Name: Automatische Protokolle für makromolekulare Kristallisation am MRC Laboratory of Molecular Biology (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Erfahren Sie automatisierte Kristallisationsprotokolle für strukturbiologische Studien von Makromolekülen wie Proteinen, DNA und RNA. Diese Methode ermöglicht die effiziente Herstellung hochwertiger Kristalle für Röntgenbeugung.

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Die MRC-LMB-Kristallisation-Anlage wird freundlicherweise unterstützt vom Medical Research Council (UK). Mitgliedern des LMB für ihre Unterstützung danken wir: Olga Perisic (PNAC), Tony Warne, Fusinita Van Den HNO und Pat Edwards (strukturelle Studien), Steve Scotcher und die anderen Mitglieder der mechanischen Werkstatt, Neil Grant und Jo Westmoreland (Sehhilfen), Paul Hart und Tom Pratt (es). Wir möchten auch für Steve Elliot (Tecan, UK), Mitchell Stuart und Heather Ringrose (Hamilton Robotics, UK), Paul Thaw, Robert Lewis und Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, Schweiz), George Stephens und Donald Ogg (Alphabiotech, danke! (UK), Neil Williams (Markem Imaje, UK) und Graham Harris (The Cleveland Agency) für technische Hilfe.

(1) die zwei vollautomatische Systeme (erste Sichtung)
<ol><li>
System 1: Vorbereitung der 72 96-Well-Kristallisation Platten gefüllt mit screening-Kits (LMB-Platten)
	<ol>
<li>Sicherzustellen Sie vor der Durchführung des Verfahrens, dass das System Roboter initialisiert werden und ihre controlling-Software geöffnet. Schalten Sie den Kühler des Trägers Rohr-Kühlung ca. 30 Minuten bevor das Hauptprogramm gestartet wird.</li>
		<li>Legen Sie eine Testplatte auf dem motorisierten SBS-Träger der Platte Sealer. Führen Sie die Platte Versiegelung und überprüfen Sie, dass der Film richtig angewendet wird. Wiederholen Sie diesen Test noch zweimal, um sicherzustellen, dass die Platte Sealer bereit ist.</li>
		<li>Fügen Sie 20 L deionisiertes Wasser in den wichtigsten Behälter des flüssigen Handlers. Trennen Sie die Kupplung-Einsätze aus dem kleinen Behälter (20 % Ethanol Spüllösung) und schließen Sie die Einsätze an den Hauptcontainer.</li>
		<li>Geben Sie den entsprechenden Benutzernamen (Tabelle 1) auf dem Inkjet-Drucker-Touchscreen. Dann öffnen und Schließen der Karussell-Tür, um die Karussell-Drehung auslösen. Öffnen Sie die Tür, wenn der erste Stapel sich darbietet.</li>
		<li>Vollständig zu laden, den ersten Stapel mit 22 Kristallisation Platten, jeweils mit Spalte 1 nach unten heraus. Geladen Sie vollständig die nächsten zwei Stapel auf die gleiche Weise.</li>
		<li>Die restlichen 6 Platten in den höchsten Positionen im vierten Stapel zu laden. Schließen Sie dann die Karussell-Tür.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass der Kühler 14 ° C Anzeige. Kehren Sie sanft und immer wieder die ausgewählten Screening-Kits für 1 Minute. Öffnen Sie die Frontplatte des flüssigen Handlers.</li>
		<li>Öffnen Sie die Rohre und legen Sie sie in der Kühlung Träger nach der 96-Well-Standardlayout (A1, A2 usw.). Setzen Sie durch das platzieren jedes Rohr im Träger ihre Deckel auf einem Tablett in der gleichen 96-Well-Layout.</li>
		<li>Cross-Check das Rohr positioniert und sicherzustellen, dass alle Rohre Niveau sind und ließ sich in den Träger. Schließen Sie dann die Frontplatte.</li>
		<li>Wählen Sie im Fenster 'Startup' der liquid Handler-Software "Run Instandhaltung" und öffnen Sie das Spülprogramm. Führen Sie das Programm, das 20 % Ethanol aus dem System zu spülen und die Außenseiten der Flüssigkeit-Abgabe Tipps zu waschen.</li>
		<li>Wenn Spülung abgeschlossen ist, klicken Sie auf 'Abbrechen', um zum "Startup" zurückzukehren. Wählen Sie "Ausführen ein bestehenden Prozesses" und klicken Sie auf "Start Ihrer Auswahl". Öffnen Sie das Programm "MRC Kit Dosieren". Füllen Sie in "18", "Instanzen" in der Konfiguration Bildschirm und führen Sie das Programm.</li>
		<li>Überwachen Sie das System, wie die ersten vier Platten beschriftet, gefüllt und versiegelt sind.</li>
		<li>Sobald alle 72 Platten vorbereitet und wieder in das Karussell gelegt wurden, wechseln Sie die Kupplung Einsätze aus den Hauptcontainer in den kleinen Behälter. Führen Sie das Programm "Start up Flush" (siehe Schritt 1.1.10).</li>
		<li>Schalten Sie den Kühler und entsorgen Sie die leere screening Kit Rohre. Entfernen Sie vorsichtig die 72 vorbereiteten Platten aus dem Karussell. Entsorgen Sie nicht korrekt ausgefüllt oder schlecht abgedichtet Platten. Speichern Sie die Ready-to-Use-Platten bei 10 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
System 2: Einrichten von Kristallisation Tröpfchen (100 nL Protein + 100 nL Zustand) aus einer einzigen Probe in 20 LMB-Platten
	<ol>
<li>Zunächst sicherstellen Sie, dass das System Roboter sind auf Nanoliter-Dispenser mit seiner offenen Software initialisiert wird und der liquid Handler-Methode-Manager geöffnet wird. Schalten Sie die Reaktionscup Kühlung Träger etwa 15 Minuten, bevor das Hauptprogramm gestartet wird.</li>
		<li>Legen Sie eine Testplatte auf dem motorisierten SBS-Träger der Platte Sealer. Laufen Sie die Platte Sealer und überprüfen Sie, ob die Platte richtig abgedichtet ist. Testen Sie die Platte Sealer dreimal.</li>
		<li>Führen Sie dann Nanoliter Dispenser 100 nL Tropfen der Probelösung in einer Testplatte legen. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, dass die Tröpfchen korrekt eingestellt sind. Schließen Sie die Nanoliter-Dispenser-Software und entfernen Sie den Filmstreifen-Halter Block aus dem Deck.</li>
		<li>Legen Sie als nächstes in die speziell angefertigte Kennzeichenhalter ( Vertreter Ergebnissesehen: Kristallisation Geräte entwickelt, bei der LMB) der LMB-Platte mit der höchsten relativen Menge an flüchtigen Reagenzien in seinen Bedingungen (Tabelle 1). Entfernen Sie die Klebefolie von der Platte.</li>
		<li>Öffnen Sie die Frontplatte liquid Handler und platzieren Sie die unversiegelte Platte auf dem Deck, auf der Rückseite der erste Schiebe Carrier (Träger rutschen kann herausgezogen werden zur Erleichterung des Zugangs).</li>
		<li>Die Platte mit einem SBS-Aluminium-Deckel abdecken. Den Deckel in Richtung der hinteren linken Ecke des Trägers durch sanften Druck auf die gegenüberliegende Ecke des Deckels zu begleichen.</li>
		<li>Entsiegeln, laden in den verschiebbaren Trägern und decken die restlichen 19 Tafeln auf die gleiche Weise, am wenigsten flüchtige Bedingungen arbeiten. Sobald die Reaktionscup Kühlung Träger bei 4 ° C, ist wie durch ein grünes Licht, entfernen Sie seine Abdeckung.</li>
		<li>Schneiden Sie den Deckel von einem Reaktionscup mit (mindestens) 440 µL Protein Probe (Tabelle 2). Sicherstellen Sie, dass die Probe kein Schaum über den Meniskus, wie dies mit der flüssigen Detection System stören. Legen Sie das Rohr in Position 1 des Trägers Reaktionscup Kühlung.</li>
		<li>Legen Sie eine PCR-Platte auf der liquid Handler Deck vor der Platte verschieben Adapter Träger. Schließen Sie dann die Frontplatte.</li>
		<li>Nach dem Laden des Decks, sicherzustellen Sie, dass Nanoliter Dispenser Deck des Filmstreifen-Halter Blocks klar ist und die Träger auf der Rückseite der 50 µL-Tipp-Stacks von SBS Aluminiumdeckel klar sind.</li>
		<li>Wählen Sie in der liquid Handler "Methode" Verwaltungsoberfläche "Setup Platten". Die Initialisierung der beiden Systeme zu überwachen und die geführten Parameter ausfüllen. Befolgen Sie die Richtlinien der Methode Management Schnittstelle (Eingabeaufforderungen, Figuren und ein Tipp-Management-System bei der Vorbereitung helfen).</li>
		<li>Vergewissern Sie sich, dass alle erforderlichen Komponenten sind bereit, und starten Sie dann den Vorgang.</li>
		<li>Überwachung des Systems wie Nanoliter Dispenser die Tropfen in der ersten Platte setzt und Platte Sealer danach die Platte versiegelt.</li>
