Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen und Co-Lokalisierung zwischen Komponenten von Gap, Tight und Adherens Junctions in Murine Mamma Drüsen

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, zu bestimmen, ob zwei oder mehr interzelluläre Verbindungsproteine innerhalb von Zellen kolokalisieren und ihre physikalische Interaktion über Co-Immunpräzipitation weiter zu bewerten. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Biologie des Brustdrüsenfeldes zu beantworten, einschließlich der Rolle, die Verbindungsstellen bei der normalen Entwicklung und bei Krankheiten wie Brustkrebs spielen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zu relativ geringen Kosten signifikante Informationen über die Protein-Protein-Interaktion in vivo liefern kann.

Um eine Co-Immun-Fluoreszenzfärbung durchzuführen, nehmen Sie die entsprechenden mikroskopischen Objektträger aus dem Gefrierschrank. Fixieren Sie die Abschnitte sofort, indem Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in vier Prozent Formaldehyd tauchen. Tauchen Sie die Objektträger dann bei Raumtemperatur in phosphatgepufferte Kochsalzlösung.

Lassen Sie die Folien dort, bis Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Kreisen Sie jeden Abschnitt des Objektträgers mit einer handelsüblichen hydrophoben Barriere oder einem wasserabweisenden Laborstift ein. Geben Sie sofort Tropfen PBS in das Gewebe und legen Sie den Objektträger für den Rest des Eingriffs in eine menschliche Histologiekammer.

Blockieren Sie jeden Gewebeschnitt mit 100 bis 200 Mikrolitern drei Prozent Rinderserumalbumin-Tris-gepufferte Kochsalzlösung, 0,1 %Polysorbat-20, für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Während die Proben blockieren, bereiten Sie die primären und sekundären Antikörperlösungen vor, indem Sie die Antikörper in TBS 0,1 %Polysorbat-20 verdünnen. Nach Entfernung der Blockierungslösung durch Aspiration inkubieren Sie die Schnitte in 100 bis 200 Mikrolitern des verdünnten Primärantikörpers 60 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie dann die primäre Antikörperlösung durch Aspiration und waschen Sie die Schnitte fünf Minuten lang mit 250 bis 500 Mikrolitern TBS 0,1%Polysorbat-20. Entfernen Sie die Waschlösung durch Aspiration, bevor Sie die Wäsche zweimal wiederholen. Die Waschlösung wird aspiriert und die Schnitte mit 100 bis 200 Mikrolitern des entsprechenden Fluor-4-konjugierten Sekundärantikörpers 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.

Nach der Entfernung der Sekundärantikörperlösung durch Aspiration waschen Sie die Schnitte fünf Minuten lang mit 250 bis 500 Mikrolitern TBS 0,1%Polysorbat-20. Entfernen Sie die Waschlösung und wiederholen Sie den Vorgang zweimal. Wiederholen Sie diese Schritte mit der geeigneten Kombination von Primär- und Sekundärkörpern für alle nachfolgenden Proteine von Interesse.

Nach der Entnahme der letzten Wäsche führen Sie die Zellkernfärbung durch, indem Sie den Schnitt mit 100 bis 200 Mikrolitern eines Milligramms pro Milliliter DAPI und TBS 0,1 %Polysorbat-20 für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Aspirieren Sie die DAPI-Lösung und montieren Sie die Objektträger mit einem wasserlöslichen, nicht fluoreszierenden Einbettmedium und Deckgläsern. Legen Sie die Objektträger für mindestens acht Stunden flach in einen vier Grad Celsius heißen Kühlschrank.

Fahren Sie mit der fluoreszenzmikroskopischen Bildgebung fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Sammeln Sie 500 bis 1000 Mikrogramm des Lysats und verdünnen Sie es in PBS auf jeweils ein Endvolumen von 200 Mikrolitern in jedem 1,5-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie den Antikörper gegen das gewünschte Antigen in die erste Tube Lysat und halten Sie es auf Eis.

Inkubieren Sie die Röhrchen über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Röhrchen-Walzenmischer bei niedriger Drehzahl. Geben Sie am nächsten Tag 50 Mikroliter magnetische Kügelchen zur Vorwäsche in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie die Röhrchen mit den Kügelchen auf das Magnetstativ und lassen Sie die Kügelchen in Richtung des Magneten wandern.

Entfernen Sie den Vorratspuffer mit einer 200-Mikroliter-Pipette von den Kügelchen. Waschen Sie die Kügelchen, indem Sie 500 Mikroliter PBS 0,1%Polysorbat-20 hinzufügen, und wirbeln Sie die Röhrchen 10 Sekunden lang kräftig ein. Setzen Sie dann die Röhrchen wieder auf den Magnetständer und lassen Sie die Kügelchen in Richtung des Magneten wandern.

Entfernen Sie den überschüssigen Waschpuffer, indem Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipette pipettieren. Geben Sie den Lysat-Antikörper-Reaktionskomplex zu den Kügelchen und inkubieren Sie sie 90 Minuten lang bei Raumtemperatur auf dem Walzenmischer. Legen Sie nach der Inkubation die Röhrchen auf den Magnetständer und lassen Sie die Kügelchen in Richtung des Magneten wandern.

Aspirieren und verwerfen Sie das Lysat mit einer 200-Mikroliter-Pipette und legen Sie die Röhrchen auf Eis. Waschen Sie die Kügelchen zweimal, indem Sie 500 Mikroliter PBS hinzufügen, die Röhrchen auf den Magnetständer stellen und die Flüssigkeit wie zuvor entfernen. Vermeiden Sie während der Waschschritte ein Vortexen und bewahren Sie die Proben auf Eis auf.

