Protokolle für C-Brick DNA Standard Assembly mit Cpf1

In den folgenden Videos wird ein Verfahren zur Verwendung des C-Brick-Standards zum Zusammenbau von DNA-Teilen unter Verwendung des CRISPR-assoziierten Proteins Cpf1 beschrieben. Diese Methode kann die Entwicklung der DNA-Assemblierung im Bereich der synthetischen Biologie vorantreiben. Zum Beispiel, indem sie den Aufbau komplizierter genetischer Schaltkreise erleichtern.

Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie sequenzunabhängig ist und eine iterative Assemblierung von DNA-Konstrukten ermöglicht. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir feststellten, dass Cpf1 von einer einzelnen siRNA und katalyktischen DNA gesteuert wird, die weggestapelt wird. Daher wird das Generieren von DKNs.

Das Verfahren wird von Shi-Yuan Li, einem Doktoranden aus meinem Labor, vorgeführt. Um die crRNA-Templates zu reparieren, re-suspendieren Sie die einzelnen Oligonukleotide in RNase-freiem Wasser auf eine Konzentration von 10 Mikromolaren. Zu einem 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen fügen Sie Oberstrang-Oligonukleotid, Unterstrang-Oligonukleotid und 10-fachen Annealing-Puffer hinzu, wie im Begleitdokument beschrieben.

Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 50 Mikroliter beträgt. Diese Tabelle zeigt sechs verschiedene Oligonukleotide für den Unterstrang, von denen jedes einzeln mit dem Oberstrang T7-F gepaart werden sollte. Die Kleinbuchstaben stellen die Sequenz dar, die in die Leitsequenz der crRNA transkribiert werden soll.

Legen Sie das PCR-Röhrchen in einen Thermocycler. Führen Sie das Glühprogramm mit einer anfänglichen Denitrierung bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten und einer anschließenden Abkühlung von 95 auf 20 Grad Celsius mit einer Abnahme von einem Grad Celsius pro Minute durch. Führen Sie nach dem Glühen sofort eine Transkription durch, indem Sie das geglühte Produkt mit RNase-freiem Wasser, T-7-Transkriptionspuffer, NTP-Mischung, rekombinantem RNase-Inhibitor und T-7-RNase-Polymerase in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen kombinieren.

Inkubieren Sie die Reaktion über Nacht in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie am nächsten Tag ein RNA-Aufreinigungs- und Konzentrationskit, um die transkribierte RNA aufzureinigen. Verwenden Sie ein UV-Vis-Spektralphotometer, um die RNA zu quantifizieren.

Verdünnen Sie dann die RNA auf eine Konzentration von 10 Mikromolaren. Wenn die Proben nicht sofort verwendet werden, lagern Sie sie bei 80 Grad Celsius. Die Konstruktion von C-Brick-Teilen kann auf verschiedene Weise erfolgen.

In diesem Abschnitt des Videos werden drei Chromoproteinkassetten, cjBlue, eforRed und amilGFP, nach der Methode der nahtlosen Assemblierung zusammengesetzt. Beginnen Sie mit dem Entwerfen und Ordnen der Oligonukleotide für die PCR-Amplifikation der Chromoproteinkassetten. Wenn die Oligonukleotide eintreffen, suspendieren Sie sie in Reinstwasser bis zu einer Konzentration von 10 Mikromolaren.

Um die PCR-Reaktionen einzurichten, legen Sie anschließend 0,2 Milliliter PCR-Röhrchen auf Eis. Fügen Sie Reinstwasser, zwei XPCR-Puffer, DNTPs, Vorwärts- und Rückwärtsprimer, Chromoprotein-Template und DNA-Polymerase mit hoher Genauigkeit hinzu. Legen Sie die Schläuche direkt in den Thermocycler und führen Sie das Programm aus.

Verwenden Sie die Proben sofort oder frieren Sie sie ein und lagern Sie sie bei 20 Grad Celsius. Nach der Amplifikation reinigen Sie die PCR-Produkte mit einem Kit. Um den C-Brick-Standardvektor mit BamH1 zu verdauen, fügen Sie dem Röhrchen Reinstwasser, Plasmid, 10x Puffer und BamH1 hinzu.

Inkubieren Sie bis zu zwei Stunden bei 37 Grad Celsius im Wasserbad. Reinigen Sie den linearisierten Vektor mit einem Gel-Cleanup-Kit. Kombinieren Sie nach der Reinigung den linearisierten Vektor, das PCR-Produkt, 5x nahtlosen Assemblierungspuffer und das nahtlose Assemblierungsenzym aus einem nahtlosen Assemblierungskit in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 10 Mikroliter beträgt. Legen Sie dies für 30 Minuten in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad. Verwenden Sie die Proben nach der Inkubation sofort oder frieren Sie sie auf Eis ein und lagern Sie sie bei 20 Grad Celsius.

Zu 90 Mikrolitern e coli DH10B fügen Sie 10 Mikroliter des Konstrukts hinzu. Führen Sie eine chemische Umwandlung durch. Verteilen Sie dann die transformierten Zellen auf einer LB-Platte und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius.

Am nächsten Tag wählen Sie mehrere Klone aus, um sie in fünf Milliliter flüssigen LB-Röhrchen zu kultivieren und sie über Nacht bei 37 Grad Celsius auf einem Schüttler bei 220 U/min zu inkubieren. Extrahieren Sie das Plasmid mit einem Plasmidvorbereitungskit. Identifizieren Sie dann die richtigen Klone durch Sanger-Sequenzierung.

