Name: Labortechniken zur Aufrechterhaltung und Differenzierung von Biotypen von Vibrio cholerae Klinische und umweltliche Isolate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Lernen Sie Labortechniken zur Aufrechterhaltung und Differenzierung von Vibrio cholerae-Biotypen aus klinischen und umweltlichen Isolaten. Diese biochemischen Assays ermöglichen eine zuverlässige Charakterisierung für die Bakteriologie.

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Forschung unterstützt von New Hampshire-INBRE durch einen Institutional Development Award (IDeA), P20GM103506, vom Nationalen Institut für Allgemeine Medizinische Wissenschaften des NIH.

Hinweis: Zeitliche Betrachtungen für jeden Assay müssen gemacht werden, da einzelne Medienvorbereitungen unterschiedliche Zeiten erfordern. Zum Beispiel sollten feste Agarplattenmedien ausreichend kühlen und trocknen lassen (1-2 Tage). Zusätzliche Zeitüberlegungen ( dh Einzelkolonie und Übernachtkulturwachstum) werden unter jedem Protokoll spezifiziert und sind in Tabelle 2 zu finden . 1. Vorbereitung der Medien <ol><li> 1x Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) <ol><li> Wiegen 4,0 g NaCl, 0,1 g KCl, 0,72 g Na 2 HPO 4 und 0,12 g KH 2 PO 4 . Die Bestandteile werden in einem 1 l Erlenmeyerkolben vermischt, mit deionisiertem Wasser auf 500 ml eingestellt, mit einem pH-Meter den pH-Wert auf 7,2 eingestellt und HCl tropfenweise zu der Lösung gegeben und mit einem 0,22 μm-Filter autoklaviert oder filtriert. 1x PBS kann bei Raumtemperatur auf unbestimmte Zeit gelagert werden. ACHTUNG: HCl ist eine konzentrierte Säure und sollte entsprechend behandelt werdenZu institutionellen, lokalen, staatlichen und bundesstaatlichen Vorschriften. Für entsprechende Handhabungsrichtlinien beachten Sie bitte das Sicherheitsdatenblatt des Herstellers. </li></ol></li><li> Luria-Bertani (LB) Brühe <ol><li> Wiegen 5,0 g Trypton, 2,5 g Hefeextrakt und 2,5 g NaCl. Kombinieren Sie die Bestandteile in einer 1 l Flasche, stellen Sie das Volumen auf 500 ml mit entionisiertem Wasser, Autoklav und speichern Sie bei Raumtemperatur für bis zu 6 Monate. Für klassische Biotyp-Virulenz-induzierende Bedingungen, pH-Wert auf 6,5 mit HCl vor dem Autoklavieren einstellen. </li></ol></li><li> AKI Medium mit 0,03% (w / v) NaHCO 3 <ol><li> Für Komponente 1 (AKI-Medium): 7,5 g Pepton, 2,0 g Hefeextrakt und 2,5 g NaCl wiegen. Kombinieren Sie die Bestandteile in einer 1 l Flasche, stellen Sie das Volumen auf 450 ml mit deionisiertem Wasser und Autoklav ein. AKI-Medium kann bei Raumtemperatur bis zu 6 Monate gelagert werden. </li><li> Für Komponente 2 (NaHCO 3 ): 1,5 g NaHCO 3 wiegen und Volumen einstellenBis 50 ml mit deionisiertem Wasser in einem sterilen Vesikel. Filter sterilisieren NaHCO 3 mit einem 0,22 μm Filter. NaHCO 3 muss unmittelbar vor Gebrauch hergestellt werden. </li><li> Aseptisch kombinieren die beiden Komponenten ein 1:10 Verhältnis durch Filtern von Komponente 2 in Komponente 1 vor der Verwendung. </li></ol></li><li> Luria-Bertani (LB) Agar Platten <ol><li> 5,0 g Trypton, 2,5 g Hefeextrakt, 2,5 g NaCl und 7,5 g Agar abwiegen. Die Bestandteile in einem 1 l Erlenmeyerkolben vereinigen, das Volumen auf 500 ml mit deionisiertem Wasser, Autoklaven einstellen und in Standard-100 mm x 15 mm sterilen Petrischalen vorbereiten. Überzogene Medien können bis zu 6 Monate in Plastik verpackt werden, Deckel-Seite bis 4 ° C. </li></ol></li><li> LB-Agarplatten ergänzt mit Polymyxin B <ol><li> Für Komponente 1 (LB-Agar): 5,0 g Trypton, 2,5 g Hefeextrakt, 2,5 g NaCl und 7,5 g Agar. Kombinieren Sie die Bestandteile in einem 1 l Erlenmeyerkolben, stellen Sie das Volumen auf 500 ml wi einTh deionisiertes Wasser und Autoklav. </li><li> Für Komponente 2 (Polymyxin B): Polymyxin B in deionisiertem Wasser in einem sterilen 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf eine Konzentration von 50.000 IE / μl auflösen und mit einem 0,22 μm Filter filtrieren. </li><li> Sobald die Komponente 1 zu der Berührung kalt ist, aber noch nicht verfestigt ist, fügen Sie 500 μl der Komponente 2 zu der Komponente 1 aseptisch hinzu, wodurch eine Endkonzentration von 50 IE / μL entsteht und sorgfältig vermischt wird. Bereiten Sie in standardisierten 100 mm x 15 mm sterilen Petrischalen vor, indem Sie gemischte Agarmedien in die Petrischalen gießen. Überzogene Medien können bis zu 3 Monate in Plastik verpackt werden, Deckel-Seite bis 4 ° C. </li></ol></li><li> Minimale Citrat-Mittel-Agar-Platten <ol><li> Für Komponente 1 (Agar mit Bromthymolblau): 7,5 g Agar und 0,02 g Bromthymolblau wiegen. Die Bestandteile in einem 1 l Erlenmeyerkolben vereinigen, das Volumen auf 450 ml mit deionisiertem Wasser einstellen und die Mischung autoklavieren. </li><li> Für Komponente 2 (10x VBMM): wiegen 10 g MgSO 4 7H 2 O, 10,0 g Zitronensäure H 2 O, 50,0 g wasserfreies K 2 HPO 4 und 17,5 g NaNH 4 HPO 4 4H 2 O. Die Bestandteile in einem 1 l Erlenmeyerkolben vereinigen, das Volumen auf 500 ml einstellen Mit entionisiertem Wasser und Autoklav oder Filter sterilisieren mit einem 0,22 μm Filter. 