Name: Analyse von Mikroglia und Monozyten-abgeleiteten Makrophagen aus dem Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Lernen Sie die Analyse von Mikroglia und monozytenabgeleiteten Makrophagen im ZNS durch Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung spezifischer Zellmarker in der Neuroimmunologie.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Vereinigung Frankreich Alzheimer und Bpifrance. Unser Labor wird auch von Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie und dem Programm &quot;Investissements d&#39;avenir&quot; ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM) unterstützt. Wir danken der Unterstützung der CELIS Zellkultur.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am ICM Institute und dem Darwin French Ethic Animal Committee genehmigt und sind unter dem Protokoll 01407.02 abgedeckt. 1. Vorbereitung <ol><li> Den Verdauungscocktail in einem 1,5 mL Röhrchen vorbereiten, indem man für jede Maus folgendes kombiniert: 1 ml Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS); 123 μl Verdauungsenzym (siehe Materialtabelle) bei 13 wunsch / mL (Stammlösung), Endkonzentration 1,6 wunsch / mL; Und 5 &amp; mgr; l DNase I (siehe Tabelle der Materialien) bei 100 mg / ml (Stammlösung), Endkonzentration 0,5 mg / ml. </li></ol> 2. Perfusion und Dissektion <ol><li> Euthanisieren der Mäuse mit einer letalen Dosis Pentobarbital (100 μl bei 400 mg / ml). </li><li> Legen Sie das Tier in Rückenlage und nass den Körper mit 70% Ethanol. </li><li> Schneide die ventrale Haut mit feiner Schere direkt unterhalb des Xyphus-Prozesses, um den Thorax-Cavit auszusetzenY </li><li> Machen Sie einen Einschnitt in die Membran und schneiden Sie die seitlichen Aspekte des Brustkorbes mit feinen Scheren in einer kaudalen zu rostralen Richtung, um das Herz auszusetzen (und vermeiden Sie das Schneiden von anderen Organen). Identifizieren Sie den linken Ventrikel (LV) und den rechten Vorhof (RA). </li><li> Setzen Sie einen Schmetterlingskatheter mit einer 25 G Nadel im Inneren des LV ein. Machen Sie einen Einschnitt auf der RA mit feinen Scheren und am Anfang des Blutflusses, starten Sie die Perfusion bei 10 mL / min Durchflussrate durch die LV mit 20 mL PBS, um Zellen und Blut aus Gefäßen zu entfernen; Die erfolgreiche Perfusion wird durch die Blanchierung der Lunge und der Leber als Blut verunreinigt. </li><li> Das Tier mit einer mittleren Schere enthaupten. Die Wirbelsäule mit feiner Schere zerreißen und vom Körper trennen, indem man die Bauchwandmuskulatur auf der Bauchseite der Wirbelsäule aufhebt und die Wirbelsäule an der Unterseite des Schwanzes schneidet. </li><li> Legen Sie eine 10 ml Spritze mit PBS und eine 200 μl Pipettenspitze in die Lendenwirbelsäule einDie Wirbelsäule und spüle das Rückenmark auf der zervikalen Seite. HINWEIS: Die 200 μl Pipettenspitze wird mit einer Schere an ihrem breitesten Ende (ca. 1 cm) geschnitten und auf eine 10 mL Spritze, die zuvor mit PBS gefüllt ist, fest eingesteckt. </li><li> Entfernen Sie die Haut über dem Schädel und verwenden Sie Pinzette, um das Gehirn freizulegen. Setzen Sie ein Scherenblatt an die Basis des Schädels und schneiden Sie den Schädel nach der sagittalen Naht. Setzen Sie kleine Zangen in den Schnitt und heben Sie den Schädel vorsichtig an. Ziehen Sie das Gehirn aus dem Mauskopf und entfernen Sie die olfaktorische Glühbirne und Kleinhirn. </li><li> Sammeln Sie das Gehirn und das Rückenmark in einem 1,5 ml-Röhrchen mit 1,128 ml PBS mit dem Verdauungscocktail (ab Schritt 1.1). </li></ol> 3. Zelldissoziation <ol><li> Das Gehirn und das Rückenmark im 1,5 mL Röhrchen (Schritt 2.9) in 1-2 mm 3 Stück mit kleiner Schere schneiden ( Bild 1 ). </li><li> Inkubieren Sie das 1,5 ml-Röhrchen, das das gehackte Gewebe enthält, für 30 min in einem InkubaBei 37 ° C mit 5% CO 2 . HINWEIS: Den Dichtegradienten in diesem Schritt vorbereiten. </li><li> Füge 20 μl 0,5 M EDTA (Stammlösung), Endkonzentration 10 mM, zum 1,5 mL Röhrchen hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. </li><li> Vorsichtig eine Zellsuspension durch Pipettieren auf und ab mit einer 5-ml-Pipette machen. </li><li> Führen Sie die Zellsuspension durch ein Nylongewebe (70 μm Porengröße) in einem 50 mL Röhrchen unter Verwendung des Tauchkolbens einer 10 ml Spritze. </li><li> Waschen Sie das Nylongewebe