Quantifizierung der Verzweigungsdichte in Ratten-Mamma-Gland-Vollkonserven unter Verwendung der Sholl-Analysemethode

Das übergeordnete Ziel dieser computergestützten Methode besteht darin, die Verzweigungsdichte und den Verzweigungsverfall der Brustdrüse – zwei wichtige Entwicklungsindikatoren bei Nagetieren – objektiv zu quantifizieren, indem eine modifizierte Sholl-Analyse auf Ganzpräparat-Aufnahmen der Brustdrüse angewendet wird. Diese Methode kann dazu beitragen, offene Fragen im Bereich der Brustdrüsenbiologie zu beantworten, beispielsweise wie chemische Expositionen die Entwicklung der Brustdrüse beeinflussen können. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie Open-Source-Software verwendet, um grundlegende Merkmale der Brustdrüsenentwicklung objektiv zu quantifizieren.

Verwenden Sie für dieses Verfahren Bilder von Ganzpräparaten, die das drüsenförmige Epithel bei einer festen Vergrößerung zeigen. Öffnen Sie zunächst ein Bild in ImageJ. Wählen Sie anschließend das Freihand-Werkzeug aus.

Umranden Sie das drüsenförmige Epithel und löschen Sie den umgebenden Bereich. Umranden Sie anschließend den Lymphknoten und entfernen Sie diesen Bildteil mit dem Ausschneidebefehl. Falls der Hintergrund des Bildes schwarz ist, muss dieser in weiß umgewandelt werden.

Klicken Sie auf Bearbeiten, dann auf Optionen und anschließend auf Farben. Wählen Sie im Dialogfeld im Dropdown-Menü der Hintergrundoptionen die Farbe Weiß aus. Obwohl der Hintergrund möglicherweise schwarz bleibt, wird er beim Verarbeiten des Bildes als Weiß behandelt.

Trennen Sie nun die Farbkanäle in drei achtbitige Graustufenbilder auf. Wählen Sie anschließend den Kanal mit dem besten Kontrast aus, in der Regel der Blaukanal. Subtrahieren Sie nun den Hintergrund vom ausgewählten Farbkanal.

Danach die gewünschten Parameter auswählen und die Änderungen in der Vorschau anzeigen lassen. Im Dialogfeld Hintergrund beleuchten auswählen und in der Vorschau anzeigen, dann die Anzahl der Pixel so lange anpassen, bis der gewünschte Kontrast erreicht ist. Falls zusätzlicher Kontrast erforderlich ist, die Option Unscharf-Maskierung verwenden.

Überprüfen Sie die Vorschau im Dialogfeld und passen Sie den Pixelradius und das Maskengewicht an, bis der gewünschte Kontrast erreicht ist. Nachdem Sie den Unscharf-Maskierungs-Filter angewendet haben, entfernen Sie den durch den Filter erzeugten Rand. Klicken Sie auf die doppelte rote Pfeilschaltfläche in der Symbolleiste und wählen Sie Zeichenwerkzeuge aus.

Wählen Sie dann das Radierwerkzeug aus. Passen Sie dessen Durchmesser an, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Schaltfläche des Radierwerkzeugs klicken, und halten Sie die linke Maustaste gedrückt, um den Rand zu entfernen. Beim Radieren ist nur ein einziger Schritt rückgängig machbar, daher seien Sie vorsichtig.

Nachdem Sie einen der Filter angewendet haben, entfernen Sie das verbleibende Rauschen manuell. Ziehen Sie eine Kopie des Originalbilds heran und entfernen Sie das identifizierte Rauschen, indem Sie zunächst auf die Schaltfläche mit dem doppelten roten Pfeil in der Symbolleiste klicken und dann die Zeichenwerkzeuge auswählen. Wählen Sie anschließend das Radiergummi-Werkzeug.

Passen Sie den Durchmesser an, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Radiergummi-Werkzeug-Schaltfläche klicken. Halten Sie dann die linke Maustaste gedrückt, um Rauschen zu entfernen. Beim Radieren ist nur ein einziger Schritt rückgängig machbar, seien Sie daher vorsichtig.