10x VBMM kann bei Raumtemperatur bis zu 6 Monaten gelagert werden. </li><li> Fügen Sie 50 ml Komponente 2 zu Komponente 1 hinzu und bereiten Sie in standardisierten 100 mm x 15 mm sterilen Petrischalen vor, indem Sie gemischte Agarmedien in die Petrischalen gießen. Überzogene Medien können bis zu 6 Monate in Plastik verpackt werden, Deckel-Seite bis 4 ° C. </li></ol></li><li> Milch-Agar-Platten <ol><li> Für Komponente 1 (Milch): 8,0 g sofortige fettfreie Trockenmilch in einem 1 l Erlenmeyerkolben wiegen, das Volumen auf 200 ml mit entionisiertem Wasser und Autoklav einstellen. </li><li> Für Komponente 2 (Agar mit Hirn-Herz-Infusion): 3,68 g Hirn-Herz-Infusion und 6,0 ​​g Agar. Kombinieren Sie die conSubstituenten in einem 500 mL Erlenmeyerkolben, Volumen auf 200 ml mit deionisiertem Wasser und Autoklav einstellen. </li><li> Kombinieren Sie die beiden Komponenten, indem Sie die Komponente 2 nach dem Autoklavieren in die Komponente 1 gießen und gründlich mischen. Vorbereiten in 150 mm x 15 mm sterilen Petrischalen. Milchplatten können bis zu einer Woche in Plastik gepackt werden, Deckel-Seite nach unten bei 4 ° C. Bereiten Sie in 150 mm x 15 mm sterilen Petrischalen vor, indem Sie gemischte Agarmedien in die Petrischalen gießen. </li></ol></li><li> Motility Agar Platten <ol><li> Für Komponente 1 (LB-Agar): 5,0 g Trypton, 2,5 g Hefeextrakt, 2,5 g NaCl und 2,0 g Agar. Die Bestandteile in einem 1 l Erlenmeyerkolben vereinigen, das Volumen auf 500 ml mit entionisiertem Wasser und Autoklav einstellen. </li><li> Für Komponente 2 (1% (Gew./Vol.) Triphenyltetrazoliumchlorid, TTC): 0,25 g TTC. Einstellen des Volumens auf 25 ml mit deionisiertem Wasser in einem sterilen Vesikel und Filter sterilisieren mit einem 0,22 μm Filter. Lagerung bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur eingewickeltIn der Folie, um die Belichtung zu minimieren. </li><li> Füge 2,5 ml 1% (w / v) sterile TTC zu autoklavierten Medien hinzu. </li><li> Gießen Sie die Medien so dick wie möglich (≥ 50 ml / Platte) in große 150 mm x 15 mm sterile Petrischalen. Überzogene Medien können bis zu einer Woche in Plastik gepackt werden, Deckel-Seite nach oben bei 4 ° C. Bereiten Sie in 150 mm x 15 mm sterilen Petrischalen vor, indem Sie gemischte Agarmedien in die Petrischalen gießen. </li></ol></li><li> Voges-Proskauer (VP) <ol><li> Für die Komponente 1 (Methyl-Rot-Voges-Proskauer-Brühe, MR-VP): 1,7 g MR-VP-Medium in einem 500 mL Erlenmeyerkolben abwiegen, das Volumen auf 100 ml mit entionisiertem Wasser und Autoklaven einstellen. Sterile MR-VP-Brühe kann bei Raumtemperatur bis zu 6 Monate gelagert werden. </li><li> Für Komponente 2 (5% (w / v) alpha (α) Naphthol): 1,0 g α-Naphthol in einer sterilen Vesikel abwiegen und das Volumen auf 20 ml mit 95% igem Ethanol einstellen. Α-Naphthol kann bei Raumtemperatur bis zu 1 Woche in Folie eingewickelt werden, um Licht exp zu minimierenOsure </li><li> Für Komponente 3 (40% (w / v) Kaliumhydroxid, KOH): 20,0 g KOH in einer sterilen Vesikel wiegen, das Volumen auf 50 ml mit sterilem deionisiertem Wasser einstellen. KOH kann bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur in einem Kunststoffgefäß aufbewahrt werden. </li></ol></li></ol> 2. Instandhaltung und Wachstum von V. Cholerae- Stämme <ol><li> Vorbereitung und Verwendung von Tiefkühlkulturen <ol><li> Pellet 1,8 ml flüssige über Nacht Kultur für 2 min durch Zentrifugation (≥8,600 xg) in einem sterilen 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen, entfernen Sie den Überstand und re-suspendieren Sie das Zellpellet in 900 &amp; mgr; l frische LB-Brühe durch Pipettieren. </li><li> Fügen Sie 900 μl steriles 60% (v / v) Glycerin der Kultur hinzu und mischen durch Vortexen. </li><li> Übertragen Sie die Mischung auf ein steriles 2 mL Kryo-Röhrchen und lagern Sie auf unbegrenzt bei -80 ° C. </li><li> Um zu verwenden, entfernen Sie eine kleine Menge von gefrorenen Bestand mit einer sterilen Impfschleife und Streifen für einzelne Kolonien auf LB agAr Platten. Sofort Rücklauf von gefrorenem Lager auf -80 ° C nach Gebrauch, um zu verhindern, dass Kulturen vollständig auftauen. Inkubieren Sie die Platten Deckel-Seite nach unten für 12 bis 16 h bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Wachstum von Übernachtkulturen in flüssigem Medium <ol><li> Streifen für Einzelkolonien (nach Abschnitt 2.1.4) aus gefrorenem Bestand auf LB-Agarplatten. Inkubieren Sie die Platten Deckel-Seite nach unten für 12 bis 16 h bei 37 ° C. </li><li> 4 ml flüssige LB-Brühe in einem sterilen 10-ml-Kulturrohr mit einer einzigen Kolonie inokulieren, indem man die Oberfläche der einzelnen Kolonie mit einem sterilen Applikatorstock berührt und die Kolonie in die flüssige Brühe überführt. </li><li> Inkubieren mit Belüftung in einem Shaker-Inkubator bei 225 U / min für 12 bis 16 h bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Wachstumskurve <ol><li> Bereiten Sie über Nacht Kultur in flüssiger LB Brühe vor, wie oben in Protokoll 2.2 angegeben. </li><li> Mischen Sie eine 1: 100-Verdünnung der Übernachtkultur durch Übertragen von 250 μl über Nacht Kultur auf 25 ml frische LB-Brühe in einem sterilen 250 mL Erlenmeyerkolben. </li><li> Messen Sie die optische Dichte der Flüssigkulturen bei 600 nm (OD 600 ) jede Stunde, die zum Zeitpunkt der Inokulation beginnt (T 0 ). </li><li> Inkubieren Sie eine 1: 100-Verdünnung der Übernachtkultur mit Belüftung in einem Shaker-Inkubator bei 225 U / min für bis zu 30 h bei 37 ° C oder bis die Kultur die maximale Dichte erreicht. </li><li> Zeichnen Sie die OD 600 vs. Time und verwenden Sie eine lineare Regression, um die ungefähre Verdopplungszeit für jeden Stamm zu bestimmen. </li></ol></li><li> El Tor Biotype Virulenz Inducing Bedingungen <ol><li> Streifen für einzelne Kolonien aus gefrorenem Bestand auf LB-Agarplatten. Inkubieren Sie die Platten Deckel-Seite nach unten, für 12 bis 16 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Inokulieren Sie 10 ml AKI-Medium, das 0,03% (w / v) NaHCO 3 mit einer einzigen Kolonie enthält. </li><li> Inkubieren Sie die Kultur ohne Belüftung bei 37 ° C für 3,5 h. </li><li> 7 ml Kultur entfernen und die restlichen 3 ml Kultus inkubierenRe mit Belüftung in einem Shaker-Inkubator bei 225 U / min für weitere 4 h. </li></ol></li><li> Klassische Biotyp Virulenz Inducing Bedingungen <ol><li> Streifen für einzelne Kolonien aus gefrorenem Bestand auf LB-Agarplatten. Inkubieren Sie die Platten Deckel-Seite nach unten für 12 bis 16 h bei 37 ° C. </li><li> 4 ml flüssige LB-Brühe (pH 6,5) mit einer einzigen Kolonie inokulieren. </li><li> Inkubieren