		<li>Sobald alle 20 Platten mit Kristallisation Tröpfchen vorbereitet und automatisch an die gleitenden Träger zurückgegeben wurden, öffnen Sie die Frontplatte und entfernen Sie vorsichtig die Platten. Überprüfen Sie, dass die Platten richtig abgedichtet sind, vor dem Speichern zur Kristallisation.</li>
		<li>Reinigen Sie die SBS-Deckel mit einer 20 % Ethanol-Lösung vor dem Stapeln sie auf der linken Seite des liquid Handler für die Lagerung. Entsorgen Sie die PCR-Platte und die Reaktionscup.</li>
		<li>Schalten Sie die Reaktionscup Kühlung Träger und wischen Sie die Kondensation. Lassen Sie ein Papiertuch auf der kühleren Oberfläche Kondenswasser aufzunehmen. Dann bringen Sie die Träger-Abdeckung und schließen Sie die Frontplatte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Optimierung der Bedingungen
<ol><li>
Spritze-basierte liquid Handler: Herstellung von zwei linearen Gradienten der Konzentrationen in den Stauseen der Kristallisation Platte (4-Ecken-Methode).
	<ol>
<li>Zunächst sicherstellen Sie, dass der liquidere Handler eingeschaltet ist und mit seiner offenen Software initialisiert.</li>
		<li>Auf der "GRADIENT" Registerkarte: Öffnen Sie das gewünschte Programm, wählen Sie die Kristallisation Plattenart und das Endvolumen in den Stauseen (Tabelle 3). Die erweiterte Einstellung für 'max Schuss Vol' von 6.000 auf 3.000 gesenkt werden sollte, bei der Verwendung von Lösungen mit [Isopropanol] > 10 % V/V und [MPD] > 20 % V / v
</li>
		<li>Vorbereiten der Spritzen. Einen Kolben in jeder Spritze (Spitzen enden nach unten) und schieben Sie die Rückseite der Spritzen in die dafür vorgesehenen Nuten unter dem Roboterkopf. Drehen Sie eine Spritze im Uhrzeigersinn, um es in Stellung blockiert (das Programm startet nur mit allen erforderlichen Spritzen richtig angeschlossen).</li>
		<li>Bereiten Sie die Tröge. Entfernen Sie der Edelstahl-Rahmen, und fügen Sie die Tröge. Die 4 Positionen auf der linken Seite entsprechen den 4 Ecken A, B, C, D. Umstellung auf "SET UP" Registerkarte "die zeigt die Volumen der erforderlichen Lösungen in jede Spritze (auf Tabelle 3, 0,5 mL Totvolumen auf die Volumes angezeigt, hinzugefügt wurde). Gießen Sie die Eck-Lösungen in ihre jeweiligen Tröge und setzen Sie den Rahmen wieder auf das Deck (der Rahmen hält in Position mit 2 kleinen Magneten befindet sich an der Vorderseite des Decks). Eine alternative Möglichkeit, fahren mit diesem Schritt soll die Lösungen in die Tröge gießen, wenn sie bereits auf dem Deck platziert werden.
</li>
		<li>Platzieren Sie die Kristallisation Platte auf dem motorisierten SBS-Träger.</li>
		<li>Klicken Sie auf "ANZUSAUGEN" und warten Sie diesen Schritt abgeschlossen sein (wenn Kolben auf ihrem Weg nach oben gestoppt).</li>
		<li>Wechseln Sie zur Registerkarte "Ausführen" und führen Sie Programm.</li>
		<li>Nach Abschluss des Programms, gehen Sie zurück zu der Registerkarte "SET UP" und klicken Sie auf "Entfernen": das System löscht die Spritzen aus übrig gebliebenen Lösungen, und dann hebt die Kolben ganz oben. "Bereinigen" statt "REMOVE" verlangt werden, so bleibt der Kolben in der unteren Position bereit, weitere Lösungen mit der gleichen Spritzen Aspirieren.
</li>
		<li>Entfernen Sie die Spritzen durch Drehen sie gegen den Uhrzeigersinn.</li>
		<li>Spritzen und Tröge in den entsprechenden Behälter entsorgen (oder abspülen mit entionisiertem Wasser und dann 20 % V/V Ethanol Lösung zur Wiederverwendung).</li>
		<li>Die Dichtplatte und platzieren Sie es auf die Mikrotestplatte Mixer für 3 min bei 1.000 u/min oder 10 min, beim Mischen von hoch viskoser Lösungen. Die Platte ist bereit für die Einrichtung von Kristallisation Tröpfchen auf dem Nanoliter-Spender.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Additiv screening Protokoll Nr. 1 (Einrichtung von Kristallisation Tröpfchen in einer 96-Well-Kristallisation Platte vorausgefüllt mit Additiven Bildschirm)
	<ol>
<li>Zuerst bereiten Sie die Bedingung mit anfängliche Konzentrationen von Reagenzien stieg um 10 % (mind. Bd. 15 mL bei der Übertragung von der Bedingung aus einem Container auf dem Additiven Bildschirm mit dem liquid Handler).</li>
		<li>Sicherstellen Sie, dass der liquidere Handler betriebsbereit ist. Öffnen Sie das Programm "Bildschirm hinzufügen, Zusatzstoffe" für eine einzelne Platte (geben Sie Volumen in Stauseen: "72 µL"). Fordert, Figuren und eine Tipp-Management-System (12 x 1.000 µL Tipps erforderlich) Hilfe sicherstellen, dass der Roboter ist bereit, nach der Auswahl arbeiten.
</li>
		<li>Abrufen der additiven-Bildschirms aus dem Inkubator-20 ° C und seine Aluminium-Dichtung sofort (Nutzung der Kennzeichenhalter) entfernen, dann legen Sie die Platte auf dem Deck des flüssigen Handlers. Das Programm arbeitet nach einem Hochformat (die Platte wird mit der A1-Ecke befindet sich vorne links des Trägers platziert). Auch stellen Sie auch den Behälter gefüllt mit der Bedingung. Führen Sie das Programm.</li>
		<li>Die Stauseen der Platte ausgefüllt haben, legen Sie es auf den Mikrotestplatte Shaker und führen Sie das Programm. Spülen Sie den Behälter Zustand mit entionisiertem Wasser und 20 % Ethanol zur Wiederverwendung.</li>
		<li>
Richten Sie die Tropfen auf dem Nanoliter-Spender. Erstens entsiegeln der Kristallisation Platte (Nutzung der Kennzeichenhalter). Dann legen Sie die Platte und das 8-Brunnen-Protein in der ersten Position des Filmstreifen-Halter Blocks zu Streifen. Registerkarte "Setup" auf der controlling-Software zeigt die tatsächlichen Positionen der einzelnen Komponenten auf dem Deck. Laden Sie jeweils auch auf den Strip mit Protein Probe entsprechend die Tropfengröße erforderlich (Tabelle 4). Führen Sie das Programm, Tröpfchen vorzubereiten.
</li>
		<li>Nach Abschluss des Programms, entfernen Sie die Platte aus dem Deck und verschließen Sie diese sofort (verwenden Sie die Platte Versiegelung, 3-Zoll breites Klebeband). Verwerfen Sie den Streifen in den geeigneten Lagerplatz.</li>
		<li>Größe, Form, zu bewerten und Zentrierung der Tropfen unter dem Mikroskop vor der Einlagerung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Additiv screening Protokoll Nr. 2 (Kristallisation Tröpfchen in einer 96-Well-Kristallisation-Platte mit einem wiederverwendbaren Additiv Bildschirm einrichten)
	<ol>
<li>Zuerst bereiten die additive Bildschirm: entsprechende gefrorenen 96-Well Kultur Zellplatte, bei 40 min. bei Raumtemperatur auftauen lassen. Dann Zentrifugieren Sie Additiv Bildschirms auf 1.000 x g für 2 min.</li>
		<li>Bereiten Sie die Bedingung (min. Vol. 15 mL bei der Übertragung von der Bedingung aus einem Container auf dem Additiven Bildschirm mit dem liquid Handler).</li>
		<li>Füllen Sie die Stauseen einer Kristallisation der 96-Well-Platte mit der Bedingung. Gehen Sie auf der Flüssigkeit-Handler genauso wie Protokoll 1, 2.2.2 Schritt, aber geben Sie "80 µL" für die Lautstärke in den Wasserbecken.</li>
		<li>Richten Sie die Tropfen auf dem Nanoliter-Spender mit 3 Komponenten auf dem Deck (die Platte mit dem Additiv Bildschirm, zusammen mit der Kristallisation Platte und den 8-Brunnen Protein-Streifen in der ersten Position des Filmstreifen-Halter Blocks, Tabelle 4).</li>
		<li>Die Zelle Kultur Dichtplatte mit dem Bildschirm mit einem Alu-Blech und legen Sie sie wieder in den Inkubator-20 ° C.</li>
		<li>Größe, Form, zu bewerten und Zentrierung der Tropfen unter dem Mikroskop vor der Einlagerung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Wir erklären hiermit ein widersprüchliche kommerzielles Interesse, da LifeArc die folgenden Elemente vertreibt: 96 - und 48-Brunnen MRC-Platten, MRC hängenden Tropfen Dichtung, MORPHEUS, Pi, ANGSTROM und LMB Kristallisation Bildschirme.

