Quantifizierung der Verzweigungsdichte in Ratten-Mamma-Gland-Vollkonserven unter Verwendung der Sholl-Analysemethode
12. Juli 2017
Die Brustdrüsenentwicklung im Nagetier wurde typischerweise mit deskriptiven Beurteilungen oder durch Messung von physikalischen Grundattributen ausgewertet. Die Verzweigungsdichte ist ein Indikator für die Entwicklung von Mamma, der objektiv schwer zu quantifizieren ist. Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode für die quantitative Beurteilung der Mamma-Drüsen-Verzweigungseigenschaften.
Das übergeordnete Ziel dieser computergestützten Methode ist es, die Verzweigungsdichte und den Verzweigungszerfall der Brustdrüse, zwei wichtige Entwicklungsindikatoren bei Nagetieren, objektiv zu quantifizieren, indem eine modifizierte Sholl-Analyse auf Ganzbettbilder der Brustdrüse angewendet wird. Diese Methode kann helfen, Fragen auf dem Gebiet der Brustdrüsenbiologie zu beantworten, z. B. wie chemische Expositionen die Entwicklung der Brustdrüsen verändern können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Open-Source-Software verwendet, um grundlegende Merkmale der Brustdrüsenentwicklung objektiv zu quantifizieren.
Für dieses Verfahren haben Sie Bilder von ganzen Montierungen, die das Drüsenepithel in einer festen Vergrößerung zeigen. Öffnen Sie zunächst ein Bild in ImageJ. Wählen Sie als Nächstes das Freihandwerkzeug aus.
Zeichnen Sie um das Drüsenepithel herum und reinigen Sie die Umgebung. Zeichnen Sie dann den Lymphknoten nach und entfernen Sie diesen Teil des Bildes mit dem Befehl Ausschneiden. Wenn der Hintergrund des Bildes schwarz ist, muss er in Weiß umgewandelt werden.
Klicken Sie auf "Bearbeiten", dann auf "Optionen" und dann auf "Farben". Wählen Sie im Dialogfeld Weiß aus dem Dropdown-Menü der Hintergrundoptionen aus. Obwohl der Hintergrund schwarz bleiben kann, wird er bei der Verarbeitung des Bildes als weiß behandelt.
Teilen Sie nun die Farbkanäle in drei Acht-Bit-Graustufenbilder auf. Wählen Sie dann den Kanal mit dem besten Kontrast aus, in der Regel der blaue Kanal. Subtrahieren Sie nun den Hintergrund vom ausgewählten Farbkanal.
Fahren Sie dann mit der Auswahl der gewünschten Parameter und der Vorschau der Änderungen fort. Aktivieren Sie den hellen Hintergrund und die Vorschau im Dialogfeld und passen Sie dann die Anzahl der Pixel an, bis der gewünschte Kontrast erreicht ist. Wenn zusätzlicher Kontrast benötigt wird, verwenden Sie die Option Unscharf maskieren.
Aktivieren Sie im Dialogfeld die Option Vorschau und passen Sie den Pixelradius und die Maskenstärke an, bis der gewünschte Kontrast erreicht ist. Entfernen Sie nach dem Anwenden des Filters "Unscharf maskieren" den Rahmen, der durch den Filter erstellt wurde. Klicken Sie auf die Schaltfläche mit dem doppelten roten Pfeil in der Symbolleiste und wählen Sie Zeichenwerkzeuge.
Wählen Sie dann das Radiergummi-Werkzeug aus. Passen Sie den Durchmesser an, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Schaltfläche des Radiergummi-Werkzeugs klicken und dann die linke Maustaste gedrückt halten, um den Rand zu löschen. Beim Löschen ist nur eine Stufe von Rückgängig erlaubt, seien Sie also vorsichtig.
Nachdem Sie einen der Filter angewendet haben, entfernen Sie das verbleibende Rauschen manuell. Beziehen Sie sich auf eine Kopie des Originalbildes und entfernen Sie identifiziertes Rauschen, indem Sie zuerst auf die Schaltfläche mit dem doppelten roten Pfeil in der Symbolleiste klicken und die Zeichenwerkzeuge auswählen. Wählen Sie dann das Radiergummi-Werkzeug.
Passen Sie den Durchmesser an, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Schaltfläche des Radiergummi-Werkzeugs klicken. Halten Sie dann die linke Maustaste gedrückt, um das Rauschen zu löschen. Beim Löschen ist nur eine Stufe des Rückgängigmachens erlaubt, seien Sie also vorsichtig.