mit Belüftung in einem Shaker-Inkubator bei 225 U / min für 12 bis 16 h bei 30 ° C. </li></ol></li><li> Waschzelle Pellet in 1x PBS <ol><li> Pellet 1,8 ml über Nacht Kultur für 2 min durch Zentrifugation (≥8,600 xg) in einem sterilen 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Das Pellet in 1,8 ml 1x PBS durch Pipettieren erneut suspendieren. </li><li> Wiederholen Sie den Waschvorgang dreimal, gefolgt von einer abschließenden Resuspension in 1,8 ml 1x PBS. </li></ol></li></ol> 3. Charakterisierung von V. Cholerae Biotypen <ol><li> PCR-basierte Genetische Bildschirme mit ctxB und tcpA <ol><li> Entwerfen Sie einen Satz von Primern, die etwa 50-70 bp stromaufwärts und stromabwärts der Translationsstart- und Stoppstellen von ctxB bzw. tcpA anlagern. </li><li> Bereiten Sie über Nacht Kultur in flüssiger LB Brühe vor, wie oben in Protokoll 2.2 angegeben. </li><li> Isolieren Sie chromosomale DNA mit einem handelsüblichen Kit, der für Gram-negative Bakterien entwickelt wurde. Gereinigte chromosomale DNA kann unbegrenzt bei -20 ° C gelagert werden. Die chromosomale DNA-Isolierung unter Verwendung von im Handel erhältlichen Kits dauert im allgemeinen etwa 4 h. </li><li> Verwenden Sie ein Mikro-Volumen-Spektrophotometer, um sicherzustellen, dass die chromosomale DNA-Probe von hoher Qualität ist (A 260/280 &gt; 1,8). </li><li> Für jedes chromosomale DNA-Isolat wird die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf Eis in sterilen 200 &amp; mgr; l PCR-Röhrchen hergestellt und die Bereiche von ctxB und tcpA unter Verwendung von Standard-PCR-Komponenten amplifiziert: Taq- Polymerase und BuFfer (oder äquivalente), dNTP-Lösung und Vorwärts- / Rückwärts-Primer. Verwenden Sie Standard-PCR-Parameter (~ 3 Std.). Verwenden Sie zum Beispiel das folgende Protokoll: <ol><li> Anfängliche Denatur bei 95 ° C für 120 s. </li><li> Denaturierung bei 95 ° C für 60 s. </li><li> Anneal-Primer bei 60 ° C für 45 s. </li><li> Verlängere bei 72 ° C für 90 s. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1.5.2 bis 3.1.5.4 für 34 Zyklen. </li><li> Endverlängerung 72 ° C für 600 s. </li><li> Unendlicher Halten bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Färben Sie 5 &amp; mgr; l des jeweiligen PCR-Produkts unter Verwendung eines Standard-6 × DNA-Gel-Beladungsfarbstoffs und laden Sie etwa 10 &amp; mgr; l 1 kb-Leiter und 10 &amp; mgr; l PCR-Produkt auf ein 1% Agarosegel in 1x Tris-Borat-EDTA (TBE) Puffer. </li><li> Führen Sie die Gelelektrophorese bei 130 V aus, bis die Farbstofffront das Ende erreicht hat, aber nicht aus dem Gel (ca. 90 min). Eine ständige Überwachung wird empfohlen, da die Spannungs- und Laufzeiten je nach Ausstattung variieren können. </li><li> Bei der Überprüfung vonErfolgreiche PCR-Amplifikation bei der erwarteten Größe, reinigen die verbleibenden 45 μL PCR-Produkte mit einem handelsüblichen DNA Clean &amp; Concentrator Kit. </li><li> Sequenz gereinigtes PCR-Produkt (e) unter Verwendung der gleichen Primer, die für die PCR-Amplifikation verwendet werden, und die Vorbereitung pro lokalen Sequenzierungsrichtlinien-Richtlinien. </li><li> Vergleichen Sie das FASTA-Format von Gensequenzen von jedem Isolat zu der veröffentlichten Sequenz, die auf der NCBI-Website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) verfügbar ist, indem Sie die folgenden Zugangsnummern im Suchabfragefeld durchsuchen. </li><li> CtxB : (klassische) Region zwischen VC0395_A1059 bis VC0395_A1060 (El Tor) VC_1456 </li><li> TcpA : (klassisch) VC0395_A0353 (El Tor) VC_0828 </li></ol></li><li> Phänotypische Assays zur Biotyp-Klassifikation über Spotting <ol><li> Bereiten Sie über Nacht Kultur in flüssiger LB Brühe vor, wie oben in Protokoll 2.2 angegeben. </li><li> Waschen Sie das Zellpellet (s) gemäß Protokoll 2.6. </li><li> Verwenden Sie eine Pipette zuSpritzen 1 &amp; mgr; l gewaschene Kultur auf dem jeweiligen Medium. Für mittlere Auswahl- und Inkubationsangaben siehe Tabelle 2. </li></ol></li><li> Motilitätsassay <ol><li> Bereiten Sie über Nacht Kultur (en) in flüssiger LB-Brühe vor, wie zuvor in Protokoll 2.2 angegeben. </li><li> Waschen Sie das Zellpellet (s) gemäß Protokoll 2.6. </li><li> Inokulieren Sie Motilitäts-Agarplatten, indem Sie Inokulationsstab in die gewaschene Flüssigkeitskultur einfügen und &quot;vertikal&quot; in das Medium &quot;stab&quot;. Zwischen jeder Inokulation sterilisieren Sie den Drahtstab mit einem Bunsenbrenner, und wenn Sie Agar stechen, stellen Sie sicher, dass sich der Impfstab nicht beugt, da dies die Ergebnisse verändern kann. </li><li> Inkubieren Sie die Platten Deckel-Seite für 14 bis 24 h bei 37 ° C. Nach 14 h, überwachen Motilitätsplatten eng zu verhindern Überwachsen von Kulturen. </li></ol></li><li> Voges-Proskauer (VP) Assay <ol><li> Bereiten Sie über Nacht Kultur (en) in flüssiger LB-Brühe vor, wie zuvor in Protokoll 2.2 angegeben. </li><li> Inokulieren 4Ml Methylrot Voges-Proskauer oder MR-VP-Brühe durch Pipettieren von 10 &amp; mgr; l der zuvor hergestellten Übernachtkultur in 4 ml MR-VP-Brühe in einem sterilen Kulturrohr und Inkubieren mit Belüftung in einem Schüttel-Inkubator bei 225 U / min für 12 bis 16 H bei 37 ° C. </li><li> Füge 150 μl 5% (w / v) α-Naphthol und 50 μl 40% (w / v) KOH zu 1 mL Aliquoten der MR-VP-Übernachtkultur in sterilen Kulturröhrchen hinzu. </li><li> Kurz vorwirbeln und bei Raumtemperatur bis zu 4 h stehen lassen, bis sich Farbwechsel entwickelt. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Von den über 200 identifizierten V. Cholerae Serogruppen, nur O1 und O139 haben epidemisches Potential. Die O1 Serogruppe kann in zwei Biotypen unterteilt werden: klassisch und El Tor. Allerdings sind Hybrid-Stämme, die als El Tor-Varianten 13 , 17 bezeichnet werden, entstanden, die den El-Tor-Biotyp-Hintergrund besitzen und klassische Merkmale 8 , 9 , 10 ...