1 - Vorbereitung und Verwendung von Einstiegsbilder gespeichert in Platten
Screening-Kits sollten gemischt werden, bevor in Platten verzichtet wird, weil leichte Niederschläge oder Phase Trennung in einigen Röhren während der Lagerung auftritt. Wenn ein Bildschirm aus zwei Kits (2 x 48 Röhren) besteht, die erste Röhre des zweiten Kit in Lage E1 der der kühlenden Träger steht. Wenn ein Bildschirm von 4 Kits (4 x 24 Röhren) besteht, die erste Röhre des zweiten Kit befindet sich im Ort C1, die erste Röhre des dritten Kit befindet sich im Ort E1 und die erste Röhre des vierten Kit befindet sich im Ort G1. Beim Einsetzen der Röhren in ihrem Kühlsystem Träger, sind Deckel auf einem Tablett nach dem standard 96-Well-Querformat-Layout platziert. Da gut Zahlen auf die Deckel von den Herstellern angegeben sind, ist dadurch die Gegenprüfung wenn alle Röhren in der richtigen Reihenfolge platziert wurden. Dies hilft auch, um die richtigen Deckel auf die Rohre zu ersetzen, wenn eine geringere Anzahl von Platten zu füllen.
Wir speichern die vorgefüllten Platten bei 10 ° C, einen Kompromiss zu vermeiden, Einfrieren und Lagerung bei 4 ° C, die Verschlechterung der Bedingungen und Probleme mit Abdichtung führen kann. Platten sind lagerfähig bis zu mehreren Monaten mit normalerweise keine spürbaren Kondensation auf der Innenseite der Dichtung. Dies gilt weniger für LMB05, LMB06, LMB09 und LMB10 Platten wie diese Bedingungen mit relativ hohen Konzentrationen der flüchtigen Reagenzien (Tabelle 1) enthalten. Kleine Menge von Kondenswasser an der Innenseite der Dichtung reduziert Abdichtung Effizienz und Kreuzkontaminationen zwischen Brunnen und Entsiegelung die Platten verursachen kann. Um Hilfe bei der Kondensation während der ersten Abkühlung zu verhindern, können Platten zuerst aus dem Karussell in einer isolierten Picknick Kühler übertragen werden, die über Nacht in einen Kühlraum von 4 ° C gespeichert ist. Die sehr langsame Abkühlung minimiert die Entwicklung des Temperaturgradienten innerhalb der versiegelten Brunnen und somit reduziert Kondenswasser insgesamt15. Sobald die Platten im Inkubator 10 ° C gelagert sind, wird darüber hinaus ein eigene benutzerdefinierter SBS Polystyrol Deckel auf die Platte am oberen Rand jeder Stapel (nicht dargestellt) gelegt.
Die Gesamtheit unserer Pre-filled Platten kann als eine große Einstiegsbild gegen eine neuartige, wasserlöslich, Protein-Probe verwendet werden. Alternativ können weniger Platten ausgewählt werden, um spezifische Anforderungen zu erfüllen. Z. B. LMB15 und LMB19 sind Bildschirme formuliert speziell für Membran-Protein Proben26,27, oder LMB20 ist ein Bildschirm mit Heavy-Atome zur Erleichterung der experimentellen Ausstieg von Beugung Daten28 formuliert (siehe auch : <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">Formulierung der MORPHEUS Protein Kristallisation Bildschirme</a>).
2. Einrichten der Kristallisation Tröpfchen
Bei der Verwendung des Systems 2 sollten screening-Kits mit erheblichen Mengen von flüchtigen Reagenzien zuerst verarbeitet werden. Dies vermeidet Kondensatbildung auf der SBS-Deckel, die Deckel Handling und Platte Abdichtung beeinträchtigen könnten. Ein SBS-Deckel hat ein bisschen Abstand wenn oben auf einen Teller, weshalb sie ursprünglich ausgerichtet werden müssen (siehe Protokoll, Schritt 1.2.6). Das Protein Totvolumina in den Vertiefungen der PCR Platte sind relativ großzügig (0,8 µL, siehe Legende der Tabelle 2). Beachten Sie, dass ebenso großzügige Totvolumina beschäftigt sind, bei den Nanoliter Spender individuell mit Protein in 8-Well Streifen (Tabelle 4). Kleinere Totvolumina arbeiten kann, aber einige Proben an die Tipps halten, Kalibrierung eines Roboters kann etwas ungenau geworden, der Raum wärmer als üblich, etc.sein kann. Alle führen zum Beispiel Verluste von der großzügigen Totvolumina abgedeckt um den Ansatz zu konsolidieren.
Jüngste Entwicklungen konnte weitere Miniaturisierung von Experimenten und damit das Volumen der Probe erforderlich für screening-Kristallisation Bedingungen deutlich reduziert werden durch die Integration der entsprechenden Technologie29,30 . Allerdings benötigen einige Aspekte der weiteren Miniaturisierung reiflicher Überlegung, wie die Verdunstung der Tröpfchen31 und die Manipulation der Mikrokristalle32.
Zentrifugation der Platte (2.000 u/min, 1 min) konnte schließlich als routinemäßige letzter Schritt integriert werden, beim Einrichten von Kristallisation Tröpfchen (in sphärische oberen-Brunnen). Eine einheitlichere Größe und Form von Tröpfchen durch Zentrifugation können Reproduzierbarkeit Fragen33,34verringern. Sicherlich werden zentrierte Tropfen erleichtern die spätere Bewertung der Experimente unter Verwendung eines Mikroskops, da die erforderliche Brennweite über die gesamte Platte ähnlich sein werden.
3. Vorteile der 4-Ecken-Methode
Der wichtigste Vorteil des 4-Ecken-Methode ist seine Einfachheit, die Fehler minimiert und ermöglicht einfache automatisierte Protokolle. Beispielsweise werden die 4 Eck-Lösungen immer auf dem Deck eines flüssigen Handlers nach das gleiche Layout platziert werden. Alle Programme basieren auch auf festen Verhältnisse zwischen den Lösungen (Abbildung 3). Manuelle Erstellung von 4 Ecklösungen ist bevorzugt, automatische Behandlung von Lösungen bei hohen Konzentrationen die hochviskosen sein kann. Relativ schnell und präzise Absaugung/Abgabe ist dann auf die meisten Arten von liquid Handler mit Mindestanforderungen zur Optimierung der flüssigen Klassen möglich. Jedoch möglicherweise einige Eck-Lösungen noch zu zäh für einen Roboter mit einer Flüssigkeit-System, effizient zu arbeiten. Deshalb entschieden wir uns für einen flüssigen Handler mit positive Verschiebung (Abb. 3 b).
Zusätzlich zu den 2 linearen Gradienten der Konzentrationen kann eine dritte Komponente (d. h., eine Reihe von Puffern/Zusätze) in einer konstanten Konzentration auf bequeme Weise getestet werden. Hierzu wird zunächst eine relativ große Datenmenge einen Kernsatz von Ecklösungen in einer entsprechend höheren Konzentration, ausgenommen die Komponente variiert werden, vorbereitet. Dann Stammlösungen einschließlich dieser Komponente wird hinzugefügt, um die Endkonzentrationen anzupassen. Z. B. sind 50 mL eines Satzes von 4 Ecklösungen bei 10 % höheren Konzentrationen als ursprünglich bereit. Dieser Kernsatz wird in 5 kleinere Teilmengen von 4 aufgeteilt. Schließlich wird jede Teilmenge 10 % im Volumen von verschiedenen Puffer-pH-Lösungen hinzugefügt.
(4) Formate und Arten von Additiven Bildschirme
Die Bildschirme werden normalerweise bei-20 ° C (Abbildung 4) gespeichert, da sie nicht regelmäßig verwendet werden und enthalten flüchtige/instabile Verbindungen. Die Verwendung eines gefrorenen Additiv Screen gespeichert in einem tiefen Brunnen Block (1 mL in Brunnen) muss frühzeitig geplant werden, weil es dauert 12-24 Stunden für die additive Lösungen vollständig bei Raumtemperatur auftauen. Auch eine Vielzahl von Nutzern teilen demselben Additiven Bildschirm verursachen Probleme mit Cross-Kontamination. Zu guter Letzt macht die Höhe der Tiefbrunnen Blöcke sie ungeeignet für die meisten Nanoliter-Dispenser. Als günstige Lösung für diese Probleme zu umgehen sollte der Bildschirm aus dem Tiefbrunnen Block auf flache Teller (Abbildung 4) übertragen werden.
In der Vergangenheit wurden additive Bildschirme umfasst eine Vielzahl von einzelnen Reagenzien (mit einzelnen Konzentrationen) sehr beliebt35,36. Jedoch haben andere Arten von Additiven Bildschirmen entwickelt worden, die Mischungen von Zusatzstoffen37 oder eine reduzierte Anzahl von einzelnen Zusatzstoffe finden Sie unter verschiedenen Konzentrationen38zu integrieren. Schließlich ist ein ergänzender Ansatz zur Untersuchung der Wirkung von Zusatzstoffen auf die Proben vor der Kristallisation39,40.
5. weitere Überlegungen
Gute Praxis: Die meisten Bildschirme schädliche oder sogar giftige Substanzen enthalten und daher muss ausreichenden Personenschutz eingesetzt werden, während die Protokolle. Ebenso kann bewegliche Teile der Roboter zu Verletzungen führen, vor allem wenn Sie versuchen, manuell einzugreifen, während ein Programm ausgeführt wird (obwohl die meisten der Roboter Not-Halt-Taste/System verfügen). Aufgrund der technischen Komplexität beteiligt, regelmäßige Überprüfung der Roboter, Bildschirme und Programme mit zuvor gekennzeichnet Prüfmuster für anhaltend hohe Reproduzierbarkeit von Bedeutung sind.
Durchsatz: Als Anhaltspunkt werden zwischen 4.000 bis 8.000 LMB Platten jährlich mit dem System 1 (und später Beschäftigte von Benutzern für ersten Screening) produziert. Es ist nicht an Lager angepasst eine große Menge von Pre-filled Platten bei 10 ° C wird der erwartete Umsatz nach 4-5 Monate, einige Bedingungen viel niedriger, als startet zu verschlechtern und zu verdampfen. Verschiedene Ansätze zur Automatisierungsprotokolle sind für kleine bis mittelgroße Labors41umgesetzt worden.
Speichern und Bewertung von Experimenten: Nach der Vorbereitung der Tröpfchen, sind Platten auf vibrationsarmen Regale in einem Raum bei 4 oder 18 ° C mit streng kontrollierter Temperatur (+/-0,5 ° C maximale Abweichung) gespeichert. Experimente sind mit kaltem Licht Quelle Mikroskope beurteilt. Verschiedene automatisierte bildgebende Systeme sind kommerziell verfügbar, jedoch sollte man sorgfältig alle Aspekte zu berücksichtigen: die Geschwindigkeit erforderlich, um eine Platte Scannen ausreichen für hohen Durchsatz? Werden andere Objekte als Kristalle mit Autofokus stören? Wird die resultierende Qualität der Bilder vor Ort sehr kleine Kristalle (vor allem um den Rand der Tröpfchen) ausreichen? 42 , 43 , 44
Vergleich der Kristallisation Bedingungen: Nach sorgfältigen Untersuchungen über die Natur der ursprünglich erhaltenen Kristalle kann man Trends und Gemeinsamkeiten über Bedingungen mit der <a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">LMB Bildschirm Datenbank</a> oder die C6 <a href="http://c6.csiro.au/">Webtool</a>45analysieren.

