Automatische Protokolle für makromolekulare Kristallisation am MRC Laboratory of Molecular Biology

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, aus anfänglichen Kristallisations-Screening-Bedingungen qualitativ hochwertige Kristalle herzustellen. Die Kristalle können verwendet werden, um die Strukturen von Proteinen, DNA, RNA und deren Komplexen zu untersuchen. Irgendetwas an makromolekularen Strukturen ist immer schwieriger geworden.

Und die Bereitstellung einer Vielzahl von Anfangsbedingungen erhöht die Ausbeute an nützlichen Kristallen und reduziert gleichzeitig den Bedarf an Proben- und Kristalloptimierung. Die beiden vollautomatischen Systeme, das LMB, ermöglichen die Vorbereitung von bis zu 1.920 Dampfdiffusionsexperimenten in Nanoliter-Tröpfchen. Der Kürze halber wird davon ausgegangen, dass die Anwender bereits mit den Grundfunktionen und der Wartung des Nanoliter-Dispensers, des Tintenstrahldruckers und des Klebeplatten-Sealers vertraut sind.

Stellen Sie vor dem Ausführen des Vorgangs sicher, dass die Roboter des Systems initialisiert und die Steuerungssoftware geöffnet ist. Schalten Sie den Kühler des Rohrkühlträgers etwa 30 Minuten vor dem Start des Hauptprogramms ein. Platzieren Sie eine Testplatte auf dem motorisierten SBS-Träger des Plattenversiegelungsgeräts.

Lassen Sie das Plattenversiegelungsgerät laufen und prüfen Sie, ob die Folie richtig aufgetragen ist. Wiederholen Sie diesen Test noch zweimal, um sicherzustellen, dass das Plattenversiegelungsgerät bereit ist. Geben Sie dann 20 Liter entionisiertes Wasser in den Hauptbehälter des Liquid Handlers.

Trennen Sie die Kupplungseinsätze aus dem kleineren Behälter mit 20%iger Ethanol-Spüllösung und verbinden Sie die Einsätze mit dem Hauptbehälter. Geben Sie den entsprechenden Bildschirmnamen auf dem Touchscreen des Tintenstrahldruckers ein. Öffnen und schließen Sie dann die Karusselltür, um die Karusselldrehung auszulösen.

Öffnen Sie die Tür, wenn sich der erste Stapel präsentiert. Beladen Sie den ersten Stapel vollständig mit 22 Kristallisationsplatten, wobei jede Säule nach außen zeigt. Laden Sie die nächsten beiden Stapel auf die gleiche Weise vollständig auf.

Legen Sie die restlichen sechs Platten in die höchsten Positionen des vierten Stapels ein und schließen Sie dann die Karusselltür. Vergewissern Sie sich, dass auf dem Display des Kühlers 14 Grad Celsius angezeigt werden. Drehen Sie die ausgewählten Screening-Kits vorsichtig und wiederholt eine Minute lang um.

Öffnen Sie dann die Frontplatte des Liquid Handlers. Öffnen Sie die Röhrchen und legen Sie sie in den Kühlträger in der Standard-96-Well-Konfiguration. Wenn Sie jedes Röhrchen in den Träger einsetzen, setzen Sie den Deckel in der gleichen 96-Well-Anordnung auf das Tablett.

Bei Verwendung von System 1 werden die Etikettenleitungen im 96-Well-Layout auf das Fach gelegt, um eine Gegenkontrolle der korrekten Anordnung der Röhrchen zu ermöglichen. Überprüfen Sie die Rohrpositionen und stellen Sie dann sicher, dass alle Rohre waagerecht und im Träger abgesetzt sind. Schließen Sie dann die Frontblende.

Wählen Sie im Startfenster der Liquid Handler-Software die Option Wartung ausführen und öffnen Sie das Flushing-Programm. Führen Sie das Programm aus, um das 20%ige Ethanol aus dem System zu spülen und die Außenseiten der Flüssigkeitsdosierspitzen zu waschen. Wenn der Leervorgang abgeschlossen ist, klicken Sie auf Abbrechen, um zum Start zurückzukehren.

Wählen Sie Vorhandenen Prozess ausführen und klicken Sie auf Auswahl starten. Öffnen Sie das MRC-Kit-Dosierprogramm. Geben Sie im Konfigurationsbildschirm 18" für Instanzen ein, und führen Sie das Programm aus. Überwachen Sie das System, während die ersten vier Platten beschriftet, gefüllt und versiegelt werden.