mit 20 ml 5% fetalem Rinderserum (FBS) -PBS. </li><li> 5 min (300 xg) bei Raumtemperatur (18 ° C) zentrifugieren. Verwerfe den Überstand durch Aspiration und gehe zum nächsten Schritt. Sei besonders vorsichtig beim Entfernen des Überstandes; Störe nicht das Pellet, das leicht von der Saugpipette angesaugt werden kann. </li></ol> 4. Dichtegradient <ol><li> Vorbereiten einer Stammlösung des Dichtegradientenmediums durch Zugabe der geeigneten Menge von 10x PBS zu dem Dichtegradientenmedium. HINWEIS: Füge einen Teil 10X PBS zu neun Teilen Dichtegradientenmedium hinzu. </li><li> Verdünnen Sie das Stammdichtegradientenmedium mit 1x PBS für die verschiedenen Prozentsätze, wie in Tabelle 1 beschrieben . </li><li> Das Pellet (ab Schritt 3.7) mit 4 mL 30% Dichtegradientenmedium resuspendieren und in ein 15 mL Röhrchen überführen. </li><li> Legen Sie eine Pasteurpipette in den Boden des 15-ml-Röhrchens und legen Sie langsam 4 ml 37% Dichtegradientenmedium auf. </li><li> Füge 4 ml 70% Dichtegradientenmedium hinzu, wie oben beschrieben. </li><li> Den Gradienten für 40 min (800 xg) bei Raumtemperatur (18 ° C) zentrifugieren. Stellen Sie sicher, dass die Zentrifuge mit minimaler oder keiner Bremse stoppt, damit die Zwischenphase nicht gestört wird. HINWEIS: Die Röhre wird geschichtet erscheinen. Die Zellen, die an der 70% - 37% Dichtegradientenschnittstelle geschichtet sind, sind die mononukleierten Immunzellen (Mikroglia und Makrophagen Subpopulationen); Die oberen Ebenen sind Zelltrümmer und Myelin ( Abbildung 2 ). </li><lI&gt; Verwenden Sie eine Transferpipette, entfernen Sie vorsichtig die Myelinschicht. </li><li> Sammeln Sie 3-4 ml der 70-37% Dichtegradienten-Interphase, die die Makrophagen-Subpopulationszellen enthält, in ein sauberes 15-ml-Röhrchen. </li><li> Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS, Gesamtvolumen von 15 ml. Achten Sie darauf, dass das die Zellen enthaltende Dichtegradientenmedium mindestens dreimal mit PBS verdünnt und 7 min (500 xg, 4 ° C) mit der Bremse &quot;ein&quot; zentrifugiert wird. </li><li> Das Zellpellet mit 1 ml PBS zur Zellmarkierung oder für andere funktionelle Assays resuspendieren. </li></ol> 5. Zellbeschriftung für Durchflusszytometrie <ol><li> Übertragen Sie die Zellen (Schritt 4.10) in eine Durchflusszytometrie-Röhre. </li><li> Füge 1 μl fixierbares totes Zellfleck-Reagens zu jeder in Schritt 4.10 erhaltenen Zellprobe hinzu. Inkubieren für 30 min auf Eis, vor Licht geschützt. </li><li> Die Zellen einmal mit 2 ml PBS waschen und 5 min zentrifugieren (300 xg, 4 ° C). </li><li> Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet mit400 &amp; mgr; l PBS 1% BSA, 0,1% Azid. </li><li> Füge 1 μg CD16 / CD32 Antikörper zu 100 μl der Zellen hinzu, um die Fc-Rezeptoren zu blockieren. Inkubieren Sie 10-15 min auf Eis, geschützt vor Licht. </li><li> Bereiten Sie die primäre Antikörpermischung in PBS 1% BSA, 0,1% Azid oder PBS 1% BSA, 0,1% Azid, 0,25% Saponin, für die Zellpermeabilisierung für intrazelluläre Färbung vor. </li><li> 100 μl Primär-Antikörper-Mischung (2x) zugeben und 30 min auf Eis, inkubiert, inkubieren. HINWEIS: Alle Antikörper sollten vor der Durchführung des Experiments titriert werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen. </li><li> Die Zellen mit 2 ml PBS waschen und 5 min zentrifugieren (300 xg, 4 ° C). Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. </li><li> Fügen Sie 100 μl eines sekundären Antikörpers hinzu, wenn die primären Antikörper nicht direkt an einen Fluorophor konjugiert sind und für 30 min auf Eis, vor Licht geschützt, inkubieren. </li><li> Die Zellen mit 2 ml PBS waschen und 5 min bei 300 xg bei 4 ° C zentrifugieren). Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. </li><li> Beheb dasZellen mit 100 μl 1% PFA für 15 min bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. HINWEIS: Achtung: PFA ist giftig. In einer Dunstabzugshaube verwenden und persönliche Schutzausrüstung tragen. </li><li> Die Zellen mit 2 ml PBS waschen und 5 min bei 300 xg bei 4 ° C zentrifugieren. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. </li><li> Das Zellpellet mit 200 μl PBS resuspendieren und die Cytometrieerfassung und -analyse durchlaufen. Befolgen Sie die Gating-Strategie in Abbildung 3 . </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren

Es wurde gezeigt, dass die Mikroglia und MDM unterschiedliche Funktionen und Phänotypen im ZNS haben und somit die Identifizierung und die Analyse dieser Makrophagen-Subpopulationen wesentlich sind, um neurologische Erkrankungen besser zu verstehen 9 , 18 , 25 . Durchflusszytometrieanalyse unter Verwendung von zwei Markern (CD11b und CD45) ermöglicht die Unterscheidung zwischen jeder Subpopulation ( Abbildu...

Die Mikroglia sind die parenchymalen Gewebe-residenten Makrophagen des Zentralnervensystems (ZNS). Sie spielen zwei wichtige Funktionsrollen: Immunabwehr und Wartung der ZNS-Homöostase. Im Gegensatz zu den MDM, die kontinuierlich aus den hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark erneuert werden, unterscheiden sich die Mikrogliazellen von primitiven hämatopoetischen Vorläuferzellen aus dem Dottersack (YS), die das Gehirn während der embryonalen Entwicklung 1 , 2 , 3 kolonisierten. Bei Nagetieren spielt der Transkriptionsfaktor Myb eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung aller von Knochenmark abgeleiteten Monozyten und Makrophagen, aber für YS-abgeleitete Mikroglia ist dieser Faktor entbehrlich und die Differenzierung bleibt abhängig vom Transkriptionsfaktor PU.1 4 . Im gesunden ZNS sind Mikroglia dynamische Zellen, die ständig ihre Umgebung abtasten, scaNning und Vermessung zum Eindringen von Krankheitserregern oder Gewebeschäden 5 . Die Erkennung solcher Signale leitet einen Weg ein, um die Verletzung zu lösen. Die Mikroglia wechselt schnell von einer verzweigten Morphologie zu einer amöboiden, die von Phagozytose und Freisetzung verschiedener Mediatoren wie pro- oder entzündungshemmenden Zytokinen gefolgt wird. So kann abhängig von ihrer Mikroumgebung aktivierte Mikroglia ein Spektrum unterschiedlicher Priming-Zustände 6 erwerben. Die Mikroglia beeinflusst die Entwicklung und den Fortschritt vieler neurologischer Erkrankungen. Bei den Nagetiermodellen der Alzheimer-Krankheit (AD) 7 , der amyotrophischen Lateralsklerose (ALS) 8 , der Multiple Sklerose (MS) 9 oder der Parkinson-Krankheit (PD) 10 wird gezeigt , dass die Mikroglia eine doppelte Rolle spielt, die entweder eine nachteilige Neurotoxizität oder eine wirksame Wirkung hervorruft In einer neuroprotektiven Weise, die abhängig ist oN die spezifische Krankheit, das Krankheitsstadium und ob die Krankheit durch das systemische Immunabteil 7 , 8 , 9 , 10 , 11 beeinflusst wurde . Die meisten der in den oben genannten Krankheiten beobachteten ZNS-Läsionen enthalten eine heterogene Population von myeloiden Zellen, darunter nicht nur parenchymale Mikroglia, sondern auch perivaskuläre und meningeale Makrophagen sowie CNS-infiltrierende MDM. Diese Zelltypen können unterschiedlich zu den pathophysiologischen Mechanismen beitragen, die sich auf Verletzungen und Reparaturen beziehen 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . Die gegenwärtige Herausforderung für Forscher, die diese Krankheitsmodelle studieren, besteht darin, festzustellen, ob die peripheren Monozyten und Makrophagen das ZNS infiltrieren und wenn ja, in distLegen Sie die residenten Mikroglia aus diesen Zellen. In der Tat sind die Mikrogliazellen sehr plastisch; Wenn sie aktiviert sind, werden die Mikroglia-Marker, die üblicherweise durch periphere Monozyten und Makrophagen exprimiert werden, erneut exprimieren. Das Problem beruht daher auf der Identifizierung von Markern, die die residenten Mikroglia von den infiltrierenden Monozyten und Makrophagen unterscheiden können. Die Diskriminierung dieser Populationen auf Gehirnscheiben durch immunhistologische Anwendungen ist aufgrund des Fehlens spezifischer Antikörper begrenzt. Die Durchflusszytometrieanalyse ist jedoch eine effiziente Technik zur Beurteilung der Expression mehrerer Marker und zur Unterscheidung von Zellpopulationen (z. B. Lymphozyten, Makrophagen / MDM CD11b + CD45 hoch und Microglia CD11b + CD45 med ) sowie Zellsubpopulationen 16 , 17 , 18 Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Isolierung derMononukleare Zellen aus dem Maus-ZNS in neurologischen Erkrankungsmodellen unter Verwendung einer optimierten, enzymatischen Gewebe-Dissoziation und einer Dichtegradienten-Zentrifugation; Sowie ein Verfahren zur Differenzierung der Mikroglia- und MDM-Populationen im ZNS durch Durchflusszytometrie. Ein weiterer Ansatz besteht darin, das Myelin zu eliminieren und die Zellen unter Verwendung von magnetischen Perlen zu reinigen, die mit spezifischen Antikörpern 19 , 20 , 21 konjugiert sind. Die Myelinentfernung unter Verwendung von Anti-Myelin-Magnetperlen ist teurer und beeinflusst die Lebensfähigkeit und die Ausbeute an isolierten Zellen 22 . Dieser Schritt und die folgende immunomagnetische Trennung der Mikroglia, beschränken weitere Untersuchungen der spezifischen Immunzellpopulationen 21 , 22 . Diese Verfahren bieten eine einfache Möglichkeit, die Makrophagen-Subpopulationen in der Krankheitsentwicklung zu untersuchen undUm die Arzneimittelwirkungen oder Genmodifikationen auf Makrophagen-Phänotypen und Aktivierungszuständen zu bestimmen.