Es ist zu wissen, dass die Konstruktion von C-Brick-Pfaden auch durch die reaktive PCI-Anwendung oder durch Einschränkung des sofortigen Verdaus des T4-DNA-Ligase-Mediums zur Ligation erreicht werden kann. Um den C-Brick-Vektor mit Cpf1 zu verdauen, kombinieren Sie anschließend RNase-freies Wasser, 10x Cpf1-Puffer, das Plasmid, den rekombinanten RNase-Inhibitor und Cpf1 in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Um ein fremdes DNA-Fragment in die T1- und T2-Stellen einzufügen, fügen Sie einen Mikroliter crRNA T2 hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen 30 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius.

Halten Sie dann das Röhrchen im Wasserbad, fügen Sie einen Mikroliter crRNA T1 und einen Mikroliter Cpf1 hinzu und inkubieren Sie weitere 30 Minuten. Die crRNA T2 wird zuerst hinzugefügt, da die beiden Erkennungsstellen näher an der Vektor-DNA liegen. Die Cpf1-Bindung an der T1-Stelle kann die Einbettung der T2-Stelle beeinflussen.

Wenn die T2'-Stelle die T2-Stelle ersetzt, würde die T2'-Stelle gestört werden, wenn zuerst die crRNA T1 hinzugefügt würde. Fügen Sie einen Mikroliter thermosensitive alkalische Phosphatase hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für eine weitere Stunde. Führen Sie eine Agarose-Gelelektrophorese durch und reinigen Sie den Vektor mit einem Gel-Cleanup-Systemkit.

Verwenden Sie die Proben sofort oder frieren Sie sie ein und lagern Sie sie bei 20 Grad Celsius. Um das DNA-Fragment von Interesse mit Cpf1 zu verdauen, kombinieren Sie RNase-freies Wasser, 10x Cpf1-Puffer, Plasmid, rekombinanten RNase-Inhibitor und Cpf1 in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Um ein fremdes DNA-Fragment in die T1- und T2-Stellen einzufügen, geben Sie einen Mikroliter crRNA T1 und einen Mikroliter crRNA T3 in das Röhrchen und inkubieren Sie es in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden.

Führen Sie nach der Inkubation eine Agarose-Gelelektrophorese durch und reinigen Sie das Fragment mit einem Gel-Cleanup-Kit. Verwenden Sie die Proben sofort oder frieren Sie sie ein und lagern Sie sie bei 20 Grad Celsius. Um das fremde DNA-Fragment im C-Brick-Vektor zu ligieren, kombinieren Sie anschließend den linearisierten Vektor und das DNA-Fragment in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Fügen Sie 10x T4-DNA-Ligase-Puffer und T4-DNA-Ligase hinzu. Dann zwei Stunden bei 22 Grad Celsius inkubieren. Verwenden Sie die Proben sofort oder frieren Sie sie ein und lagern Sie sie bei 20 Grad Celsius.

Geben Sie 10 Mikroliter der Ligationsprodukte zu e coli DH10B-kompetenten Zellen und führen Sie eine chemische Umwandlung durch. Verteilen Sie dann die transformierten E-Coli auf LB-Platten und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag geben Sie mehrere Klone in 5 Milliliter flüssige LB-Röhrchen und inkubieren sie über Nacht auf einem Shaker bei 220 U/min und 37 Grad Celsius.

Extrahieren Sie das Plasmid mit einem Plasmidvorbereitungskit. Identifizieren Sie dann die richtigen Klone durch Sanger-Sequenzierung. Führen Sie eine neue Runde der C-Brick-Montage durch.

Unter Verwendung der Probe können sogenannte Crack-Klone als neuer C-Brick-Vektor oder DNA-Stück für die weitere iterative Assemblierung von C-Bricks verwendet werden. Drei Chromoproteinkassetten, cjBlue, eforRed und amilGFP, wurden wie in diesem Video beschrieben zusammengesetzt. Drei Chromoproteine wurden in E. coli exprimiert, die auf einer Platte gezüchtet wurden.

Negative Kontrollbakterien ohne Chromoproteine sind auf der vierten Tafel dargestellt. Anschließend wurden zwei Farbausdruckskassetten mit dem C-Brick-Standard weiter zusammengebaut, um weitere Farben zu erzeugen. Drei Chromoproteine und drei assemblierte Dual-Chromoproteine wurden in E. coli exprimiert, die in flüssigem LB-Medium gezüchtet wurden.

Von eins bis sechs werden folgende Konstrukte ausgedrückt: eforRed, eins, amilGFP, zwei, cjBlue, drei, amilGFP plus eforRed, vier, eforRed plus cjBlue, fünf und amilGFP plus cjBlue, sechs. Die bunten Bakterien auf einer einzigen Platte oder in einem einzigen Mikrozentrifugenröhrchen wurden aus einem einzigen sequenzverifizierten Klon kultiviert. Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Woche durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist zu beachten, dass alle Materialien für die siRNA-Vorbereitung und die Cpf1-Clearancierung RNase-frei sein sollten. Ich empfehle immer noch, dass diese Taktik Forschern auf dem Gebiet der synthetischen Biologie geholfen hat, ein genetisches Schaufenster der Stoffwechselwege aufzubauen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen DNA-Pfad mit dem C-Brick-Standard zusammenstellt.