Cholera ist eine Erkrankung des distalen Dünndarms, die durch den Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln oder Wasser verursacht wird, die das aquatische Gram-negative Bakterium Vibrio cholerae enthalten. Symptome der Cholera sind Erbrechen und unkontrollierbare wässrige Durchfall, was zu schweren Dehydratation, die, wenn nicht richtig behandelt, wird zum Tod führen. V. Cholerae können in über 200 Serogruppen aufgeteilt werden, basierend auf der Struktur des Zelloberflächen-Lipopolysaccharids O-Antigens. Allerdings haben nur 2 Serogruppen, O1 und O139, epidemisches oder pandemisches Potential 1 , 2 gezeigt . Darüber hinaus ist die Serogruppe O139 in erster Linie nach Südostasien 3 , 4 isoliert, während die Serogruppe O1 weltweit verteilt ist. Darüber hinaus kann die O1-Serogruppe in 2 Haupt-Biotypen unterteilt werden: klassisch und El Tor. Der klassische Biotyp war für die erste 6 Cholera-Pandemie verantwortlichS zwischen 1817 und 1923. Die laufende siebte Pandemie ist ein Ergebnis des El Tor Biotyps, der weltweit den klassischen Biotyp in der Umwelt 5 , 6 , 7 vertrieben hat . In letzter Zeit sind Stämme aufgetreten, die charakteristische Merkmale sowohl der klassischen als auch der El Tor-Biotypen 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 enthalten und seither als El Tor-Varianten 13 , 17 bezeichnet werden . Einige El Tor-Varianten haben erhöhte Virulenz-Fähigkeiten mit einer schnelleren und schweren Krankheitsprogression gezeigt als bisher beobachtet, betontDie Notwendigkeit eines umfassenderen Ansatzes zur Identifizierung von Mitteln und zur Vorbeugung von Krankheiten 8 , 9 , 18 . Während die Biotyp-Identifizierung nicht sofort die Behandlung diktiert, können weitere Fortschritte in der Impfstoffentwicklung und zukünftigen therapeutischen Mitteln von der Biotypunterscheidung profitieren. Die erste Reihe von Protokollen, die hier aufgelistet sind, ermöglicht es den Ermittlern, V richtig zu pflegen. Cholerae-Stämme im Laborbereich. Konsistenz und anschließende Analyse erfordert die Vorbereitung und das Wachstum von Isolaten, die nicht biotypabhängig sind. Um jedoch die Virulenzgenexpression optimal zu induzieren, sind unabhängige biotypspezifische Kultivierungstechniken erforderlich. Darüber hinaus ist die Vorbereitung für verschiedene genetische und biochemische Assays in diesem Manuskript skizziert. Cholera-Toxin (CT) und das Toxin co-reGulf Pilot (TCP) sind zwei Hauptvirulenzfaktoren, die vom Masterregler ToxT in beiden Biotypen des V gesteuert werden. Cholerae O1 serogruppe 20 CT ist ein bipartites Toxin aus fünf CtxB Untereinheiten, die eine einzelne CtxA-Untereinheit umgeben, und ist verantwortlich für den schnellen Elektrolytverlust, der mit Cholera verbunden ist. TCP ist ein Typ-IV-Pilus, der von dem tcp- Operon ( tcpABQCRDSTEF ) codiert wird, und ist an der Anhaftung und Besiedlung des distalen Dünndarms beteiligt. TcpA ist das erste Gen des tcp- Operons, das für die einzelnen Pilinuntereinheiten kodiert, die für den Bau des Pilus 8 wesentlich sind. Die Gensequenz für ctxA ist vollständig zwischen klassischen und El Tor Biotypen konserviert , während ctxB und tcpA sich über die beiden Biotypen unterscheiden, aber in jedem Biotyp 8 konserviert sind. CtxB ist vollständig zwischen Biotypen außer bei zwei Base posi konserviert(115 und 203). Im El-Tor-Biotyp befindet sich Thymin an den Basenpositionen 115 und 203, während der klassische Biotyp an diesen Basen Cytosin enthält. TcpA ist in jedem Biotyp vollständig konserviert, unterscheidet sich aber bei mehreren Basen zwischen Biotypen. Diese genetischen Unterscheidungen dienen als primäre Biotyp-Identifikationsmarker, und nach der Sequenzierung des Polymerasekettenreaktions- (PCR-) Amplifikationsprodukts einschließlich dieser Stellen können Isolationssequenzen mit Wildtyp (WT) klassischem O395 oder WT El Tor N16961 verglichen werden, um den Biotyphintergrund zu bestimmen Von CT und TCP in einem gegebenen V. cholerae- Isolat. Es wurden zahlreiche Protokolle entwickelt, um die phänotypischen Unterscheidungen zwischen den klassischen und den El Tor Biotypen 21 , 22 , 23 zu charakterisieren. Polymyxin B ist ein Peptid-Antibiotikum, das die Integrität der äußeren Zellmembran im Gram-negativen bac kompromittiertTeria und Polymyxin B-Resistenz können durch den Polymyxin-B-Resistenz-Assay 21 sichtbar gemacht werden. Citrat ist ein primäres Substrat des Kreb-Zyklus, und die Fähigkeit, Citrat als einzige Kohlenstoffquelle zu metabolisieren, kann unter Verwendung des Citratmetabolismus-Assays 22 bestimmt werden . HapR kodiert einen globalen regulator und den master quorum-sensing regulator in V. cholerae, HapR, der an verschiedene Promotorregionen bindet und die Gen- und Operon-Expression 24 reguliert. Einige pathogene Stämme von V. cholerae haben eine natürlich vorkommende Frame-Shift-Mutation im hapR- Gen, die diese dichteabhängige Regulation der Virulenzgenexpression verursacht hat, um 24 , 25 verloren zu werden. Die Messung der HapR-regulierten Protease-Aktivität unter Verwendung von Milch-Agar-Medien ermöglicht es dem Forscher zu identifizieren, ob ein bestimmtes Isolat eine funktionelle HapR 23 enthält . DasHämolyse-Assay-Tests für die Fähigkeit eines Stammes, hämolytische Enzyme zu sezernieren, die rote Blutkörperchen lysieren; Der Grad der Hämolyse kann auf Blut-Agarplatten 23 sichtbar gemacht werden. Die Motilität ist oft mit der Virulenz in V. cholerae assoziiert und kann mit Motilitäts-Agarplatten 23 analysiert werden. Die Voges-Proskauer-Assay-Tests für die Fähigkeit eines Stammes, Glukose als einzige Kohlenstoffquelle zu gären und das Nebenprodukt Acetoin zu produzieren 21 . Mit der Entstehung von El Tor-Varianten ist es schwierig, die Ergebnisse eines gegebenen phänotypischen Assays ohne umfangreiches genotypisches Screening vorherzusagen und vor dem Ableiten des Biotyp-Hintergrunds von V. Cholerae-Isolate ist es empfehlenswert, diese Assemblierung von Assays 23 durchzuführen und die Ergebnisse mit Referenzstämmen wie in Tabelle 2 zu vergleichen. Hier haben wir eine Reihe von Protokollen vorgestellt, die gemeinsam den Vorläufer nutzenGenotypische und phänotypische Assays für einen umfassenderen Ansatz zur Charakterisierung von V. Cholerae biotypen Darüber hinaus haben wir die genotypischen und phänotypischen Unterscheidungen der bekannten V beschrieben. Cholerae El Tor-Varianten (MQ1795 und BAA-2163) im Vergleich zu den üblicherweise verwendeten Biotyp-Referenzstämmen (WT-Klassik O395, WT El Tor C6706 und WT El Tor N16961, Tabelle 1 ). Die Entstehung von El Tor-Varianten hat Herausforderungen für die Zuverlässigkeit von zuvor eingesetzten Single-Assay-Biotyp-Charakterisierungsprotokollen herausgestellt; Dieses Mehrfach-Assay-Identifizierungssystem wird jedoch eine zuverlässigere Charakterisierung von klinischen und ökologischen V ermöglichen. Cholerae isoliert.