Passen Sie als Nächstes den Bildschwellenwert an. Verschieben Sie die Schieberegler, um die minimalen und maximalen Schwellenwerte anzupassen und das Bild der Drüse zu verbessern. Klicken Sie dann auf Übernehmen.
Entfernen Sie zusätzliches Rauschen automatisch mit einer von zwei Methoden. Die erste Möglichkeit besteht darin, den Befehl despeckle zu verwenden. Die zweite Option besteht darin, den Befehl Ausreißer entfernen zu verwenden.
Bei diesem Vorgang wird ein Pixel nur dann durch den Median seiner unmittelbaren Umgebung ersetzt, wenn das Pixel um mehr als einen benutzerdefinierten Schwellenwert vom Median abweicht. Rekonstruieren Sie nun unter Verwendung des Originalbildes zum Vergleich Teile des Drüsenepithels, die durch Thresholding und Rauschentfernung entfernt wurden. Achten Sie bei der Rekonstruktion des Bildes darauf, dies sorgfältig und auf minimaler Basis zu tun, um die Integrität des Bildes zu wahren.
Wählen Sie das Spraydosenwerkzeug aus den Zeichenwerkzeugen aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Werkzeugtaste der Spraydose, um die Werkzeuggröße anzupassen, und füllen Sie dann die fehlenden Abschnitte der Drüse vorsichtig mit der linken Maustaste aus. Erstellen Sie als Nächstes ein skelettiertes Bild der Drüse für die Sholl-Analyse.
Legen Sie zunächst das Bild in ein Binärformat um. Skelettieren Sie dann das Bild. Dadurch werden wiederholt Pixel von den Rändern des Binärbilds entfernt, bis es auf eine einzelne pixelbreite Form reduziert wird.
Erweitern Sie nun das Bild einmal, um die Lücken zu schließen, die durch Schwellenwerte und Skelettierung entstehen. Speichern Sie dann das Bild mit dem Befehl Speichern unter als neue Datei. Überprüfen Sie abschließend die Genauigkeit des Skelettbilds im Vergleich zum Original, indem Sie die beiden Bilder überlagern.
Wählen Sie im Dialogfeld "Bild hinzufügen" das Skelettbild aus und legen Sie die Deckkraft auf 30 % fest. Speichern Sie dann das Overlay als neues Bild zum späteren Nachschlagen. Öffnen Sie zunächst ein Skelettbild, und konvertieren Sie das Bild in ein Binärformat. Definieren Sie nun den Bildmaßstab.
Geben Sie die Anzahl der Pixel pro Millimeter ein, legen Sie dann sowohl den bekannten Abstand als auch das Pixel-Seitenverhältnis auf eins fest, geben Sie dann Millimeter als Längeneinheit ein und schalten Sie die globale Option um, um die Skala auf alle Bilder anzuwenden. Bestimmen Sie als Nächstes den Endradius für die Sholl-Analyse mit dem Linienzeichnungswerkzeug. Ziehe eine Linie vom Anfang des Primärgangs bis zum distalsten Punkt des Drüsenepithels.
Drücken Sie dann die M-Taste und der Abstand der Linie wird angezeigt. Geben Sie nun die Einstellungen für die Sholl-Analyse ein. Wählen Sie zunächst Optionen im Abschnitt Definition der Schalen aus, legen Sie den Startradius auf 0,00 Millimeter und die Schrittweite des Radius auf 0,1 Millimeter fest.
Legen Sie die Anzahl der Samples auf eins fest. Die Länge der soeben gezeichneten Linie wird automatisch in das Feld für den Endradius eingetragen. Wählen Sie für die Optionen für mehrere Stichproben pro Radius den Mittelwert für die Integration aus.
Legen Sie für die Optionen für Deskriptoren und gekrümmte Formteile den Grenzwert für den Umschließungsradius auf eins fest. Wählen Sie für die Anzahl der primären Zweige die Option Vom Startradius ableiten aus, und wählen Sie die Optionen für den linearen und den am besten passenden Grad aus. Wählen Sie dann unter Profile ohne Normalisierung die Option Am informativsten aus.
Wählen Sie nun im Abschnitt sholl-Methoden die Option Bereich für normalisiertes Profil aus. Wählen Sie abschließend im Ausgabebereich die Option Schnittpunktmaske erstellen aus, um eine Heatmap der Schnittpunkte zu erstellen. Öffnen Sie nun ein Vorschaufenster des Bildes mit Ringen und bestätigen Sie den Analysebereich.
