Verwendung von Immunolabeling, stabilen, dynamischen und im Entstehen begriffene Mikrotubuli in Zebrafish Embryos zu analysieren

Das übergeordnete Ziel dieser Markierungsverfahren besteht darin, stabile, dynamische und neu entstehende Mikrotubuli im sich entwickelnden Zebrafischembryo abzubilden und zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsneurobiologie zu beantworten, beispielsweise wie Mikrotubuli zur Ausbildung der Zellpolarität beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Detektion und Quantifizierung unterschiedlicher Mikrotubuli-Populationen direkt im Gewebe optimiert.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da es schwer ist, die Integrität der Mikrotubuli aufrechtzuerhalten. Nachdem Sie die gestaffelten Zebrafischembryonen gemäß dem Textprotokoll entchloriert haben, überführen Sie sie in 1,5-mL-Zentrifugenröhrchen und entfernen so viel Medium wie möglich. Geben Sie ein Milliliter 4 % PFA in Mikrotubuli-Assemblierungspuffer oder MAB zu, um die Embryonen bei 28,5 °C fünf Minuten lang zu fixieren.

Verwenden Sie dann eine Pipette, um das Fixansmittel abzusaugen, und ersetzen Sie es durch ein Milliliter frisches Fixansmittel. Inkubieren Sie die Proben drei Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Rüttler. Saugen Sie das Fixansmittel ab und geben Sie ein Milliliter TBS NP-40-Puffer hinzu.

Die Embryonen fünf Minuten lang vorsichtig auf einem Schüttler bewegen. Den Waschschritt noch zweimal wiederholen. Danach den Puffer durch ein Milliliter frisches TBS NP-40 ersetzen und die Embryonen für maximal sieben Tage bei vier Grad Celsius lagern.

Nach dem Entfernen des Dotters und dem Einbetten der Embryonen in Agarose gemäß der schriftlichen Anleitung, geben Sie die Schneidewanne, die mit TBS NP-40 gefüllt ist, in das Vibratom. Erzeugen Sie damit 40 µm dicke Schnitte entlang der größten Achse der in Agarose eingebetteten Embryonen. Übertragen Sie die gewünschten Schnitte mit feiner Pinzette in 500 µL TBS NP-40 in einer 24-Loch-Platte. Entfernen Sie den Puffer und geben Sie 500 µL Blockierungslösung hinzu.

Anschließend die Schnitte bei Raumtemperatur mindestens eine Stunde lang schwenken. Die Blockierungslösung durch 300 Mikroliter primäre Antikörper, in Blockierpuffer verdünnt, ersetzen und die Proben 36 bis 72 Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einem Schüttler inkubieren. Die Proben zweimal mit jeweils 600 Mikroliter TBS NP-40 waschen.

Platzieren Sie sie für jeweils 30 Minuten auf einem Schüttler bei Raumtemperatur. Geben Sie 300 Mikroliter fluorophor-konjugierte sekundäre Antikörper, die in Blockierpuffer verdünnt wurden, zu den Schnitten hinzu und inkubieren Sie sie 16 bis 24 Stunden lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius auf einem Schüttler. Anschließend waschen Sie die Proben zweimal, wie gerade gezeigt.

Fügen Sie anschließend 500 Mikroliter DAPI-Lösung zu den Embryonen hinzu und inkubieren Sie diese 30 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Proben danach dreimal mit TBS NP-40 je fünf Minuten bei Raumtemperatur. Geben Sie nach den Waschschritten einen Tropfen Einbettmedium mit Anti-Fade-Agens in die Mitte einer staubfreien Objektträger.

Verwenden Sie feine Pinzetten, um die Schnitte auf den Tropfen des Montagemediums zu übertragen. Anschließend legen Sie eine staubfreie Deckglas auf die Probe. Bewahren Sie die Objektträger, in Folie gewickelt, an einem trockenen, dunklen und kühlen Ort auf, bis die Bildaufnahme erfolgt.

Erstellen Sie mithilfe der im Textprotokoll beschriebenen Details Z-Stack-Konfokalbilder mit Kanaleinstellungen für die ausgewählten Fluorophore der sekundären Antikörper und speichern Sie die Bilddateien. Öffnen Sie die Datendateikopie mit einer 3D-Analyse-Software wie Image J. Erzeugen Sie ein kombiniertes Bild, indem Sie die gewünschten Kanäle überlagern, indem Sie Bild, Farbe, Kanäle kombinieren auswählen.