<table><tbody><tr><td>1 kb DNA-Leiter</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232S</td><td>https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder</td></tr><tr><td>60% Glycerin</td><td>Calbiochem</td><td>356352</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Becto, Dickinson und Co.</td><td>214030 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch</td><td></td></tr><tr><td>Agar mit Hirn-Herz-Infusion</td><td>Becto, Dickinson und Co.</td><td>237500</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Peqlab</td><td>732-2789</td><td>https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+&currentLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+</td></tr><tr><td>Wasserfreies K2HPO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Blut-Agar-Platten</td><td>Remel</td><td>R01200</td><td>Bei 4 Grad lagern; C;&nbsp; http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar</td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Bromthymol Blue</td><td>Fisher Scientific</td><td>B388-10</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Zirtrinsäure & Middot; H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S72836-3</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363</td></tr><tr><td>Desoxynukleotid (dNTP) Solution Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td>Bei -20 & deg lagern; C;&nbsp; https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset</td></tr><tr><td>Dinatrium EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>DNA Clean & Konzentrator & Handel; -25 Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4007</td><td>http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit</td></tr><tr><td>GelGreen Nukleinsäure-Färbung</td><td>Biotium</td><td>41005</td><td>https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/</td></tr> <tr><td>Genesys 10SUV-VIS Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>840-208100</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100</td></tr><tr><td>Gentra Puregene Hefe/Bact. Kit</td><td>Qiagen</td><td>158567</td><td>https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>Ätzend; &nbsp; https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Le Loop</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>MP190-25</td><td>http://deconlabs.com/products/leloop/</td></tr> <tr><td>Le Stab</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>MP186-5</td><td>http://deconlabs.com/products/lestab/</td></tr> <tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT Horizontales Elektrophoresesystem</td><td>Bio Rad Labs</td><td>1704406</td><td>http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373</td></tr><tr><td>MR-VP Bouillon</td><td>Difco</td><td>216300</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher</td><td>Scientific S374-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>Scientific S271-10</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>Scientific S233-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&searchTerm=S233500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaNH4HPO4&middot; 4H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S218-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite Spektrophtometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-LITE-PR</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR</td></tr><tr><td>fettfreie Trockenmilch</td><td>Nestle Carnation</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>211677</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Petrischalen (100 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712</td></tr><tr><td>Petrischalen (150 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Polymyxin B Sulfatsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1004-10MU</td><td>Bei 2-4 Grad lagern; C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0273S</td><td>Bei -20 &deg lagern; C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer</td></tr><tr><td>Taq Reaktionspuffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M0273S</td><td>Bei -20 &deg lagern; C;&nbsp; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer</td></tr><tr><td>Thermocycler Bio-Rad C1000 Touch&trade; &nbsp;</td><td>Bio Rad Labs</td><td>1840148</td><td>http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME</td></tr><tr><td>Triphenyltetrazoliumchlorid</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10870</td><td>https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/</td></tr> <tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&searchTerm=BP1521&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Becto, Dickinson und Ko.</td><td>211705</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Becto, Dickinson und Co.</td><td>212750</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>&alpha;-napthol</td><td>MP Biomedicals</td><td>204189</td><td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189</td></tr></tbody></table>