Röntgen-Kristallographie wird ausgiebig um unser Verständnis der Mechanismen der biologischen und Krankheit auf atomarer Ebene weiter und rationale Ansätze zur Drug Discovery1anschließend gerne angewendet. Für diese, gereinigt und konzentriert (2-50 mg/mL) makromolekularen Proben von Proteinen, DNA, RNA, andere Liganden und ihre komplexe sind erprobt für ihre Neigung, Form dreidimensionalen Gitter durch Kristallisation2,3 bestellt ,4. Wenn hochwertige Kristalle, die Röntgenstrahlen beugen gewonnen werden, kann die Kristallstruktur in der Nähe von atomarer Auflösung5,6gelöst. Entscheidend ist, die Voraussetzungen für eine neue Probe kristallisieren können nicht vorhergesagt werden und die Ausbeute an qualitativ hochwertige Kristalle beträgt in der Regel sehr gering. Eine Ursache ist, dass viele Proben von Interesse herausfordernde biochemische Eigenschaften, die sie auf der entsprechenden Zeitskala für Kristallisation (in der Regel ein paar Tage) instabil machen. Zu guter Letzt wird der Prozess durch den Zeitaufwand, Proben und Muster Varianten produzieren und optimieren Sie ihre Reinigung und Kristallisation7,8verschärft.
Eine Kristallisation Bedingung ist eine Lösung mit einem Fällungsmittel, die Sample-Löslichkeit verringert, und Bedingungen oft auch Puffer und Zusatzstoffe enthalten. Hunderte von solchen Reagenzien sind gut geeignet, um die Parameter der Kristallisation Experimente zu ändern, da sie geringe Neigung zu stören Probe Integrität (z.B. Protein oder Nukleinsäure-Entfaltung) haben. Während Millionen von Kombinationen der Kristallisation Reagenzien testen nicht machbar ist, ist Testen von mehreren bis vielen Screening-Kits - formuliert mit verschiedenen Strategien9,10 - mit miniaturisierten Irrungen und automatisierten Protokolle möglich. In dieser Perspektive ist die am meisten zugänglich Technik wahrscheinlich Dampf Diffusion mit 100-200 nL Tröpfchen sitzt auf einem kleinen gut über ein Becken mit der Kristallisation Zustand (25-250 µL), umgesetzt in spezialisierten Kristallisation Platten11 , 12. Protein Probe und Zustand werden häufig kombiniert, im Verhältnis 1:1 für ein Gesamtvolumen von 200 nL beim Einrichten der Tröpfchen in den oberen-Brunnen. Roboter-Nanoliter Protein Kristallisation kann implementiert werden, mit alternativen Techniken und Platten wie die unter Öl Batch13 und Lipid-kubische Phase14 (die jüngste ist ein speziell auf Trans-Membranproteine, die angewendet wird sehr schlecht in Wasser löslich).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">Der Kristallisation Anlage am MRC-LMB</a> wurde in den frühen 2000er Jahren begonnen und eine frühe Übersicht über unsere automatisierten Protokolle wurde in 200515. Eine historische Einführung in die Protein-Kristallisation wurde vorgestellt und auch ein Überblick über die Vorteile der Roboter Nanoliter nähern (dann einen neuartigen Ansatz zur routinemäßigen Experimente). Seit makromolekularen Kristallisation ist im Wesentlichen ein stochastischer Prozess mit sehr wenig oder gar keine nützliche Vorabinformationen, beschäftigt eine breite Vielzahl von (geeigneten) Anfangsbedingungen erhöhen die Ausbeute an Qualität Beugung Kristalle16. Außerdem ist ein oft übersehener Vorteil von einem anfänglichen Großbild, die Notwendigkeit der Optimierung von Proben und Kristallen in vielen Fällen deutlich zu reduzieren. Natürlich kann man müssen noch mit Optimierung von einigen Anfangsbedingungen später fortfahren. In der Regel die Konzentration von Reagenzien und der pH-Wert werden dann systematisch untersucht. Weitere Reagenzien können auch in die optimierte Bedingung(en), weitere Parameter der Kristallisation ändern eingeführt werden. Sicherlich, man sollte versuchen Kristallisation mit einer Probe frisch zubereitet, daher die entsprechenden Protokolle müssen jederzeit unkompliziert und verfügbar.
Hier zwei vollautomatische Systeme bei MRC-LMB (Anlagen 1 und 2) und die entsprechenden Protokolle sind ausführlich beschrieben. Die Hauptanwendung der beiden Systeme ist initial screening durch Dampf-Diffusion in Drop Kristallisation Platten sitzen. System 1 integriert ein liquid Handler, eine automatisierte Karussell auf Lager Platten, Tintenstrahldrucker für die Platte Beschriftung und einer Haftplatte Sealer. Auf dem System 1 sind 72 96-Well-Platten gefüllt mit im Handel erhältlichen Screening-Kits (80 µL Zustand ins Reservoir aus einem Start Volumen von 10 mL im Reagenzglas), beschriftet und versiegelt. Die Platten werden dann in einem Inkubator 10 ° C gespeichert wo sie Benutzern zur Verfügung jederzeit (als Einstiegsbilder "LMB Platten" genannt) sind.
System 2 integriert ein liquid Handler, ein Nanoliter-Dispenser und einer Haftplatte Sealer. Auf dem System 2, sitzen Tröpfchen (100-1.000 nL) für Dampf Diffusion Experimente entstehen durch die Kombination von Bedingungen und die Probe in den oberen Vertiefungen der 20 48 oder 96-Well-Platten vorausgefüllt mit Bedingungen. Dies bedeutet, dass 1.920 ersten Screening Bedingungen erprobt sind, bei der Verwendung von 20 LMB Platten auf das System 2.
Roboter sind auch einzeln für die Optimierung der gewählten Bedingungen benutzt, und die entsprechenden halbautomatischen Protokolle werden ebenfalls beschrieben. Die 4-Ecken-Methode17 wird routinemäßig eingesetzt, um Optimierung Bildschirme produzieren. Das entsprechende Protokoll erfordert zunächst die manuelle Vorbereitung der 4 Lösungen ("A, B, C und D"). Zwei lineare Verläufe von Konzentrationen (für zwei wichtigsten Kristallisation Agents) werden direkt in den Stauseen der Kristallisation Platte dann automatisch generiert. Dafür verzichtet ein Spritze-basierte liquider Handler die 4 Eck-Lösungen bei unterschiedlichen Verhältnissen.
Um eine Bedingung weiter zu optimieren, kann eine additive Bildschirme einsetzen, die möglicherweise die Eigenschaften des resultierenden Kristalle18verbessern. Zwei Ansätze gibt es für additive Screening: ein Protokoll, beginnend mit Zusatzstoffe verzichtet in den Stauseen der Kristallisation Platten vor dem Einrichten der Tröpfchen (Protokoll 1) und ein anderes Protokoll, wo die additive Bildschirm entfällt, direkt auf die Tröpfchen (Protokoll Nr. 2).
Andere nützlichen Entwicklungen, die bei der MRC-LMB, automatisierte makromolekularen Kristallisation zu erleichtern eingeleitet wurden, werden ebenfalls vorgestellt. Im wesentlichen minimiert Kristallisation Platten und damit verbundenen Geräte wie z. B. einen stapelbaren Gesellschaft der biomolekularen Screening (SBS) Deckel, die Verdampfung von Bedingungen, wenn das System 2 mit.
Aus Platzgründen wird davon ausgegangen, dass Benutzer mit den Grundfunktionen und Wartung von Nanoliter-Dispenser, dem Inkjet-Drucker und Haftplatte Sealer vertraut sind. Sofern nicht anders angegeben, sind die Platten auf dem Deck der Roboter positioniert, dass die gut A1 ("A1-Ecke") ist auf der Rückseite links ein Plattenträger.