Waschen Sie die Kügelchen einmal mit PBS 0,1 %Polysorbat-20 ohne Vortexen und entsorgen Sie den letzten Waschpuffer mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze. Zur Eluierung geben Sie 20 Mikroliter 0,2 molares saures Glycin in die Röhrchen und schütteln Sie sie sieben Minuten lang auf dem Walzenmischer. Nach dem Zentrifugieren bei hoher Geschwindigkeit für einige Sekunden wird der Überstand in einem frischen, eiskalten Röhrchen aufgefangen.

Wiederholen Sie die Wasch- und Elutionsschritte für jedes Röhrchen. Fügen Sie dann 10 Mikroliter 4x Puffer zu der 40-Mikroliter-eluierten Probe hinzu. Geben Sie sofort einen molaren Tris zu den eluierten Proben, Tropfen für Tropfen, bis seine Farbe blau wird, und fahren Sie dann mit den nächsten Röhrchen fort.

Kochen Sie die eluierten Proben 10 Minuten lang bei 70 bis 90 Grad Celsius. Die vorbereiteten Lysate und die gefällten Proben werden nebeneinander in ein SDS-PAGE Acrylamidgel geladen. Lassen Sie das Gel etwa 95 Minuten lang in Laufpuffer bei 100 Volt laufen oder bis der Rand der migrierenden Proteine den Boden des Gels erreicht.

übertragen Sie die Gele unter Verwendung eines Standardprotokolls auf eine Nitrozellulose- oder PVDF-Membran. Blockieren Sie dann die Membran für eine Stunde auf einer Wippe bei niedriger Geschwindigkeit in fünfprozentiger Trockenmilch TTBS. Um festzustellen, ob die Fällung erfolgreich war, untersuchen Sie die Membran mit dem ersten Antikörper gegen das gefällte Protein.

Verdünnen Sie es in fünf Prozent Trockenmilch TTBS in der vom Hersteller empfohlenen Konzentration. Inkubieren Sie die Membran über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer Wippplattform unter langsamem Rühren. Waschen Sie die Membran am nächsten Tag dreimal für jeweils fünf Minuten mit TTBS auf einer Schaukelplattform bei starker Bewegung.

Dann inkubieren Sie die Membran in dem entsprechenden Sekundärantikörper, der mit Meerrettichperoxidase konjugiert und in TTBS verdünnt ist, eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einer wippenden Plattform unter langsamem Rühren. Führen Sie drei bis sechs Wäschen à fünf Minuten lang mit TTBS auf einer Schaukelplattform mit hoher Bewegung durch. Analysieren Sie das Signal des Sekundärantikörpers, indem Sie die Membran mit einer im Handel erhältlichen Luminollösung inkubieren und den Anweisungen des Herstellers folgen.

Erkennen Sie das Signal mit einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem. Um interagierende Proteine zu identifizieren, wiederholen Sie diese Schritte mit den entsprechenden Antikörpern auf demselben Blot. Um zu bestimmen, ob Gap-Junction-, Adhärenz- und Tight-Junction-Komponenten in der Brustdrüse miteinander interagieren können, wurden Co-Immunfluoreszenz-Assays durchgeführt.

Der Co-Immunfluoreszenz-Assay zeigt, dass Beta-Catenin, ein integrales Protein der Adherens-Verbindung, und Connexin 26, ein Gap-Junction-Protein, am siebten Laktationstag an der Zellmembran in den Brustdrüsen von Mäusen kolokalisieren, was sich in der gelben Farbe widerspiegelt. Zellkerne werden mit blauer DAPI-Färbung sichtbar gemacht. Kryoschnitte aus Brustdrüsen am 18. Schwangerschaftstag wurden geschnitten und immunfluoreszierend gefärbt für Claudin 7, ein Tight-Junction-Protein, das in grün dargestellt ist, E-Cadherin, ein adherens-Junction-Protein, das in rot dargestellt ist, und Connexin 26, ein Gap-Junction-Protein, das in Korallenblau dargestellt ist.

Die Zellkerne wurden mit blauem DAPI gefärbt. Die Kolokalisation von E-Cadherin und Claudin 7 wird als gelbe bis hellorange Farbe dargestellt, während die Kolokalisation von Connexin 26 mit E-Cadherin und Claudin 7 zu einer weiß punktuellen Färbung führte. Um herauszufinden, welche Verbindungsproteine sich an der Zellmembran vermischen und physikalisch miteinander verbinden, wurde eine Co-Immunpräzipitation mit Brustdrüsengewebe von laktierenden Mäusen durchgeführt.

Die Ergebnisse zeigten, dass Connexin 43, eine Komponente der Gap Junction, mit E-Cadherin und Claudin 7 interagiert, nicht jedoch mit Claudin 3. Diese Ergebnisse wurden durch die reziproke Immunpräzipitation bestätigt. Wenn E-Cadherin immunpräzipitiert wurde, interagierte es mit Connexin 43 und Claudin 7.

Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in zwei Tagen für die Co-Immunfluoreszenz von vier bis acht Objektträgern durchgeführt werden, und Objektträger können am nächsten Tag abgebildet werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Beim Versuch des Co-Immunfluoreszenz-Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, verschiedene Fluoro-4-konjugierte Antikörper auszuwählen, die in verschiedenen Räumen mit nicht überlappenden Wellenlängen aufgezogen werden, und die richtigen magnetischen Protein-A- oder G-Kügelchen auszuwählen, die mit den für die Co-Immunpräzipitation verwendeten Antikörpern kompatibel sind. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Zellbiologie den Weg, das Zusammenspiel der interzellulären Verbindungen in den Brustdrüsen von Mäusen zu erforschen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit extrem gefährlich ist und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.