labortechniken zur aufrechterhaltung und differenzierung von biotypen von<em&gt; vibrio cholerae</em&gt; klinische und umweltliche isolate

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Das aquatische Gram-negative Bakterium Vibrio cholerae ist der ätiologische Wirkstoff der infektiösen Magen-Darm-Cholera. Wegen der globalen Prävalenz und Schwere dieser Krankheit, V. Cholerae wurde sowohl im Umwelt- als auch im Laborbereich umfassend untersucht und erfordert eine ordnungsgemäße Instandhaltungs- und Kultivierungstechniken. Klassik und El Tor sind zwei Hauptbiotypen, die das V bilden . Cholerae O1 Serogruppe, die jeweils einzigartige genotypische und phänotypische Eigenschaften aufweisen, die zuverlässige Mechanismen für die Biotypcharakterisierung liefern und unterschiedliche Virulenz induzierende Kultivierungsbedingungen erfordern. Unabhängig von der Biotype des ursächlichen Stammes für jede gegebene Infektion oder Ausbruch, die Standard-Behandlung für die Krankheit beinhaltet Rehydratationstherapie ergänzt mit einem Regime von Antibiotika. Allerdings kann eine Biotyp-Klassifikation für Laboruntersuchungen erforderlich sein und kann im biomedizinischen Bereich breitere Auswirkungen haben.In den frühen 2000er Jahren wurden klinische Isolate identifiziert, die genotypische und phänotypische Merkmale sowohl von klassischen als auch von El Tor Biotypen aufweisen. Die neu identifizierten Hybriden, die als El Tor-Varianten bezeichnet wurden, haben dazu geführt, dass die klinische und ökologisch isolierte Biotypidentifikation komplexer wird als die bisherigen traditionellen Einzelassay-Identifikationsprotokolle. Neben der Beschreibung von V. Cholerae-Instandhaltungs- und Kultivierungstechniken beschreibt dieses Manuskript eine Reihe von gen- spezifischen ( ctxB- und tcpA ) PCR-basierten genetischen Bildschirmen und phänotypischen Assays (Polymyxin B-Resistenz, Citrat-Metabolismus, proteolytische Aktivität, hämolytische Aktivität, Motilität und Glukosestoffwechsel über Voges- Proskauer-Assay), der gemeinsam zur Charakterisierung und / oder Unterscheidung zwischen klassischen und El-Tor-Biotypen verwendet wird. Gemeinsam bieten diese Assays einen effizienten systematischen Ansatz als Alternative oder zusätzlich zu kostspieligen, arbeitsintensiven Experimenten in der CharakteristikVon V. Cholerae klinische (und umwelt-) isolate.