Wenn alles in Ordnung ist, klicken Sie auf OK, um die Analyse auszuführen. Beim Ausführen der Analyse werden ein lineares Fenster mit Sholl-Profil, ein Halbprotokollfenster mit Sholl-Profil, ein Fenster mit Sholl-Ergebnissen, das alle Sholl-Ausgabewerte enthält, und ein Fenster mit dem Dateinamen sholl-Profile, in dem die Anzahl der Schnittpunkte in jedem Radius angegeben wird, die durch das Polynom bestimmt wird. Um die MEA zu messen, gehen Sie von dem Skelettbild der Drüse in ImageJ aus.
Öffnen Sie das Polygonwerkzeug und zeichnen Sie ein Polygon um den Umfang der Drüse. Verwenden Sie Mausklicks, um Liniensegmente hinzuzufügen. Wenn die gesamte Epithelfläche umgangen wurde, doppelklicken Sie, um das Polygon zu schließen.
Drücken Sie dann die M-Taste, um ein Ergebnisfenster zu öffnen. Der Wert in der Spalte Fläche entspricht dem MEA. Wenn das Drüsenepithel über den Lymphknoten hinaus ausgedehnt ist, subtrahieren Sie bei der Berechnung der Verzweigungsdichte den Lymphknotenbereich von der MEA.
Der Lymphknotenbereich kann auf die gleiche Weise wie die MEA gemessen werden. Mit den beschriebenen Methoden wurden zwei altersangepasste Gruppen von Ratten analysiert. Die Tiere der Gruppe B wurden mit einer Chemikalie behandelt, von der bekannt ist, dass sie eine vorzeitige Entwicklung der Brustdrüsen verursacht.
Das Plotten der Anzahl der Verzweigungsschnittpunkte entlang des Radius von der Verschraubung aus veranschaulicht die Variation in den Ergebnissen. Die Ergebnisse der Sholl-Analyse zeigten einen deutlichen Unterschied in der mittleren Anzahl der Schnittmengen zwischen den Gruppen. Die Schnittdaten müssen jedoch auf den Bereich der Brustdrüse normalisiert werden, um Schlussfolgerungen ziehen zu können.
Die Sholl-Analyse und die Messung der Epithelfläche der Brustdrüse liefern zwei physiologische Parameter, die für eine vergleichende Analyse nützlich sind. Offensichtlich war die Größe der Drüsen in der Behandlungsgruppe viel größer. Die Sholl-Analyse gibt den Wert für Summe N zurück, der für die Berechnung der Verzweigungsdichte und des Werts für k verwendet wird.
In der Behandlungsgruppe deuten die höhere mittlere Verzweigungsdichte und der niedrigere Mittelwert k, der eine geringere Verzweigungszerfallsrate widerspiegelt, darauf hin, dass die behandelten Tiere besser entwickelte Drüsen hatten als die unbehandelten Tiere. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Beseitigung von Geräuschen der wichtigste Schritt ist. Wenn Sie zu viel oder zu wenig entfernen, kann dies die Integrität der Drüse stören und die Ergebnisse verzerren.
Wenn Sie diese Methode anwenden, ist es wichtig, mit einem ganzen Hügel der Ristin-Brust zu beginnen. Ein genaues skelettiertes Bild kann nicht erhalten werden, wenn Unvollkommenheiten wie Risse oder Falten vorhanden sind. Das Erstellen eines akkuraten skelettierten Bildes erfordert Geduld und Übung.
Einmal gemeistert, kann diese Technik in 15 bis 20 Minuten pro analysierter Drüse durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine computerunterstützte Methode zur quantitativen Beurteilung der Verzweigungsdichte und des Abbaus der Milchdrüse bei Nagetieren. Durch die Anwendung einer modifizierten Sholl-Analyse an Ganzpräparat-Aufnahmen können Forscher die Entwicklung der Milchdrüse objektiv bewerten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mammadrüsenbiologie
- Entwicklungsbiologie
- Quantitative Analyse
Hintergrund
- Die Entwicklung der Mammar drüse ist entscheidend für das Verständnis verschiedener biologischer Prozesse.
- Herkömmliche Bewertungsmethoden sind oft subjektiv und ungenau.
- Die Verzweigungsdichte ist ein wichtiger Indikator für die Entwicklung der Brustdrüse.
- Eine objektive Quantifizierung kann die Forschungsergebnisse verbessern.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Quantifizierung der Verzweigungsmerkmale der Mammarorgane bereitzustellen.
- Die Auswirkungen chemischer Expositionen auf die Entwicklung der Mammarorgane zu bewerten.
- Die Genauigkeit der Beurteilung von Mammarorganen in der Forschung zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Nutzung der ImageJ-Software zur Bildanalyse.