Wählen Sie die 594 Nanometer, 488 Nanometer und DAPI-Kanäle aus, um sie fälschlicherweise rot, grün bzw. blau einzufärben. Überprüfen, erstellen Sie eine Zusammensetzung und wählen Sie „OK“. Visualisieren Sie den zusammengeführten Z-Stack als einzelnes 2D-Bild, indem Sie eine Projektion mit maximaler Intensität des Z-Stacks über Bilder, Stapel, Z-Projektion durchführen.

Geben Sie die Start- und Endpositionen der inneren besten Z-Ebenen als Startfolie bzw. Stopp-Schnitt an. Wählen Sie „maximale Intensität“ als Projektionsart aus und klicken Sie auf „OK“. Wählen Sie in der 3D-Analyse-Software „Bibliothek erstellen“ aus und vergeben Sie einen aussagekräftigen Namen für die Bildbibliothek.

Klicken Sie, erstellen Sie und ziehen Sie Rohbilddateien in die Bibliothek. Wählen Sie anschließend eine Datei zur Analyse aus. Wählen Sie dann im Ansicht-Menü die erweiterte Fokussierung, um das kanalübergreifend zusammengesetzte Bild im Hauptfenster anzuzeigen.

Wählen Sie das Freihand-Auswahlwerkzeug und umranden Sie den Bereich, der analysiert werden soll. Wählen Sie die Registerkarte „Aktionen“ und anschließend „Auswahl zuschneiden“, um das Bild zuzuschneiden. Speichern Sie anschließend die zugeschnittene Bilddatei unter einem neuen Namen.

Klicken Sie anschließend auf den Reiter „Measurements“, um das Protokoll zur Filterung spezifischer Objekte zu erstellen, die für die 3D-Analyse relevant sind. Ziehen Sie dann „Find Objects“ in das Protokollfenster und benennen Sie das erste Protokoll in „DAPI“ um. Wählen Sie den Beta-Tubulin-Kanal im Dropdown-Menü aus.

Ziehen Sie anschließend die folgenden Einstellungen auf das Beta-Tubulin-Protokoll und platzieren Sie sie unter „Objekte finden“ in der folgenden Reihenfolge: Löcher und Objekte füllen, sich berührende Objekte trennen, Objekte nach Größe ausschließen und Objekte ausschließen, die ROIs nicht berühren. Wählen Sie nun unten in jedem Protokoll „Messen“ aus.

Danach für alle Kanäle mit Ausnahme von DAPI Intensitäts- und Volumenmessung sowie Skelett-Länge für alle Tubulin-Färbungen auswählen. Ein ROI um den zu messenden Bereich zeichnen. Unter der Registerkarte „Zusammenfassung“ die Messwerte beobachten, nachdem die Software den Bereich verarbeitet hat.

Kopieren Sie anschließend die Daten und speichern Sie sie in einer bearbeitbaren Tabellenkalkulation, wie hier gezeigt. Um eine Durchflussvorrichtung mit mehreren Vertiefungen herzustellen, teilen Sie mithilfe einer Vorrichtung oder einer Bandsäge ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen längs in zwei Hälften. Schneiden Sie aus einem 70-Mikrometer-Nylonnetz sieben Halbkreise mit einem Radius von drei Zentimetern aus und kürzen Sie sie so, dass sie genau in eine Hälfte des geteilten Zentrifugenröhrchens passen.

Unter Verwendung eines aquariumsicheren Silikondichtmittels die Halbkreise parallel zu den 10-Milliliter-Graduierungen in das Zentrifugenröhrchen kleben. Nachdem das Gerät zwei Tage lang getrocknet wurde, spülen Sie es, indem Sie es zwei bis drei Stunden in einem Becher mit Wasser einweichen. Den oberen gewindegängigen Ende des abgeschnittenen Zentrifugenröhrchens mit Modelliermasse auskleiden, sodass die Höhe der in der Durchflussvorrichtung zurückgehaltenen Flüssigkeit eine Tiefe von einem Viertel Zoll aufweist.

Bereiten Sie die Auswaschapparatur vor, indem Sie den Kolben aus einer 50-Milliliter-Spritze entfernen und 30 cm feines Schlauchmaterial in die Spitze einführen. Drücken Sie den Schlauch so weit wie möglich hinein und versiegeln Sie die Verbindung mit Modellierknetmasse. Befeuchten Sie mit Embryomedium das Netz, damit die Flüssigkeit durch die gesamte Durchflussvorrichtung laufen kann.