<table><tbody><tr><td>5 Monate alte Mäuse</td><td>Janvier</td><td>C57BL/6J</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL Research Grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401020001</td><td>Verdauungsenzym</td></tr><tr><td>Desoxyribonuklease I aus der Rinderbauchspeicheldrüse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0891-01</td><td>Dichtegradient Medium</td></tr><tr><td>Zellsiebgröße 70 & Mikro; m Nylon</td><td>Corning</td><td>731751</td><td></td></tr><tr><td>Venofix 25 G</td><td>BRAUN</td><td>4056370</td><td></td></tr><tr><td>Kolbenspritze 10 mL</td><td>Terumo</td><td>SS+10ES1</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipette 230 mm</td><td>Dustcher</td><td>20420</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.328</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Röhrchen</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Röhrchen</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Polystyrol-Rundbodenröhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1x) ohne Ca2+/Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (10x) ohne Ca2+/Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbuminlösung 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7284</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 32% Lösung</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15714-S</td><td>Vorsicht -Giftiges</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>PerCPCy5.5 Anti-Maus-CD11b (Klon M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>45-0112</td><td></td></tr><tr><td>Ratten-IgG2b K Isotypkontrolle PerCP-Cyanin5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4031</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Anti-Maus-CD45 Ratte (Klon 30-F11)</td><td>BD Biosciences</td><td>563890</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Ratte IgG2b, &kappa; Isotypkontrolle RUO</td><td>BD Biosciences</td><td>562603</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Maus TMEM119 (Klon28 - 3)</td><td>Abcam</td><td>ab209064</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 Esel Anti-Kaninchen IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD16/CD32 gereinigt</td><td>eBioscience</td><td>14-0161</td><td>Maus Fc Block</td></tr><tr><td>Fixierbare Totzellen-Färbekits</td><td>Invitrogen</td><td>L34969</td><td></td></tr><tr><td>Maus CCR2 APC-konjugierter Antikörper</td><td>R& D</td><td>FAB5538A</td><td></td></tr><tr><td>Ratte IgG2B APC-konjugierte Isotyp-Kontrolle</td><td>R& D</td><td>IC013A</td><td></td></tr><tr><td>Maus CX3CR1 PE-konjugierter Antikörper</td><td>R& D</td><td>FAB5825P</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-IgG PE-konjugierte Antikörper</td><td>R& D</td><td>IC108P</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Zellanalysator</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSVERSE</td><td></td></tr><tr><td>Datenanalysesoftware</td><td>FlowJo LLC</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Feine Schere</td><td>F.S.T</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Standard Pattern Pinzette</td><td>F.S.T</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>Mayo Schere</td><td>F.S.T</td><td>14010-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>F.S.T</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse von mikroglia und monozyten-abgeleiteten makrophagen aus dem zentralnervensystem durch durchflusszytometrie