<table><tbody><tr><td>Robots</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freedom EVO&reg;</td><td>Tecan</td><td>n/a</td><td>Liquid Handler (System 1). Aspiration/Dispense auf Basis von Systemflüssigkeit. Integriert ein automatisiertes Karussell. EVOware plus Steuerungssoftware v.2.4.12.0.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrolab&reg; STAR&Handel;</td><td>Hamilton</td><td>n/a</td><td>Liquid-Handler (System 2). Aspiration/Dispense auf Basis von Verdrängung (CO-RE&trade; Technologie). Hamilton STAR Steuerungssoftware v.4.3.5.4785 mit Methodenverwaltungsschnittstelle.</td></tr><tr><td>Mücke&reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>Nanoliter-Dispenser auf Mikrospritzenbasis zum Aufsetzen von Tröpfchen (System 2 und Stand-alone), 3-Positionen-Deck. Steuerungssoftware v.3.11.0.1422.&nbsp;</td></tr><tr><td>Libelle&reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>Liquid Handler auf Spritzenbasis zur Herstellung von Optimierungssieben (4-Ecken-Methode). Steuerungssoftware v.1.2.1.10196.&nbsp;</td></tr><tr><td>Klebeplattenverschließer</td><td>Brandel</td><td>n/a</td><td>Integriert in die Systeme 1 und 2 (auch als eigenständiger Roboter eingesetzt).</td></tr><tr><td>Tintenstrahldrucker 9232</td><td>Markem-Imaje</td><td>n/a</td><td>Integriert in System 1. Touchscreen-Schnittstelle.</td></tr><tr><td>Kristallisationssiebe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystal Screen&trade; 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 ml pro Bedingung) verwendet in LMB01</td></tr><tr><td>Crystal Screen 2& Handel;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 ml pro Bedingung), verwendet in LMB01</td></tr><tr><td>Wizard&trade; Classic 1</td><td>Rigaku</td><td>1009530</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Zustand), verwendet in LMB02</td></tr><tr><td>Wizard&trade; Classic 2</td><td>Rigaku</td><td>1009531</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung), verwendet im LMB02</td></tr><tr><td>Gittersieb Ammoniumsulfat</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-211</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung), verwendet im LMB03</td></tr><tr><td>Gitter Screen&trade; PEG/LiCl</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-217</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung) verwendet in LMB03</td></tr><tr><td>Quick Screen&trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-221</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung), verwendet im LMB03</td></tr><tr><td>Gittersieb&Handel; Natriumchlorid</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-219</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung), verwendet im LMB03</td></tr><tr><td>Gittersieb PEG 6000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-213</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung) zur Verwendung in LMB04</td></tr><tr><td>Gittersieb MPD</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-215</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung), verwendet in LMB04</td></tr><tr><td>MemFac&trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-114</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 ml pro Bedingung) zur Verwendung in LMB04</td></tr><tr><td>PEG/Ion&Trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-126</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 ml pro Bedingung) verwendet in LMB05</td></tr><tr><td>Natrix&trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-116</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 ml pro Bedingung), verwendet im LMB05</td></tr><tr><td>Crystal Screen Lite& Handel;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-128</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung) verwendet im LMB06</td></tr><tr><td>Custom Lite Screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Zustand), verwendet in LMB06</td></tr><tr><td>Wizard&trade; Cryo 1</td><td>Rigaku</td><td>1009536</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 ml pro Bedingung), verwendet in LMB07</td></tr><tr><td>Wizard&trade; Cryo 2</td><td>Rigaku</td><td>1009537</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 ml pro Bedingung), verwendet in LMB07</td></tr><tr><td>JBS1</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-101L</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Zustand), verwendet in LMB08</td></tr><tr><td>JBS2</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-102L</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Zustand), verwendet in LMB08</td></tr><tr><td>JBS3</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-103L</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung), verwendet in LMB08</td></tr><tr><td>JBS4</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-104L</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung), verwendet in LMB08</td></tr><tr><td>JBS5</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-105L</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Zustand), verwendet in LMB09</td></tr><tr><td>JBS6</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-106L</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung), verwendet in LMB09</td></tr><tr><td>JBS7</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-107L</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Zustand) verwendet in LMB09</td></tr><tr><td>JBS8</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-108L</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Zustand) verwendet in LMB09</td></tr><tr><td>JBS9</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-109L</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Zustand) verwendet in LMB10</td></tr><tr><td>JBS10</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-110L</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 ml pro Zustand), das in LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade verwendet wird. Sieb 1 pH 4,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung), verwendet in LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Sieb 1 pH 5,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung), verwendet in LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Sieb 1 pH 6,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 ml pro Bedingung), verwendet in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Sieb 1 pH 7,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung), verwendet in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Sieb 1 pH 8,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 ml pro Bedingung), verwendet in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Sieb 2 pH 4,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung) verwendet in LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Screen 2 pH 5,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung), verwendet in LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Screen 2 pH 6,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung), verwendet in LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Sieb 2 pH 7,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung), verwendet in LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Sieb 2 pH 8,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung), verwendet in LMB12</td></tr><tr><td>Index&trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 ml pro Bedingung), verwendet in LMB13</td></tr><tr><td>SaltRX&trade; 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-107</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Zustand), verwendet in LMB14</td></tr><tr><td>SaltRX&trade; 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-109</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Zustand), verwendet in LMB14</td></tr><tr><td>MemStar&trade;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-21</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung), verwendet in LMB15</td></tr><tr><td>MemSys&trade;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-25</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung), verwendet in LMB15</td></tr><tr><td>JCSG-plus&trade; Suite</td><td>Qiagen</td><td>130720</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung) für LMB16</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg; Screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-46</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung) für LMB17</td></tr><tr><td>Pi minimales Screening</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-127</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung) für LMB18</td></tr><tr><td>Pi-PEG-Screening</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-128</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Zustand), verwendet in LMB19</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg; II Sieb</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-91</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 mL pro Bedingung) verwendet im LMB20</td></tr><tr><td>LMB Kristallisationssieb & Handel;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-98</td><td>Kristallisationskit (Reagenzgläser, 10 ml pro Zustand) zur Verwendung in LMB21</td></tr><tr><td>Additivsiebe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT Additivsieb</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-138</td><td>Gefroren in einem 96-Well-Deepwell-Block (1 mL pro Well).</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg; Additivsieb</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93-500</td><td>Gefroren in einem 96-Well-Deepwell-Block (500 & Mikro; L pro Vertiefung).</td></tr><tr><td>ANGSTROM Additiv Screen&Trade; &nbsp;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100</td><td>Gefroren in einem 96-Well-Deepwell-Block (1 mL pro Well).</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg; Additivsieb</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93</td><td>Gefroren in 96-Well-Zellkultur Costar&reg; Platte mit V-förmigen Wells (100 & Mikro; L pro Vertiefung).</td></tr><tr><td>ANGSTROM Additiv Screen&Trade; &nbsp;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100-FX</td><td>Gefroren in 96-Well-Zellkultur Costar&reg; Platte mit V-förmiger Vertiefung (100 & Mikro; L pro Vertiefung).</td></tr><tr><td>HIPPOCRATES Additivsieb</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a</td><td>48 Einzeladditive (Wirkstoffe in MORPHEUS&reg; III).</td></tr><tr><td><stark>Sonstige Verbrauchsmaterialien</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-Well MRC 2-Tropfen-Platte</td><td>Swissci</td><td>MRC 96T-UVP</td><td>Sitz-Tropfen-Dampfdiffusionsplatte. Empfohlenes Volumen des Behälters: 80&nbsp; &micro;L. Bereich der nutzbaren Tröpfchenvolumen: 10-1000 nL. UV-durchlässig.</td></tr><tr><td>48-Well-MRC 1-Tropfen-Platte&nbsp; ('MAXI-Platte')</td><td>Swissci</td><td>MMX01-UVP&nbsp;</td><td>Sitzende Tropfen-Dampfdiffusionsplatte für Scale-up/Optimierung. Empfohlenes Volumen des Behälters: 200&nbsp; &micro;L. Bereich des nutzbaren Tröpfchenvolumens: 0,1-10 &micro;L. UV-durchlässig.</td></tr><tr><td>MRC hängende Tropfendichtung</td><td>Swissci</td><td>n/a</td><td>Hängender Tropfen, kompatibel mit beiden MRC Dampfdiffusionsplatten (MRC 96T-UVP und MMX01-UVP ). UV- und röntgendurchlässig.</td></tr><tr><td>Klebeband</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-50</td><td>3 Zoll breit Ente&reg; HD Klären & Handel; Für Versiegelung und manuelle Versiegelung.</td></tr><tr><td>Selbstklebendes Aluminiumblech</td><td>Beckman Coulter</td><td>538619</td><td>Wird zum Wiederversiegeln von Additivsieben verwendet.</td></tr><tr><td>Tintenpatrone</td><td>Markem-Imaje</td><td>9651</td><td>System 1 (Tintenstrahldrucker).</td></tr><tr><td>Lösemittelpatrone</td><td>Markem-Imaje</td><td>8652</td><td>System 1 (Tintenstrahldrucker).</td></tr><tr><td>50 & Mikro; L Tipps&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>235947</td><td>System 2 (STAR&trade; Liquid-Handler). Box mit 6 Sets mit 1920 x CO-RE&trade; Spitzen in Einwegstapeln.</td></tr><tr><td>Reagenzbehälter</td><td>Hamilton</td><td>194052</td><td>Wird verwendet, um eine Bedingung während additiver Screening-Protokolle in Platten(e) zu dispensieren.</td></tr><tr><td>PCR-Platte</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td>AB-2150</td><td>System 2 (enthält Protein, das auf die Mücke übertragen werden soll&reg;). Abgene Diamond ultra, 384 V-förmige Vertiefungen.</td></tr><tr><td>Mikrospritzen</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03020</td><td>Spule mit 26.000 Mikrospritzen für den Mosquito&reg; Nanoliter-Dispenser (9 mm Abstand).</td></tr><tr><td>Streifenhalterblock</td><td>TTP Labtech</td><td>3019-05013</td><td>SSB-Gerät für die Mosquito&reg-Streifen, auch bekannt als '4-Wege-Reagenzienhalter'.</td></tr><tr><td>2 & Mikro; L 8-Well-Strip</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03110</td><td>Enthält Protein auf dem Deck des Mosquito&reg;. Schachtel mit 40 Streifen, max. Vol. in der Vertiefung ist 3,2 & Mikro; L.</td></tr><tr><td>5 & Mikro; L 8-Well-Streifen</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03100</td><td>Enthält Protein auf dem Deck des Mosquito&reg;. Schachtel mit 40 Streifen, max. Vol. in der Vertiefung ist 7,5 & micro;L.</td></tr><tr><td>5 mL Spritzen</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07100</td><td>Spritzenkörper und Kolben für den Dragonfly&reg; Liquid Handler. Packung mit 100 Stück.</td></tr><tr><td>Tröge/Behälter</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07103</td><td>Enthält Stammlösungen auf dem Deck der Dragonfly&reg;. Packung mit 50 Stück.</td></tr><tr><td>Orbitaler Mikroplattenschüttler</td><td>CamLab Limited</td><td>n/a</td><td>Variomag&reg; für Mischbedingungen in einer einzigen Platte (0-2000 U/min).</td></tr><tr><td>Mikrotiterplatten-Mischer</td><td>TTP Labtech</td><td>3121-01015</td><td>MxOne. Mischbedingungen in einer einzigen Platte mit 96 Vibrationsstiften.</td></tr></tbody></table>