- Anwendung einer modifizierten Sholl-Analyse auf Ganzpräparat-Bilder.
- Auswahl des drüsenförmigen Epithels bei fester Vergrößerung.
- Objektive Quantifizierung der Verzweigungsdichte und -abnahme.
Hauptergebnisse
- Entwicklung einer standardisierten Methode zur Analyse der Mammaparenchymentwicklung.
- Nachweis der Zuverlässigkeit und Objektivität der Methode.
- Möglichkeit, Erkenntnisse über die Auswirkungen umweltbedingter Faktoren auf die Brustentwicklung zu gewinnen.
- Erleichterung weiterer Forschungsarbeiten in der Biologie der Mammaparenchymentwicklung.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet einen robusten Rahmen für die Untersuchung der Entwicklung der Mammaparenchyme.
- Open-Source-Software verbessert den Zugang für Forschende.
- Eine objektive Quantifizierung kann zu genaueren wissenschaftlichen Schlussfolgerungen führen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die Quantifizierung der Verzweigungsdichte der Brustdrüse liefert eine objektive, standardisierte Metrik zur Beurteilung der entwicklungstoxikologischen Wirkung in präklinischen Sicherheitsstudien. Diese Methode unterstützt die mechanistische Risikominderung, indem sie eine reproduzierbare, quantitative Bewertung der Wirkung von Chemikalien auf die drüsenförmige Architektur ermöglicht. Sie erhöht das Vorhersagevertrauen in Bezug auf Zielvalidierungspfade, die mit hormoneller und entwicklungsbedingter Signalübertragung zusammenhängen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, die an Signalwege der Brustdrüsenentwicklung anknüpfen.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch funktionelle Zielstrukturvalidierung in Nagetiermodellen.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Selektion von Wirkstoffkandidaten, indem die Verzweigungsdichte als Biomarker für Entwicklungsstörungen quantifiziert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Wirkstoff-Screening-Workflows vor.
- Reproduzierbarkeit: Gewährleistet die Standardisierung von Assays durch objektive, softwarebasierte Quantifizierung.
- Skalierbarkeit: Unterstreicht das Wiederverwendungspotenzial der Plattform durch die Open-Source-Implementierung in ImageJ.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckungsergebnisse mit präklinischer Validierung durch krankheitsrelevante morphometrische Analyse.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Konzentriert sich auf den Vorhersagewert, indem strukturelle Veränderungen mit funktionellen Ergebnissen verknüpft werden.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Unterstützt Fortschrittskriterien basierend auf quantitativen Metriken für verzweigte Abbauprozesse und Dichte.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Testung der Zielhypothese über die Identifizierung von Leitstrukturen bis hin zur präklinischen Sicherheitsbewertung und liefert in jeder Phase quantitative morphometrische Daten.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen und die biologische Risikominderung durch objektive Quantifizierung der drüsenförmigen Architektur.
- Screening: Stellt Bereitschaft für Assays sicher, indem standardisierte und reproduzierbare Ergebnisse der Bildanalyse bereitgestellt werden.
- Analytik: Erzeugt quantitative Messgrößen (Sum N, k, MEA), die einen Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen und eine statistische Auswertung ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität durch modellhafte Untersuchung krankheitsrelevanter Systeme in den Milchdrüsen von Nagetieren.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Positioniert die Methode als wiederverwendbare Fähigkeit innerhalb von Toxikologie- und Endokrindisruptions-Screening-Programmen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung und Verringerung mechanistischer Unschärfen bei der Bewertung entwicklungstoxikologischer Wirkungen.
- Operativer Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit zwischen Laboratorien mithilfe quelloffener Werkzeuge.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen, effizienterer Kapitaleinsatz und geringeres biologisches Risiko in späteren Stadien beim Sicherheits-Profiling.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Weiterentwicklungsentscheidungen basierend auf quantifizierbaren Verzweigungsphänotypen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der histologischen Ganzpräparat-Herstellung und der Bildanalyse.
- Benötigt die ImageJ-Software und kompatible Plugins zur Durchführung der Sholl-Analyse.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Bildaufnahme, Schwellenwertbestimmung und Skelettierung voraus.
- Erfordert Anpassungen bei verschiedenen Modellsystemen, insbesondere hinsichtlich der Drüsenmorphologie und der Färbebeständigkeit.
- Zu den praktischen Einschränkungen zählen die Empfindlichkeit gegenüber Bildqualität, Rauschen und Artefakten, die die Integrität der Skelettierung beeinträchtigen können.