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Zahlreiche Studien haben gezeigt, die Rolle der Immunzellen, insbesondere Makrophagen, in zentralen Zerversystem (ZNS) Pathologien. Es gibt zwei Hauptmakrophagenpopulationen im ZNS: (i) die Mikroglia, die die residenten Makrophagen des ZNS sind und von Dottersack-Progenitoren während der Embryogenese abgeleitet sind, und (ii) die Monozyten-abgeleiteten Makrophagen (MDM), die infiltrieren können Das ZNS während der Krankheit und werden aus Knochenmark-Vorläufern abgeleitet. Die Rollen jeder Makrophagen-Subpopulation unterscheiden sich je nach der untersuchten Pathologie. Darüber hinaus gibt es keinen Konsens über die histologischen Marker oder die für diese Makrophagen-Subpopulationen verwendeten Unterscheidungskriterien. Die Analyse der Expressionsprofile der CD11b- und CD45-Marker durch Durchflusszytometrie erlaubt es uns jedoch, die Mikroglia (CD11b + CD45 med ) vom MDM (CD11b + CD45 high ) zu unterscheiden. In diesem Protokoll zeigen wir, dass die DichtegradientenzentrifugationUnd die Durchflusszytometrieanalyse kann verwendet werden, um diese ZNS-Makrophagen-Subpopulationen zu charakterisieren und mehrere von diesen Zellen exprimierte Marker zu untersuchen, wie wir vor kurzem veröffentlicht haben. So kann diese Technik unser Verständnis der Rolle von Makrophagen in Mausmodellen von neurologischen Erkrankungen weitergeben und kann auch zur Bewertung von Arzneimittelwirkungen auf diese Zellen verwendet werden.