automatische protokolle für makromolekulare kristallisation am mrc laboratory of molecular biology

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Wenn hochwertige Kristalle, die Röntgenstrahlen beugen gewonnen werden, kann die Kristallstruktur in der Nähe von atomarer Auflösung gelöst. Die Voraussetzungen für die Proteine, DNA, RNA und ihre komplexe kristallisieren lassen sich jedoch nicht vorhersagen. Beschäftigt eine breite Vielzahl von Bedingungen, ist eine Möglichkeit, die Ausbeute an Qualität Beugung Kristalle zu erhöhen. Zwei voll automatisierte Systeme haben bei der MRC Labor für Molekularbiologie (Cambridge, England, MRC-LMB), die Kristallisation Abschirmung gegen 1.920 Anfangsbedingungen zu erleichtern durch Dampf-Diffusion in Nanoliter Tröpfchen entwickelt. Halbautomatische Protokolle wurden auch entwickelt, um die Bedingungen zu optimieren, durch Änderung der Konzentrationen von Reagenzien, pH-Wert, oder durch die Einführung von Zusatzstoffen, die potenziell Eigenschaften der daraus resultierenden Kristalle verbessern. Die entsprechenden Protokolle werden ausführlich beschrieben und kurz besprochen. Zusammengenommen können sie bequem und hocheffiziente makromolekularen Kristallisation in einer Mehrbenutzer-Einrichtung, wobei der Benutzer Kontrolle über die wichtigsten Parameter ihrer Experimente.

Automatisierte Systeme und Protokolle für die routinemäßige Vorbereitung einer großen Anzahl von Bildschirmen und Nanoliter Kristallisation Tröpfchen für Dampf-Diffusion-Experimente sind beschrieben und diskutiert.