Als Nächstes passen Sie die Bildschwelle an. Verschieben Sie die Schieberegler, um die minimalen und maximalen Schwellenwerte anzupassen und das Bild der Drüse zu verbessern. Klicken Sie dann auf Übernehmen.

Entfernen Sie zusätzlichen Rauschen automatisch mithilfe einer der beiden Methoden. Die erste Option ist der Einsatz des „despeckle“-Befehls. Die zweite Option ist die Verwendung des „remove outliers“-Befehls.

Dieser Prozess ersetzt einen Pixel nur dann durch den Median seiner unmittelbaren Umgebung, wenn der Pixel um mehr als einen benutzerdefinierten Schwellenwert vom Median abweicht. Rekonstruieren Sie nun unter Verwendung des ursprünglichen Bildes im Vergleich Bereiche des drüsigen Epithels, die durch Schwellenwertbildung und Rauschentfernung entfernt wurden. Achten Sie bei der Rekonstruktion des Bildes darauf, dies sorgfältig und in minimalem Umfang durchzuführen, um die Bildintegrität zu bewahren.

Wählen Sie das Sprühdosen-Werkzeug aus den Zeichenwerkzeugen aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Schaltfläche des Sprühdosen-Werkzeugs, um die Größe des Werkzeugs anzupassen, und füllen Sie anschließend vorsichtig mit der linken Maustaste die fehlenden Bereiche der Drüse aus. Erstellen Sie danach ein skelettiertes Bild der Drüse für die Sholl-Analyse.

Zuerst bringen Sie das Bild in ein binäres Format. Anschließend skelettieren Sie das Bild. Dabei werden wiederholt Pixel von den Rändern des binären Bildes entfernt, bis es auf eine form reduziert ist, die nur einen Pixel breit ist.

Vergrößern Sie nun das Bild einmal, um die durch Schwellenwertbildung und Skelettierung entstandenen Lücken zu schließen. Speichern Sie anschließend das Bild als neue Datei mit dem Befehl „Speichern unter“. Überprüfen Sie abschließend die Genauigkeit des Skelettbildes im Vergleich zum Original, indem Sie die beiden Bilder überlagern.

Wählen Sie im Dialogfeld „Bild hinzufügen“ das Skelettbild aus und stellen Sie die Deckkraft auf 30 % ein. Speichern Sie dann die Überlagerung als neues Bild für die spätere Verwendung. Öffnen Sie zunächst ein Skelettbild und konvertieren Sie das Bild in ein binäres Format. Definieren Sie nun den Bildmaßstab.

Geben Sie die Anzahl der Pixel pro Millimeter ein, stellen Sie dann sowohl die bekannte Distanz als auch das Pixel-Seitenverhältnis auf eins ein, geben Sie Millimeter als Längeneinheit ein und aktivieren Sie die globale Option, um den Maßstab auf alle Bilder anzuwenden. Bestimmen Sie anschließend den Endradius für die Sholl-Analyse mithilfe des Linienzeichnungswerkzeugs. Zeichnen Sie eine Linie vom Anfang des primären Gangs bis zum am weitesten entfernten Punkt des drüsenförmigen Epithels.

Dann drücken Sie die Taste M, und der Abstand der Linie wird angezeigt. Geben Sie nun die Einstellungen für die Sholl-Analyse ein. Wählen Sie zunächst die Optionen im Abschnitt „Definition der Schalen“ aus, setzen Sie den Startradius auf 0,00 Millimeter und die Schrittweite des Radius auf 0,1 Millimeter.

Stellen Sie die Anzahl der Proben auf eins ein. Die Länge der gerade gezeichneten Linie wird automatisch im Feld Endradius eingetragen. Wählen Sie bei der Option mehrere Proben pro Radius den Mittelwert für die Integration.

Legen Sie für die Deskriptoren und die Optionen zur gekrümmten Anpassung die Grenze für den umschließenden Radius auf eins fest. Wählen Sie bei der Anzahl der primären Äste „aus Startradius ableiten“ und aktivieren Sie die Optionen für lineare und beste Anpassung. Wählen Sie anschließend unter Profilen ohne Normalisierung „informativste“ aus.