Nach der Dichtegradientenzentrifugation und Antikörperfärbung wurden die Zellen auf einem Durchflusszytometer gewonnen und unter Verwendung einer morphologischen Gating-Strategie wie folgt analysiert. Ein erstes Tor wurde im Punkt-Forward-Scattered-Area (FSC-A) gegenüber der Forward-Scattered-Height (FSC-H) definiert, um einzelne Zellen aus Dubletten zu unterscheiden ( Abbildung 3A ). Die einzelnen Zellen wurden dann auf FSC-A versus Side-S...

Dieses Protokoll liefert eine Analyse der Makrophagen-Subpopulationen in das erwachsene Maus-Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie und ist hilfreich für die Untersuchung von mehreren Markern, die von diesen Zellen exprimiert werden.

Analyse von Mikroglia und Monozyten-abgeleiteten Makrophagen aus dem Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die verschiedenen Marker zu bewerten, die von Makrophagen-Subpopulationen im zentralen Nervensystem (ZNS) exprimiert werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neuroimmunologie zu beantworten, beispielsweise, wie Makrophagen duperry sind, während wir versuchen, den ZNS bei Schwindelanfällen zu untersuchen, und welche Phänotypen ZNS-Makrophagen aufweisen. Die wichtigsten Vorteile dieser Technik sind die Isolierung einer großen Anzahl hochreiner Makrophagen-Subpopulationen sowie die Klassifizierung der Zellmarker von Makrophagen-Subpopulationen.Beginnen Sie damit, mit einer feinen Schere die Bauchhaut knapp unterhalb des Xiphoidprozesses zu schneiden, um die Brusthöhle freizulegen. Führen Sie einen Schnitt im Zwerchfell durch und schneiden Sie die seitlichen Abschnitte des Rippenbogens von kaudal nach kranial, um das Herz freizulegen. Nachdem Sie den linken Ventrikel und das rechte Atrium identifiziert haben, führen Sie einen Butterfly-Katheter mit einer 25-Gauge-Nadel in den linken Ventrikel ein.Führen Sie einen Schnitt am rechten Vorhof durch und beginnen Sie, sobald das Blut zu fließen beginnt, mit der

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Mikroglia sind Makrophagen, die die erste Linie der Verteidigung und Immunüberwachung des zentralen Nervensystems liefern. MicroRNAs sind regulatorische Moleküle, die eine wichtige Rolle spielen in vielen physiologischen Prozessen einschließlich Aktivierung und Differenzierung von Makrophagen. In diesem Artikel beschreiben wir die Methode zur Messung von Mikro-RNAs in Mikroglia.

Nachweis von microRNAs in Mikroglia durch Real-time PCR in Normal-und ZNS Während Neuroinflammation

Dieses Video zeigt die Durchflusszytometrie zur Messung der Mikrogliaaufnahme von fluoreszierenden Biopartikeln nach intravitrealer Verabreichung in einem Mausauge. Die Durchflusszytometrie weist lebende Zellen nach, die CD11b exprimieren, und unterscheidet phagozytäre Mikrogliazellen mit grüner Fluoreszenz von anderen myeloischen Zellen, einschließlich Ly6C-exprimierender Monozyten und Ly6G-exprimierender Neutrophilen.

Messung der Mikrogliaaufnahme von intravitreal abgegebenen fluoreszierenden Partikeln mittels Durchflusszytometrie

Quelle: Hidmark, A. S., et al. Analyse von Immunzellen in einzelnen Ischiasnerven und Spinalwurzelganglien von einer einzelnen Maus mittels Durchflusszytometrie. J. Vis. Exp.{{TAG_ 27}} (2017).  Dieses Video zeigt den Einsatz der Durchflusszytometrie zur Analyse von Immunzellen in Ischiasnerven der Maus und Spinalganglien (DRGs). Der Prozess umfasst die Markierung von Immunzellen mit Fluorophor- und Biotin-markierten Antikörpern, die Stabilisierung und Permeabilisierung der Zellen und die...