Automatische Protokolle für makromolekulare Kristallisation am MRC Laboratory of Molecular Biology

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, hochwertige Kristalle aus anfänglichen Kristallisations-Screening-Bedingungen herzustellen. Die Kristalle können verwendet werden, um die Strukturen von Proteinen, DNA, RNA und ihren Komplexen zu untersuchen. Etwas an makromolekularen Strukturen ist zunehmend herausfordernd geworden.Die Bereitstellung einer breiten Vielfalt an Anfangsbedingungen erhöht die Ausbeute an brauchbaren Kristallen und verringert gleichzeitig den Bedarf an Probematerial und Kristalloptimierung. Die beiden vollautomatischen Systeme am LMB ermöglichen die Vorbereitung von bis zu 1.920 Verdampfungsdiffusions-Experimenten in Nanoliter-Tropfen. Der Kürze halber wird vorausgesetzt, dass die Benutzer bereits mit den grundlegenden Funktionen und der Wartung des Nanoliter-Dosiersystems, des Tintenstrahldruckers und des selbstklebenden Plattenverschlusses vertraut sind.Stellen Sie vor Durchführung des Verfahrens sicher, dass die Roboter des Systems initialisiert sind und deren Steuersoftware geöffnet ist. Schalten Sie die Kühlvorrichtung des Rohrkühlers etwa 30 Minuten vor dem Start des Hauptprogramms ein. Platzieren Sie eine Testplatte auf dem motorisierten SBS-Träger des Plattenversiegelungsgeräts.Führen Sie den Plattenversiegler aus und prüfen Sie, ob die Folie ordnungsgemäß aufgebracht wird. Wiederholen Sie diesen Test noch zweimal, um sicherzustellen, dass der Plattenversiegler betriebsbereit ist. Füllen Sie anschließend 20 Liter deionisiertes Wasser in den Hauptbehälter des Flüssigkeithandlers.Trennen Sie die Kupplungseinsätze vom kleineren Behälter mit 20 % Ethanol-Spüllösung und verbinden Sie die Einsätze mit dem Hauptbehälter. Geben Sie den entsprechenden Bildschirmtitel auf dem Touchscreen des Tintenstrahldruckers ein. Öffnen und schließen Sie anschließend die Drehtür, um die Drehung des Karussells auszulösen.Öffnen Sie die Tür, wenn der erste Stapel erscheint. Beladen Sie den ersten Stapel vollständig mit 22 Kristallisationsplatten, wobei jeweils Spalte eins nach außen zeigt. Beladen Sie die nächsten beiden Stapel auf die gleiche Weise vollständig.Laden Sie die verbleibenden sechs Platten in die obersten Positionen des vierten Stapels ein und schließen Sie anschließend die Karusselltür. Vergewissern Sie sich, dass die Anzeige des Kühlgeräts 14 Grad Celsius anzeigt. Invertieren Sie die ausgewählten Screening-Kits sanft und wiederholt für eine Minute.Öffnen Sie dann die Frontplatte des Flüssigkeitshandlers. Öffnen Sie die Röhrchen und platzieren Sie sie in der Kühlhalterung im standardmäßigen 96-Loch-Layout. Nachdem jedes Röhrchen in die Halterung eingesetzt wurde, legen Sie den dazugehörigen Deckel auf das Tablett im gleichen 96-Loch-Layout.Bei Verwendung von System 1 werden die Etikettenleisten in das Tablett im 96-Loch-Format eingelegt, um eine Überprüfung der korrekten Anordnung der Röhrchen zu ermöglichen. Überprüfen Sie die Positionen der Röhrchen und stellen Sie sicher, dass alle Röhrchen waagerecht und fest im Träger sitzen. Schließen Sie anschließend die Frontplatte.Wählen Sie im Startfenster der Flüssigkeitshandler-Software die Option Wartung ausführen und öffnen Sie das Spülprogramm. Führen Sie das Programm aus, um das 20 % Ethanol aus dem System zu spülen und die Außenseiten der Flüssigkeitsdosierspitzen zu reinigen. Wenn das Spülen abgeschlossen ist, klicken Sie auf Abbrechen, um zum Startfenster zurückzukehren.Wählen Sie „Ausführen eines vorhandenen Prozesses“ und klicken Sie auf „Auswahl starten“. Öffnen Sie das MRC-Kit-Dosierprogramm. Geben Sie im Konfigurationsbildschirm 18" bei Instanzen ein und führen Sie das Programm aus. Überwachen Sie das System, während die ersten vier Platten etikettiert, befüllt und versiegelt werden.Lassen Sie das System nicht unbeaufsichtigt, bis die Vorbereitung der ersten vier Platten abgeschlossen ist. Sobald alle 72 Platten vorbereitet und wieder in das Karussell eingesetzt wurden, wechseln Sie die Kopplungseinsätze vom Behälter mit demionisiertem Wasser zum Behälter mit 20 % Ethanol. Führen Sie das Start-Flush-Programm mit dem gleichen Verfahren wie zuvor durch.Schalten Sie die Kältemaschine aus und entsorgen Sie die leeren Screening-Kits. Entfernen Sie vorsichtig die 72 vorbereiteten Platten vom Karussell. Entsorgen Sie falsch befüllte oder schlecht verschlossene Platten.Bewahren Sie die gebrauchsfertigen Platten bei 10 Grad Celsius auf. Stellen Sie zunächst sicher, dass die Roboter des Systems eingeschaltet sind, der Nanoliter-Dosierer mit seiner Software initialisiert ist und der Methoden-Manager des Flüssigkeitshandlers geöffnet ist. Schalten Sie den Kühlträger für Mikroröhrchen etwa 15 Minuten vor dem Start des Hauptprogramms ein.Platzieren Sie eine Testplatte auf dem motorisierten SBS-Träger des Plattenverschlusses. Führen Sie den Plattenverschluss aus und überprüfen Sie, ob die Platte ordnungsgemäß versiegelt ist. Testen Sie den Plattenverschluss dreimal.Danach den Nanoliter-Dosierer starten, um 100-Nanoliter-Tropfen der Testlösung in einer Testplatte abzugeben. Hier ist eine Lichtmikrografie eines 100-Nanoliter-Tropfens dargestellt, der vom Nanoliter-Dosierer erzeugt wurde, wobei die Testlösung mit rotem Farbstoff hergestellt wurde. Schließen Sie die Software des Nanoliter-Dosierers und entfernen Sie den Streifenhalterblock von der Plattform.Danach setzen Sie eine vorab befüllte 96-Loch-Kristallisationsplatte mit der höchsten relativen Menge flüchtiger Reagenzien in ihren Bedingungen in einen speziell entwickelten Plattenhalter ein. Entfernen Sie die Klebefolie von der Platte. Öffnen Sie die Frontblende des Flüssigkeitshandlers, und stellen Sie die nicht versiegelte Platte auf die Arbeitsfläche an der Rückseite des ersten verschiebbaren Trägers.Decken Sie die Platte mit einem SBS-Aluminiumdeckel ab. Setzen Sie den Deckel durch leichtes Andrücken der gegenüberliegenden Ecke in die hintere linke Ecke des Trägers. Bei Verwendung von System 2 sollten Screening-Kits mit erheblichen Mengen flüchtiger Reagenzien zuerst verarbeitet werden.Dadurch wird die Bildung von Kondensat an den SBS-Anschlüssen vermieden, das die automatisierte Handhabung der Anschlüsse oder die Versiegelung der Platte beeinträchtigen könnte. Öffnen, in die verschiebbaren Träger laden und die verbleibenden 19 Platten auf dieselbe Weise abdecken, wobei von den flüchtigsten zu den am wenigsten flüchtigen Bedingungen vorgegangen wird. Sobald der Kühlträger für Mikroröhrchen 4 Grad Celsius erreicht hat, was durch ein grünes Licht angezeigt wird, dessen Abdeckung entfernen.Schneiden Sie die Kappe eines Mikroröhrchens ab, das mindestens 440 Mikroliter einer Proteinprobe enthält. Stellen Sie sicher, dass sich über dem Meniskus kein Schaum befindet, da dieser das Flüssigkeitsdetektionssystem stören würde. Stellen Sie das Röhrchen in Position 1 des Mikroröhrchen-Kühlträgers.Stellen Sie eine PCR-Platte auf die Flüssigkeitshandling-Plattform vor dem Adapterträger für die Plattenbewegung. Schließen Sie dann die Frontblende. Wählen Sie in der Methodeverwaltungsoberfläche des Flüssigkeitshandlers die Option „Platten einrichten“.Überwachen Sie die Initialisierung beider Systeme und tragen Sie die Laufparameter ein, einschließlich der Plattenart und der Anzahl der Tropfen für jede Bedingung, der Tropfengröße, der Position der ersten zu verarbeitenden Platte sowie der Anzahl der Platten. Klicken Sie auf Nein, wenn Sie gefragt werden, ob Sie Hilfe beim Laden des Decks benötigen. Sobald Sie überprüft haben, dass keine Tip-Racks leer sind, klicken Sie auf OK. Sobald Sie überprüft haben, dass ausreichend Tips für den Lauf vorhanden sind, klicken Sie auf OK. Aktualisieren Sie gegebenenfalls das Tip-Management-System und klicken Sie auf OK. Stellen Sie sicher, dass das Deck des Nanoliter-Dispensers frei von dem Strip-Halter-Block ist und dass der Träger sich am hinteren Ende der 50-Mikroliter-Tip-Stapel befindet und diese frei von den Aluminium-SBS-Deckeln sind.Überprüfen Sie nochmals, ob alle anderen erforderlichen Komponenten bereitstehen, und starten Sie dann den Vorgang. Überwachen Sie das System, während der Nanoliter-Dosierer die Tropfen in der ersten Platte absetzt und der Plattenversiegler die Platte anschließend versiegelt. Lassen Sie das System nicht unbeaufsichtigt, bis die Vorbereitung der ersten Platte abgeschlossen ist.Nachdem alle 20 Platten mit Kristallisations-Tröpfchen vorbereitet wurden und automatisch zu den Schiebeplatten zurückgekehrt sind, öffnen Sie die Frontverkleidung und nehmen Sie die Platten vorsichtig heraus. Überprüfen Sie, ob die Platten ordnungsgemäß versiegelt sind, bevor Sie sie zur Kristallisation lagern. Reinigen Sie die SBS-Deckel mit der 20 %igen Ethanol-Lösung, bevor Sie sie auf der linken Seite des Flüssigkeitsmanipulators zum Lagern stapeln.Entsorgen Sie die PCR-Platte und das Mikroröhrchen. Schalten Sie den Kühlträger für Mikroröhrchen aus und wischen Sie die Kondensationsfeuchtigkeit ab. Legen Sie ein Papiertuch auf die gekühlte Oberfläche, um weitere Kondensationsfeuchtigkeit aufzunehmen.Danach den Trägerdeckel ersetzen und die Frontverkleidung schließen. OmpF und MreB wurden anfänglich mithilfe dieser vollautomatisierten Protokolle untersucht. OmpF-Kristalle von ausreichender Qualität für die Röntgenbeugung wurden in Mulde A4 der LMB-7-Platte gefunden.Kristalle von MreB in Diffraktionsqualität wurden in Vertiefung D12 der LMB-20-Platte gefunden. Die Lagerung von Vorinkubationsplatten bei 10 Grad Celsius stellt einen Kompromiss dar, um das Einfrieren zu vermeiden und gleichzeitig die Lagerung bei 4 Grad zu vermeiden, die eine Verschlechterung der Kristallisationsbedingungen und kondensationsbedingte Probleme verursachen könnte. Bei dieser Lagerung können die Platten innerhalb von vier bis fünf Monaten verwendet werden.Jährlich werden zwischen 4 000 und 8 000 LMB-Platten mit System 1 hergestellt und anschließend für die Erstscreening verwendet. Die Protokolle sollten anders optimiert werden, wenn die erwartete Durchsatzmenge deutlich niedriger ist. Normalerweise wird unser gesamter Satz an Vor-Brennstoff-Platten für eine umfassende Erstscreening einer neuen Probe eingesetzt.Jedoch können weniger Platten je nach spezifischen Probenvorgaben ausgewählt werden. Nach der Herstellung der Tröpfchen werden die Platten auf schwingungsarmen Regalen bei genau geregelter Temperatur von 4 oder 18 Grad Celsius gelagert. Die Experimente werden mit Mikroskopen mit Scroll-Lichtquelle ausgewertet.Nach sorgfältiger Untersuchung der Kristallnatur können Merkmale und Ähnlichkeiten unter verschiedenen Bedingungen mit webbasierten Werkzeugen wie den Datenbanken LMB oder C6 Screen analysiert werden. Eine anschließende Optimierung der Kristallisationsbedingungen ist möglicherweise weiterhin erforderlich. Weitere automatisierte Protokolle, einschließlich der Vier-Ecken-Methode und der Additiv-Screenings, sind in unserer Veröffentlichung beschrieben.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Die 3-D-Struktur eines Moleküls liefert ein einzigartiges Verständnis dafür, wie das Molekül Funktionen. Die wichtigste Methode zur Strukturaufklärung in nahezu atomarer Auflösung ist Röntgenstrukturanalyse. Hier zeigen wir die aktuellen Methoden zur Gewinnung von dreidimensionalen Kristallen von jedem Makromolekül, die sich für die Strukturbestimmung mittels Röntgen-Kristallographie.