Für die ordnungsgemäße Instandhaltung und Verwendung von Bakterienstämmen empfiehlt es sich, die Verdopplungszeit der betreffenden Stämme zu kennen. Hierbei sind die unterschiedlichen Wachstumsraten der üblichen V Cholerae-Stämme wurden durch eine Wachstumskurve nachgewiesen, und ungefähre Verdopplungszeiten wurden unter Verwendung einer linearen Regression berechnet. WT El Tor N16961 und El Tor Variante MQ1795 zeigten kürzere Verdopplungszeiten (~ 1 h bzw. ~ 1 h) als WT klassis...

Dieses Manuskript beschreibt die richtigen Vibrio Cholerae-Instandhaltungstechniken zusätzlich zu einer Reihe von biochemischen Assays, die gemeinsam für eine schnelle und zuverlässige Differenzierung zwischen klinischen und ökologischen V verwendet werden. Cholerae-Biotypen im Laborbereich.

Labortechniken zur Aufrechterhaltung und Differenzierung von Biotypen von<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Klinische und umweltliche Isolate

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, eine Sammlung von Protokollen bereitzustellen, die einfach durchzuführen sind und jedem Forscher helfen können, einen bestimmten klinischen oder Umweltisolat von Vibrio cholerae zu charakterisieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Bakteriologie zu beantworten, beispielsweise bezüglich der spezifischen genotypischen und phänotypischen Merkmale eines beliebigen Vibrio-cholerae-Isolats, insbesondere solcher mit klinischer Relevanz. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie es jedem Forscher ermöglicht, diese Sammlung von Assays zu nutzen, um klinische oder Umweltisolaten von Vibrio cholerae zuverlässig zu charakterisieren und voneinander zu unterscheiden.Insbesondere diese Assays bieten einen systematischen Ansatz, der als Alternative oder Ergänzung zu kostspieligen, arbeitsintensiven Experimenten sowie zur Charakterisierung klinischer und umweltbezogener Isolate von Vibrio cholerae verwendet werden kann. Obwohl diese Methode Einblicke in die Charakterisierung von Biotypen von Vibrio cholerae ermöglicht, kann sie ebenfalls zur Bestimmung der biochemischen und metabolischen Fähigkeiten anderer en

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Beim Arbeiten mit und Reagenzien zur Kultur von Mikroorganismen, muss aseptischen Technik praktiziert, um sicherzustellen, Kontamination zu minimieren werden. Eine Vielzahl von Beschichtungsverfahren werden routinemäßig verwendet, um zu isolieren, verbreiten oder aufzuzählen Bakterien und Phagen, die alle Verfahren, die die Sterilität der experimentellen Materialien zu erhalten übernehmen.