Wählen Sie nun im Abschnitt „Sholl-Methoden“ die Fläche für das normalisierte Profil. Zuletzt aktivieren Sie im Ausgabebereich die Option „Erzeuge Schnittmasken“, um eine Wärmekarte der Schnittpunkte zu erstellen. Öffnen Sie nun ein Vorschaufenster des Bildes mit den Ringen und bestätigen Sie den Analysebereich.

Wenn alles in Ordnung aussieht, klicken Sie auf „Okay“, um die Analyse durchzuführen. Beim Ausführen der Analyse werden ein lineares Fenster mit Sholl-Profil, ein Sholl-Profil-Halblogarithmusfenster, ein Sholl-Ergebnisfenster, das alle Sholl-Ausgabewerte enthält, sowie ein Fenster mit Dateinamen für Sholl-Profile erstellt, das die Anzahl der Schnittpunkte bei jedem Radius gemäß dem Polynom angibt. Um das MEA zu messen, arbeiten Sie mit dem Skelettbild der Drüse in ImageJ.

Öffnen Sie das Polygon-Werkzeug und zeichnen Sie ein Polygon entlang des Umfangs der Drüse. Verwenden Sie Mausklicks, um Liniensegmente hinzuzufügen. Wenn der gesamte epitheliale Bereich umrundet wurde, doppelklicken Sie, um das Polygon zu schließen.

Drücken Sie dann die Taste M, um ein Ergebnisfenster zu öffnen. Der Wert in der Spalte „Fläche“ entspricht der MEA. Wenn das drüsenförmige Epithel über den Lymphknoten hinausreicht, subtrahieren Sie die Fläche des Lymphknotens von der MEA bei der Berechnung der Verzweigungsdichte.

Der Lymphknotenbereich kann auf die gleiche Weise wie die MEA gemessen werden. Mithilfe der beschriebenen Methoden wurden zwei altersentsprechende Rattengruppen analysiert. Die Tiere der Gruppe B wurden mit einer chemischen Substanz behandelt, die bekanntermaßen eine vorzeitige Entwicklung der Brustdrüse verursacht.

Die Darstellung der Anzahl der Verzweigungsschnittpunkte entlang des Radius von der Drüse veranschaulicht die Variabilität der Ergebnisse. Die Ergebnisse der Sholl-Analyse zeigten einen deutlichen Unterschied in der mittleren Anzahl der Schnittpunkte zwischen den Gruppen. Die Schnittpunkt-Daten müssen jedoch auf die Brustdrüsenfläche normiert werden, um Schlussfolgerungen ziehen zu können.

Die Sholl-Analyse und die Messung des epithelialen Bereichs der Brustdrüse liefern zwei physiologische Parameter, die für vergleichende Analysen nützlich sind. Deutlich erkennbar war die Größe der Drüsen in der Behandlungsgruppe deutlich größer. Die Sholl-Analyse liefert den Wert für Sum N, der zur Berechnung der Verzweigungsdichte und des Werts für k verwendet wird.

In der Behandlungsgruppe deuten die höhere durchschnittliche Verzweigungsdichte und der niedrigere Mittelwert von k, der eine geringere Abnahmerate der Verzweigungen widerspiegelt, darauf hin, dass die behandelten Tiere besser entwickelte Drüsen aufwiesen als die unbehandelten Tiere. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die Entfernung von Rauschen der entscheidendste Schritt ist. Eine zu starke oder zu geringe Rauschunterdrückung kann die Integrität der Drüse beeinträchtigen und die Ergebnisse verfälschen.

Bei der Anwendung dieser Methode ist es wichtig, mit einem intakten Brust-Whole-Mount zu beginnen. Ein genaues skelettiertes Bild kann nicht erhalten werden, wenn Unvollkommenheiten wie Risse oder Falten vorhanden sind. Die Erstellung eines genauen skelettierten Bildes erfordert Geduld und Übung.

Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie korrekt angewendet pro zu analysierende Drüse in 15 bis 20 Minuten durchgeführt werden.