Analyse von Mikroglia und Monozyten-abgeleiteten Makrophagen aus dem Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die verschiedenen Marker zu bewerten, die von Makrophagen-Subpopulationen innerhalb des Zentralnervensystems (ZNS) exprimiert werden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neuroimmunologie zu beantworten, wie z. B. Duperry-Makrophagen, wenn wir versuchen, ZNS bei Schwindel zu bekämpfen, und welche Phänotypen von ZNS bei Makrophagen auftreten. Die Hauptvorteile dieser Technik sind die Isolierung einer großen Anzahl von hochgereinigten Makrophagen-Subpopulationen sowie eine Kontaminierung von Makrophagen-Subpopulationszellmarkern.

Beginnen Sie damit, mit einer feinen Schere die ventrale Haut direkt unter dem Xiphoid-Prozess zu schneiden, um die Brusthöhle freizulegen. Machen Sie einen Schnitt in das Zwerchfell und schneiden Sie die seitlichen Aspekte des Brustkorbs in kaudaler bis rostraler Richtung, um das Herz freizulegen. Nachdem Sie den linken Ventrikel und den rechten Vorhof identifiziert haben, führen Sie einen Schmetterlingskatheter mit einer 25-Gauge-Nadel in den linken Ventrikel ein.

Machen Sie einen Schnitt am rechten Vorhof und beginnen Sie, 20 Milliliter PBS mit einer Geschwindigkeit von zehn Millilitern pro Minute durch den Katheter zu verabreichen, sobald das Blut zu fließen beginnt. Eine erfolgreiche Profusion wird durch ein Blanchieren der Lunge und der Leber angezeigt, wenn das Blut verdrängt wird. Als nächstes präparierst du mit einer feinen Schere die Wirbelsäule.

Herausschneiden der Bauchwandmuskulatur auf der ventralen Seite der Wirbelsäule und Durchtrennen der Wirbelsäule an der Basis des Schwanzes, um die Wirbelsäule bei der Entnahme zu entfernen. Führen Sie eine Zehn-Milliliter-Spritze PBS mit einer modifizierten 200-Mikroliter-Pipettenspitze in die Lendenwirbelsäule ein. Spülen Sie dann das Rückenmark auf der zervikalen Seite.

Entferne die Haut über dem Schädel und führe eine Spitze der Schere an der Schädelbasis ein. Schneiden Sie den Schädel nach der sagittalen Naht ab. Führen Sie dann eine kleine Pinzette in den Schnitt ein und entfernen Sie vorsichtig die Oberseite des Schädels.

Präparieren Sie das Gehirn vom Mäusekopf und entfernen Sie den Riechkolben und das Kleinhirn. Legen Sie dann das Gehirn und das Rückenmark in ein Ein-Punkt-Fünf-Liter-Röhrchen, das einen Punkt eins, zwei, acht Milliliter Verdauungscocktail enthält. Um die Zellen zu dissoziieren, schneidet man mit einer kleinen Schere das Gehirn und das Rückenmark fein in ein bis zwei Kubikmillimeter große Stücke und legt die Stücke 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid ab.

Am Ende der Inkubation stoppen Sie den Aufschluss mit 20 Mikrolitern nullkomma-fünfmolarem EDTA, gefolgt von einer sanften Verreibung mit einer Fünf-Milliliter-Pipette. Filtern Sie die resultierende Zellsuspension durch ein 70-Mikron-Netzsieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, indem Sie den Kolben einer Zehn-Milliliter-Spritze verwenden, um das verbleibende Gehirn- oder Rückenmarksgewebe sanft zu mazerieren. Spülen Sie das Sieb mit 20 Millilitern fünf Prozent FBS und PBS.

Und sammeln Sie die gefilterten Zellen durch Zentrifugation. Saugen Sie dann den Überstand vorsichtig an, ohne das Pellet zu stören. Für die Dichtegradiententrennung der Zellen suspendierten wir das Pellet mit vier Millilitern 30 Prozent Dichtegradientenmedium und überführten die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Legen Sie vorsichtig vier Milliliter Medium mit einem Dichtegradienten von 37 Prozent, gefolgt von vier Millilitern eines Mediums mit einem Dichtegradienten von 70 Prozent unter das Medium mit einem Dichtegradienten von 37 Prozent. Übertragen Sie das Röhrchen in eine Tischzentrifuge, um die Zellen zu trennen. Die Mikroglia- und Makrophagenzellen befinden sich an der Schnittstelle der Gradientenschichten mit 70 und 37 Prozent Dichte.