Aseptische Labortechnik: Überzug Methoden

Eine schnelle Methode, um das Genom zu...

TransFLP - Eine Methode zur genetischen Veränderung<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; On Natural Transformation und FLP-Rekombination

Quelle: Yeung, M., et al. Entwicklung eines empfindlicheren und spezifischeren chromogenen Agarmediums für den Nachweis von Vibrio parahaemolyticus und anderen Vibrio-Spezies . J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt eine kulturbasierte Methode zur Identifizierung von Vibrio-Spezies , wobei chromogener Agar als genauere Alternative zu den häufig verwendeten Thiosulfat-Citrat-Gallensalzen-Saccharose oder TCBS-Agar hervorgehoben wird. Chromogener Agar bietet eine überlegene Differenzierung von...

Ein neues chromogenes Medium für den schnellen Nachweis von Vibrio-Spezies

Quelle: Brumfield, K. D. et al., Labortechniken zur Erhaltung und Unterscheidung von Biotypen von klinischen und Umweltisolaten von Vibrio cholerae . J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt das Wachstum von Bakterienkulturen in einem flüssigen Medium. Schütteln fördert die Belüftung und verteilt die Nährstoffe gleichmäßig, unterstützt exponentielles Wachstum und führt zu einer einheitlichen, metabolisch aktiven Suspension, die für nachgelagerte Anwendungen geeignet ist.

Erzeugung reiner Bakterienkulturen in einem flüssigen Medium

Quelle: Brumfield, K. D., et al. Labortechniken, die zur Aufrechterhaltung und Unterscheidung von Biotypen von Vibrio cholerae – klinische und Umweltisolate eingesetzt werden. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video demonstriert einen Soft-Agar-Test mit Triphenyltetrazoliumchlorid, um die Beweglichkeit von Vibrio-cholerae-Stämmen zu bewerten und zu vergleichen, indem die Stoffwechselaktivität durch die Bildung der roten Zonen um aktiv wandernde Zellen visualisiert wird.

Motilitätstest zum Vergleich von Vibrio-Cholerae-Stämmen mit Triphenyltetrazoliumchlorid

Quelle: Brumfield, K. D., et al., Labortechniken zur Erhaltung und Unterscheidung von Biotypen von klinischen und Umweltisolaten von Vibrio cholerae . J. Vis. Exp. (2017).Dieses Video demonstriert den Voges-Proskauer-(VP)-Test, um zwischen drei Biotypen von Vibrio cholerae zu unterscheiden: klassisch, Wildtyp-El Tor und El Tor-Variante. Jede Kultur wird in ein glukosehaltiges Medium geimpft, inkubiert und mit α-Naphthol und Kaliumhydroxid behandelt, um das Vorhandensein von Acetoin nachzuweisen.

Voges-Proskauer-Test zur Unterscheidung der Biotypen von Vibrio cholerae

Quelle: Nag, D., et al. Quantifizierung der Besiedlung und Durchfall von Vibrio cholerae im erwachsenen Zebrafischmodell. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Quantifizierung der Darmbakterienlast bei erwachsenen Zebrafischen, die mit einem antibiotikaresistenten Stamm von Vibrio cholerae infiziert sind. Nach Euthanasie und Dissektion wird der Darmtrakt isoliert, mit Glaskugeln homogenisiert und verarbeitet, um die Bakterien freizusetzen. Das resultierende Homogenat...

Quantifizierung der Darmbakterienlast bei mit Vibrio cholerae infizierten Zebrafischen

Elektroporation ist ein häufig verwendetes Verfahren zur Einführung von DNA in Bakterien in einem als Transformation bekannt. Traditionellen Protokolle zur Herstellung von elektrokompetenten Zellen sind zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Dieser Artikel beschreibt eine alternative, schnelle und effiziente Methode zur Herstellung von elektrokompetenten Zellen derzeit von einigen Labors eingesetzt.

Rapid-Protokoll für die Herstellung von Elektrokompetente<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Und<em&gt; Vibrio cholerae</em

Der Nachweis und die Isolierung klinisch relevanter Vibrio-Spezies erfordern selektive und differentielle Kulturmedien. In dieser Studie wurde die Fähigkeit eines neuen chromogenen Mediums zum Nachweis und zur Identifizierung von V. parahaemolyticus und anderen verwandten Spezies untersucht. Es wurde festgestellt, dass das neue Medium eine bessere Sensitivität und Spezifität aufweist als das herkömmliche Medium.

Entwicklung eines sensitiven und spezifischen chromogenen Agar Medium zum Nachweis von<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Und andere<em&gt; Vibrio</em&gt; Arten

Dieses Protokoll ermöglicht dem Leser, Galle Salz-induzierte Biofilmbildung in magensaftresistenten Krankheitserreger mit einem vielschichtigen Ansatz, um die dynamische Natur der bakteriellen Biofilmen zu erfassen, durch die Beurteilung der Einhaltung der extrazellulären Polymeren Stoffes Matrixbildung zu analysieren, und Dispersion.

Galle-Salz-induzierte Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern: Techniken für die Identifizierung und Quantifizierung

Lernen Sie Labortechniken zur Aufrechterhaltung und Differenzierung von Vibrio cholerae-Biotypen aus klinischen und umweltlichen Isolaten. Diese biochemischen Assays ermöglichen eine zuverlässige Charakterisierung für die Bakteriologie.

Labortechniken zur Aufrechterhaltung und Differenzierung von Biotypen von

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