Lassen Sie das System nicht unbeaufsichtigt, bis die Vorbereitung der ersten vier Platten abgeschlossen ist. Wenn alle 72 Platten vorbereitet und wieder in das Karussell eingelegt wurden, wechseln Sie die Kupplungseinsätze vom deionisierten Wasserbehälter auf den 20%-Ethanolbehälter. Führen Sie das Startleerungsprogramm mit dem gleichen Verfahren wie zuvor aus.

Schalten Sie den Kühler aus und entsorgen Sie die leeren Rohre des Siebkits. Nehmen Sie die 72 vorbereiteten Platten vorsichtig aus dem Karussell. Entsorgen Sie falsch gefüllte oder schlecht verschlossene Teller.

Lagern Sie die gebrauchsfertigen Platten bei 10 Grad Celsius. Stellen Sie zunächst sicher, dass die Roboter des Systems eingeschaltet sind, der Nanoliter-Dispenser mit geöffneter Software initialisiert ist und der Methodenmanager des Liquid Handlers geöffnet ist. Schalten Sie den Kühlträger für das Mikroröhrchen etwa 15 Minuten vor dem Start des Hauptprogramms ein.

Platzieren Sie eine Testplatte auf dem motorisierten SBS-Träger des Plattenversiegelungsgeräts. Lassen Sie die Plattenversiegelung laufen und stellen Sie sicher, dass die Platte richtig versiegelt ist. Testen Sie das Plattenversiegelungsmittel dreimal.

Lassen Sie dann den Nanoliter-Dispenser laufen, um 100 Nanoliter-Tröpfchen der Testlösung in einer Testplatte abzusetzen. Hier ist eine lichtmikroskopische Aufnahme eines 100-Nanoliter-Tröpfchens, das vom Nanoliter-Dispenser mit der mit rotem Farbstoff hergestellten Testlösung erzeugt wurde. Schließen Sie die Nanoliter-Spendersoftware und entfernen Sie den Streifenhalterblock vom Deck.

Als nächstes setzen Sie eine vorgefüllte 96-Well-Kristallisationsplatte mit der höchsten relativen Menge an flüchtigen Reagenzien unter ihren Bedingungen in einen speziell angefertigten Plattenhalter ein. Entfernen Sie die Klebefolie von der Platte. Öffnen Sie die Frontplatte des Liquid Handlers und legen Sie die unversiegelte Platte auf das Deck an der Rückseite des ersten Schiebeträgers.

Decken Sie die Platte mit einem SBS-Aluminiumdeckel ab. Setzen Sie den Deckel in Richtung der hinteren linken Ecke des Trägers ab, indem Sie sanften Druck auf die gegenüberliegende Ecke des Deckels ausüben. Bei Verwendung von System 2 sollten zuerst Screening-Kits mit erheblichen Mengen an flüchtigen Reagenzien verarbeitet werden.

Dadurch wird vermieden, dass sich Kondenswasser auf den SBS-Leitungen bildet, was zu einer automatischen Handhabung der Leitungen oder einer Plattenversiegelung führen könnte. Entsiegeln Sie, laden Sie sie in die verschiebbaren Träger und decken Sie die restlichen 19 Platten auf die gleiche Weise ab, wobei Sie von den flüchtigsten bis zu den am wenigsten flüchtigen Bedingungen arbeiten. Sobald der Kühlträger des Mikroröhrchens eine Temperatur von 4 Grad Celsius hat, was durch ein grünes Licht angezeigt wird, entfernen Sie die Abdeckung.

Schneiden Sie den Deckel eines Mikroröhrchens ab, das mindestens 440 Mikroliter einer Proteinprobe enthält. Stellen Sie sicher, dass die Probe keinen Schaum über dem Meniskus aufweist, da dies das Flüssigkeitserkennungssystem beeinträchtigen könnte. Platzieren Sie das Röhrchen in Position 1 des Kühlträgers des Mikroröhrchens.

Platzieren Sie eine PCR-Platte auf dem Liquid-Handler-Deck vor dem Adapterträger, der die Platte bewegt. Schließen Sie dann die Frontblende. Wählen Sie in der Methodenverwaltungsschnittstelle des Liquid Handlers die Option Setup Plates aus.