Die Röhre wird geschichtet angezeigt. Nachdem Sie die obere Myelinschicht vorsichtig entfernt haben, übertragen Sie drei bis vier Milliliter der Mikroglia-Makrophagen-Interphasenschicht in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie dann die Immunzellen mit drei Zentrifugen in 15 Millilitern PBS und suspendieren Sie das Pellet nach der letzten Wäsche wieder in einem Milliliter PBS.

Um die Markerexpression der Makrophagen-Subpopulation zu beurteilen, werden die Zellen in ein Fünf-Milliliter-Durchflusszytometrie-Analyseröhrchen überführt, gefolgt von der Zugabe von einem Mikroliter eines fixierbaren Reagenzes für tote Zellen. Waschen Sie die Proben nach 30 Minuten auf Eis lichtgeschützt in zwei Millilitern PBS und suspendieren Sie das Pellet in 400 Mikrolitern Faxpuffer pro experimentellem Analyseröhrchen. Teilen Sie die Zellen in die entsprechende Anzahl von fünf Millilitern Durchflusszytometrie-Analyseröhrchen auf.

Blockieren Sie dann die unspezifische Bindung des FC-Rezeptors mit einem Mikrogramm CD 16 CD 32 blockierendem Antikörpercocktail pro 100 Mikroliter Zellen für eine 10- bis 15-minütige Inkubation auf Eis, geschützt vor Licht. Als nächstes markieren Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern der entsprechenden Primärantikörper für eine 30-minütige Inkubation auf Eis, geschützt vor Licht. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation viermal in zwei Millilitern PBS.

Dann fügen Sie 100 Mikroliter der entsprechenden Sekundärantikörper für 30 Minuten auf Eis lichtgeschützt hinzu, gefolgt von vier Waschgängen in PBS, wie gerade gezeigt. Nach der letzten Wäsche die Pellets 15 Minuten lang bei Raumtemperatur vorsichtig und lichtgeschützt in 100 Mikrolitern einem Prozent Paraformaldehyd wieder suspendieren. Waschen Sie dann die Zellen viermal in PBS.

Suspendieren Sie die endgültigen Pellets wieder in 200 Mikrolitern frischem PBS und analysieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie. Aus Gehirn und Rückenmark stammende Mikroglia und Monozyten-abgeleitete Makrophagen werden anhand ihrer CD 11 B- und CD 45-Expression identifiziert. Die Expression von CX3CR1 und Tmem119 durch die CD 11 B positiven CD 45 Medium Mikrogliazellen ermöglicht eine weitere Unterscheidung dieser Zellpopulation von den CD 11 C positiven CD 45 High Monozyten abgeleiteten Makrophagen, die keinen dieser Marker, aber CCR2 exprimieren.

Nach der Trennung durch den Dichtegradienten sind 85 bis 95 Prozent der Zellen noch lebensfähig. In Ermangelung einer Isolierung durch den Dichtegradienten sind die Makrophagen-Subpopulationen in einem vorwärts gerichteten biseitigen Streudiagramm nicht identifizierbar, da Nicht-Makrophagenzellen und Myelintrümmer vorhanden sind. Da das Epitop, das vom Anti-Tmem119-Antikörper erkannt wird, intrazellulär ist, ist eine Permeabilisierung für die Markierung dieses wichtigen Mikrogliazellmarkers erforderlich.

Es ist jedoch zu beachten, dass die Permeabilisierung eine Zellschrumpfung induziert, wodurch die Makrophagen-Subpopulationen durch die Vorwärts- und Seitenstreuanalyse kleiner erscheinen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Obwohl ich dieses Verfahren ausprobiert habe, ist es wichtig, daran zu denken, die Dichteabstufung sehr sorgfältig einzurichten.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. quantitative rt-PCR, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Signalwegen der Makrophagen-Subpopulationen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher im Bereich der Neurowissenschaften, um die Aktivierung der Makrophagen-Subpopulation im Mausmodell für neurologische Erkrankungen zu erforschen. Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie entweder Tests durchführen oder dieser Tradition als Makrophagen-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie folgen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung einer Haube getroffen werden sollten.