Proteinkristallisation für X-ray Crystallography

Hierin wird eine Roboter-Ansatz zur Hochdurchsatz-Kristallisation von Membranproteinen in lipidische Mesophasen zur Verwendung in Strukturbestimmung mittels makromolekularen Röntgenkristallographie beschrieben. Drei Roboter in der Lage Umgang mit dem viskosen und klebrigen Protein-beladenen Mesophase integraler Bestandteil der Methode eingeführt werden.

Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Hier beschreiben wir ein allgemeines Verfahren für zufällige microseed Matrix-Screening. Diese Technik wird gezeigt, dass die Erfolgsrate der Proteinkristallisation Screening-Experimenten deutlich erhöhen, reduzieren die Notwendigkeit für Optimierung, und bieten eine zuverlässige Versorgung von Kristallen für die Datenerhebung und-Ligand-Einweichen Experimenten.

Verbesserung der Erfolgsrate der Proteinkristallisation nach Zufall Microseed Matrix Screening

Hier beschreiben wir, wie die automatisierte Screening und Sammlung Datenoptionen verfügbar bei einigen Synchrotron Beamlines verwenden. Wissenschaftler senden Cryocooled Proben an der Synchrotron und die Beugung Eigenschaften gezeigt, die Datensätze gesammelt und verarbeitet werden und, soweit möglich, erfolgt eine Struktur-Lösung – ganz ohne menschliches Zutun.

Völlig autonom Charakterisierung und Datenerfassung aus Kristallen von biologischen Makromolekülen

Ein neuartiger Probenhalter für die makromolekulare Röntgenkristallographie wird zusammen mit einem geeigneten Handhabungsprotokoll vorgestellt. Das System ermöglicht die Kristallwachstum, Kristalleinweichung und in situ Beugungsdatenerfassung bei sowohl Umgebungs- als auch kryogener Temperatur, ohne dass Kristallmanipulationen oder -montage erforderlich sind.

Ein All-in-One-Probenhalter für makromolekulare Röntgenkristallographie mit minimaler Hintergrundstreuung

Strukturstudien von Biomakromolekülen durch Kristallographie erfordern hochwertige Kristalle. Hier zeigen wir ein Protokoll, das von OptiCrys (ein vollautomatisiertes Instrument, das in unserem Labor entwickelt wurde) und/oder Mikrodialysetasten für den Anbau großer hochwertiger Kristalle verwendet werden kann, basierend auf dem Wissen über das Kristallisationsphasendiagramm.

Optimierung des Kristallwachstums für die Neutronenmakromolekulare Kristallographie

Das Signal-Rausch-Verhältnis von Daten ist eine der wichtigsten Überlegungen bei der Durchführung von Röntgenbeugungsmessungen an Mikrokristallen. Die VMXm-Beamline bietet eine geräuscharme Umgebung und mikrostrahlend für solche Experimente. Hier beschreiben wir Probenvorbereitungsmethoden zur Montage und Kühlung von Mikrokristallen für VMXm und andere makromolekulare Kristallographie-Beamlines mit Mikrofokus.

Eine Probenvorbereitungspipeline für Mikrokristalle an der VMXm-Beamline

Hier beschreiben wir, wie die automatisierten makromolekularen Kristallographie-Pipelines für Protein-zu-Struktur, schnelle Liganden-Protein-Komplex-Analyse und großflächiges Fragment-Screening basierend auf der CrystalDirect-Technologie im HTX-Labor in EMBL Grenoble verwendet werden können.

Die automatisierten Kristallographie-Pipelines in der EMBL HTX-Anlage in Grenoble

Dieses Protokoll beschreibt das Hochdurchsatz-Kristallisationsscreening, das von der Vorbereitung der 1.536 Mikroassayplatten bis zum Ende eines 6-wöchigen experimentellen Zeitfensters reicht. Es werden Details über den Probenaufbau, die erhaltene Bildgebung und die Art und Weise enthalten, wie Benutzer Analysen mithilfe einer auf künstlicher Intelligenz basierenden grafischen Benutzeroberfläche durchführen können, um makromolekulare Kristallisationsbedingungen schnell und effizient zu...

Hochdurchsatz-Screening zur Gewinnung von Kristalltreffern für die Proteinkristallographie

Wir präsentieren ein Protokoll für die Kristallisation von Proteinen unter Verwendung der Kristallisationsanlage im Forschungskomplex in Harwell und die anschließende in-situ-Röntgenkristallographie-Datenerfassung von Kristallen innerhalb der Platten an der Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) Beamline von Diamond.  Wir beschreiben Probenanforderungen, Kristallisationsprotokolle und Richtlinien für die Datenerfassung.

Kristallisations- und In-situ-Raumtemperatur-Datenerfassung mit der Kristallisationsanlage in Harwell und der Beamline VMXi, Diamantlichtquelle

Erfahren Sie automatisierte Kristallisationsprotokolle für strukturbiologische Studien von Makromolekülen wie Proteinen, DNA und RNA. Diese Methode ermöglicht die effiziente Herstellung hochwertiger Kristalle für Röntgenbeugung.

Automatische Protokolle für makromolekulare Kristallisation am MRC Laboratory of Molecular Biology

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