um einzelne Kolonien auf LB-Agarplatten zu erhalten.

Setzen Sie die gefrorene Brühe nach Gebrauch sofort auf 80 Grad Celsius zurück, um ein vollständiges Auftauen der Kulturen zu verhindern. Inkubieren Sie die Platten mit dem Deckel nach unten für 12-16 Stunden bei 37 Grad Celsius. Besorgen Sie sich die zuvor vorbereitete Platte.

Impfen Sie 4 ml flüssige LB-Bouillon in einem sterilen 10-ml-Kulturröhrchen mit einer einzelnen Kolonie, indem Sie die Oberfläche der einzelnen Kolonie mit einer sterilisierten Schlaufe berühren und die Kolonie in die flüssige Brühe überführen. Inkubieren Sie dann die Kultur mit Belüftung in einem Shaker-Inkubator bei 225 U/min für 12-16 Stunden bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie die Übernachtkultur in flüssiger LB-Brühe vor.

Am nächsten Tag pelletieren Sie die Kultur und waschen Sie die Zellen, indem Sie das Zellpellet in 1,8 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS resuspendieren. Wiederholen Sie den Waschvorgang dreimal. Nach der dritten Wäsche mit einer abschließenden Resuspension in 1,8 ml 1x PBS.

Verwenden Sie dann eine Pipettenspitze, um 1 μl gewaschene Kultur auf dem jeweiligen Medium zu finden. Waschen Sie das aus Nachtkulturen gewonnene Zellpellet. Motilitäts-Agarplatten impfen, indem ein Impfstab in die gewaschene Flüssigkultur eingeführt und vertikal in das Medium eingestochen wird.

Stellen Sie sicher, dass sich der Impfstab beim Stechen in den Agar nicht verbiegt. Zwischen jeder Inokulation den Drahtstich mit einem Bunsenbrenner sterilisieren. Inkubieren Sie die Platten mit dem Deckel nach oben für 14-24 Stunden bei 37 Grad Celsius.

Überwachen Sie nach 14 Stunden die Motilitätsplatten genau, um ein Überwachsen der Kulturen zu verhindern. Injizieren Sie 4 ml Methylrot-Voges-Proskauer- oder MR-VP-Bouillon, indem Sie 10 μl der zuvor über Nacht zubereiteten Kultur in 4 ml MR-VP-Brühe in ein steriles Kulturröhrchen pipettieren und in einem Schüttel-Inkubator bei 225 U/min für 12-16 Stunden bei 37 Grad Celsius belüften. Als nächstes fügen Sie 150 μl 5 Gew.-% pro Volumen Alpha-Naphthol und 50 μl 40 μl Kaliumhydroxid pro Volumen zu 1 ml-Aliquoten der MR-VP-Übernachtkultur in sterilen Kulturröhrchen hinzu.

Wirbeln Sie dann kurz in den Röhren. Lassen Sie die Tuben bis zu vier Stunden bei Raumtemperatur stehen, bis sich die Farbe ändert. Biotyp-Referenzstämme und repräsentative El Tor-Varianten wurden in PCR-Basis-Genscreenings und phänotypische Assays eingeschlossen, um zwischen Biotyp-Hintergründen von klinischen und Umweltisolaten von V. Cholerae zu unterscheiden.

Klassisches Wildtyp-O395 demonstrierte klassische ctxB- und tcpA-Sequenzen. Umgekehrt wiesen die Wildtyp-El-Tor-Stämme N16961 und C6706 El Tor-ctxB- und tcpA-Sequenzen auf. MQ1795 und BAA-2163 enthalten die klassische Biotyp-Untereinheit ctxB, vergleichbar mit 0395.

Beide El-Tor-Varianten enthielten jedoch den tcpA, der auf den Hintergrund des El Tor-Biotyps hinweist. Bei der Züchtung auf LB-Agarplatten, die mit Polymyxin B supplementiert waren, zeigte der klassische Wildtyp-Biotypstamm 0395 eine Empfindlichkeit gegenüber Polymyxin B, während der Wildtyp-Biotypstamm des El Tor eine Resistenz zeigte. Die repräsentativen Stämme der El-Tor-Variante zeigten eine ähnliche Resistenz gegen das Antibiotikum.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie zwischen Vibrio cholerae-Biotypen unterscheiden können, indem Sie das in diesem Manuskript beschriebene System zur Identifizierung mehrerer Assays verwenden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit BSL-2-Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann und dass die ordnungsgemäße Handhabung und Entsorgung aller Materialien und Abfallprodukte gemäß den institutionellen, lokalen, staatlichen und bundesstaatlichen Vorschriften durchgesetzt werden muss. Zusätzlich zu den in diesem Manuskript aufgeführten Protokollen kann eine weitere Charakterisierung von Vibrio cholerae-Isolaten durch die Untersuchung anderer phänotypischer Eigenschaften wie Biofilmbildung und Autoagglutination erreicht werden.