Überwachen Sie die Initialisierung beider Systeme und geben Sie die Laufparameter ein, einschließlich des Plattentyps und der Anzahl der Tropfen für jede Bedingung, der Tropfengröße, der Position der ersten zu verarbeitenden Platte und der Anzahl der Platten. Klicken Sie auf Nein, wenn Sie gefragt werden, ob Sie Hilfe beim Laden des Decks benötigen. Nachdem Sie überprüft haben, dass keine leeren Spitzenablagen vorhanden sind, klicken Sie auf OK. Nachdem Sie überprüft haben, ob genügend Tipps für die Ausführung vorhanden sind, klicken Sie auf OK. Aktualisieren Sie bei Bedarf das Trinkgeldverwaltungssystem und klicken Sie auf OK. Stellen Sie sicher, dass das Nanoliter-Spenderdeck frei vom Streifenhalterblock ist und dass sich der Träger auf der Rückseite der 50-Mikroliter-Spitzenstapel befindet und von den Aluminium-SBS-Deckeln frei ist.

Vergewissern Sie sich, dass alle anderen erforderlichen Komponenten bereit sind, und starten Sie dann den Vorgang. Überwachen Sie das System, während der Nanoliter-Dispenser die Tropfen in der ersten Platte festsetzt und der Plattenversiegeler die Platte anschließend versiegelt. Lassen Sie das System nicht unbeaufsichtigt, bis die Vorbereitung der ersten Platte abgeschlossen ist.

Wenn alle 20 Platten mit Kristallisationströpfchen vorbereitet wurden und automatisch zu den Gleitträgern zurückkehren, öffnen Sie die Frontplatte und entnehmen Sie die Platten vorsichtig. Prüfen Sie, ob die Platten richtig verschlossen sind, bevor Sie sie zur Kristallisation lagern. Reinigen Sie die SBS-Deckel mit der 20%igen Ethanollösung, bevor Sie sie zur Aufbewahrung auf der linken Seite des Liquid Handlers stapeln.

Entsorgen Sie die PCR-Platte und das Mikroröhrchen. Schalten Sie den Kühlträger des Mikroröhrchens aus und wischen Sie das Kondenswasser weg. Lassen Sie ein Papiertuch auf der kühleren Oberfläche, um weiteres Kondenswasser aufzusaugen.

Bringen Sie dann die Abdeckung des Trägers wieder an und schließen Sie die Frontplatte. OmpF und MreB wurden zunächst mit diesen vollautomatischen Protokollen gescreent. OmpF-Kristalle von ausreichender Qualität für die Röntgenbeugung wurden in der Vertiefung A4 der LMB 7-Platte gefunden.

Beugungsqualitätskristalle von MreB wurden in der Vertiefung D12 der LMB 20-Platte gefunden. Die Lagerung von Vorbrennstoffplatten bei 10 Grad Celsius ist ein Kompromiss, um ein Einfrieren und eine Lagerung bei 4 Grad zu vermeiden, was zu einer Verschlechterung der Kristallisationsbedingungen und kondensationsbedingten Problemen führen kann. Bei dieser Lagerung können die Platten innerhalb von vier bis fünf Monaten verwendet werden.

Zwischen 4 und 8.000 LMB-Platten werden jährlich mit System 1 produziert und später für das erste Screening verwendet. Die Protokolle sollten anders optimiert werden, wenn der zu erwartende Umsatz deutlich geringer ist. Unser gesamter Satz von Vorbefeuerungsplatten wird normalerweise als großes Startsieb für eine neuartige Probe verwendet.

Es können jedoch weniger Platten für viel spezifische Probenanforderungen ausgewählt werden. Nach der Aufbereitung der Tröpfchen werden die Platten auf vibrationsarmen Regalen gelagert, wobei die Temperatur streng auf 4 oder 18 Grad Celsius geregelt wird. Die Experimente werden mit Scroll-Lichtquellenmikroskopen ausgewertet.

Nach sorgfältiger Untersuchung der Beschaffenheit der Kristalle können Merkmale und Ähnlichkeiten zwischen den Bedingungen mit webbasierten Tools wie den LMB- oder C6-Screen-Datenbanken analysiert werden. Eine nachträgliche Optimierung der Kristallisationsbedingungen kann noch erforderlich sein. Weitere automatisierte Protokolle mit den 4-Ecken-Methoden und dem additiven Screening sind in unserem Manuskript beschrieben.