Analyse von Immunzellen im Nervengewebe der Maus mittels Durchflusszytometrie

Mikroglia Phagozytose ist von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Homöostase von Gewebe und unzureichende phagozytischen Funktion hat in der Pathologie in Verbindung gebracht. Allerdings ist die Bewertung Mikroglia - Funktion in vivo technisch anspruchsvoll . Wir haben eine einfache, aber robuste Technik für die präzise Überwachung entwickelt und die phagozytische Potenzial von Mikroglia in einer physiologischen Umgebung zu quantifizieren.

Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion<em&gt; In Vivo</em&gt; Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay

Quantitative Analyse des Zelleninhalts innerhalb der murinen Ischiasnerv wird erschwert durch die Knappheit des Gewebes. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die Gewebe-Verdauung und Vorbereitung, die genügende Zellen für Flow-Zytometrie Analyse Immunzelle Populationen von Nerven der einzelnen Mäusen versorgt.

Analyse von Immunzellen in einzelnen Ischias Nerven und Dorsal Root Ganglion aus einem einzigen Mausklick mit Durchflusszytometrie

Ein Protokoll für die Isolierung von primären Mikroglia aus murine Gehirn wird vorgestellt. Diese Technik hilft bei der Förderung des gegenwärtigen Verständnis von neurologischen Erkrankungen. Dichte-Gradienten-Zentrifugierung und magnetische Trennung werden kombiniert, um genügend Ertrag einer hochreinen Probe zu produzieren. Darüber hinaus erläutern wir die Schritte zur Charakterisierung der Mikroglia.

Charakterisierung und Isolierung der Maus primären Mikroglia durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

Hier stellen wir zwei Protokolle zur Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von vGLUT1-positiven Synapsen und pHRodo Red markierten rohen Synaptosomen mittels Durchflusszytometrie vor.

Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von synaptischem Material mittels Durchflusszytometrie

Die Identifizierung von Mikroglia (MG) und peripheren infiltrierenden Makrophagen (Mø) im verletzten Rückenmark ist schwierig. In diesem Protokoll wurde die Durchflusszytometrie (FCM) verwendet, um M1-like MG, M2-like MG, M1-like Mø bzw. M2-like Mø zu identifizieren. Diese Technologie kann auch auf andere Erkrankungen des Zentralnervensystems angewendet werden, um die Rolle von MG und Mø zu verstehen.

Identifizierung von Mikroglia und peripher infiltrierenden Makrophagen im verletzten Rückenmark mittels Durchflusszytometrie

Hier stellen wir ein Protokoll zur Beurteilung der Immunzellfunktion nach ischämischem Schlaganfall mittels durchflusszytometrischer Analyse in einem Mini-Schlaganfallmodell vor. Diese Methode ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der neuroimmunen Interaktionen und kann für die Untersuchung anderer neurodegenerativer Erkrankungen angepasst werden, um unser Verständnis der Immunantworten in der Schlaganfallpathologie zu verbessern.

Isolierung und durchflusszytometrische Bewertung neuroimmuner Interaktionen in einem Mini-Schlaganfall-Mausmodell

Dieses Protokoll kombiniert Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung, um Mikrogliazellzustände im Kleinhirn von frühen postnatalen Mäusegehirnen zu isolieren und zu charakterisieren. Es verwendet enzymatische Dissoziation, Percoll-Zentrifugation und Immunfärbung, um die Heterogenität der Mikroglia aufzudecken und das Verständnis ihrer Rolle bei der Kleinhirnentwicklung und -erkrankung zu verbessern.

Durchflusszytometrie und Einzelzellanalyse zur Charakterisierung der Mikroglia-Aktivierung in der frühen postnatalen Entwicklung des Gehirns von Mäusen

Lernen Sie die Analyse von Mikroglia und monozytenabgeleiteten Makrophagen im ZNS durch Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung spezifischer Zellmarker in der Neuroimmunologie.

Analyse von Mikroglia und Monozyten-abgeleiteten Makrophagen aus dem Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie

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