Stellen Sie das Gerät auf Eis so schräg, dass die Flüssigkeit in alle Kammern fließt, aber am vorderen Ende, wo sich der Tonwulst befindet, weiterhin austritt. Befestigen Sie die Spülapparatur an einem Stativ über der Durchflussvorrichtung auf Eis. Kühlen Sie 200 Milliliter Embryomedium auf Eis und geben Sie eine ausreichende Menge in die Spülapparatur, um sicherzustellen, dass alle Luftblasen entfernt werden und die Durchflussrate etwa sieben Milliliter pro Minute beträgt.

Stellen Sie die Fließgeschwindigkeit durch Verändern der Höhe der Spritze ein. Nachdem die Embryonen entchloret und Nocodazol gemäß dem Textprotokoll vorbereitet wurden, verwenden Sie 10 Milliliter kalte Nocodazol-Arbeitslösung, um das Medium der Embryonen in der Nocodazol-Behandlungsgruppe auszutauschen. Stellen Sie die Petrischalen für eine der Entwicklungsstufe angemessene Zeit auf Eis.

Danach mithilfe einer an der Flamme geglätteten Ein-Milliliter-Glaspipette die Embryonen unter Verwendung separater Kammern für jede Versuchsgruppe in die Durchflussapparatur überführen. Den Nocodazol-Washout beginnen, indem kaltes Embryomedium auf Eis in die Oberseite der 50-Milliliter-Spritze gegossen wird. Den Mikrotubuli ermöglichen, sich nach 20 Minuten Washout bei Raumtemperatur wieder zu bilden, indem mit einer an der Flamme geglätteten Ein-Milliliter-Glaspipette die Embryonen in Glaspetrischalen mit warmem Embryomedium überführt werden.

Sobald die Embryonen übertragen sind, starten Sie einen Timer. Fixieren Sie schließlich die Kontroll- und Washout-Embryonen nach einer, fünf und zehn Minuten, indem Sie jeweils etwa 10 Embryonen in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen pipettieren, das mit einem Milliliter 4 % PFA-MAB-Fixans entfüllt ist, und fixieren Sie die Proben wie zuvor in diesem Video gezeigt. Verwenden Sie Glu-Tubulin und Tyr-Tubulin als Marker für stabile und dynamische Mikrotubuli.

Dynamische Mikrotubuli dominieren im Zwischenhirn im Stadium der Neuralanlage. Während die Anlage sich zum Neuralrohr entwickelt, einem Stadium verstärkter Epithelialisierung, sind qualitativ weniger Mikrotubuli immunreaktiv mit dem Anti-Tyr-Tubulin-Antikörper, insbesondere im ventralen Bereich des Neuralrohrs. Im Gegensatz dazu ist Glu-Tubulin im gesamten Bereich der Neuralanlage diffus und punktförmig verteilt, zeigt aber entlang der Mikrotubuli-Trakte eine Anreicherung im ventralen Neuralrohr.

Pfeilspitzen zeigen auf spezifische Mikrotubuli-Bündel oder -strukturen, an denen die Markierung verstärkt ist. Die Behandlung mit Nocodazol führt zur Depolymerisation der Mikrotubuli, was eine diffuse Markierung zur Folge hat. Beim Wiederaufwachsen der Mikrotubuli verlängern sie sich ausgehend vom Centrosom.

Dies ist jedoch in einer einzelnen Ebene aufgrund ihrer nicht-ebenen Trajektorien möglicherweise nicht offensichtlich. Dennoch können einige Bildanalyse-Softwareprogramme Längen in 3D messen, wodurch eine Beurteilung des Mikrotubuli-Wachstums nach dem Nocodazol-Waschgang ermöglicht wird. Die mittlere Länge der Mikrotubuli scheint in allen analysierten Regionen des Neuralrohrs mit der Zeit nach dem Nocodazol-Waschgang zuzunehmen.

Nach Abschluss der Datenanalyse mit der 3D-Bildanalyse-Software und nach erfolgter Qualitätskontrolle können nützliche Informationen aus den Rohdaten gewonnen werden, wie beispielsweise die durchschnittliche Länge aller Mikrotubuli sowie der stabilen Mikrotubuli und das Verhältnis stabiler zu gesamten Mikrotubuli. Wenn die Methode einmal beherrscht ist, dauert sie von Anfang bis Ende nicht länger als eine Woche. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, Proben rechtzeitig zu sammeln und zu verarbeiten, da Mikrotubuli leicht depolymerisieren.

Dieses Verfahren kann auch zur Analyse von Mutanten angewendet werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man unterschiedliche Mikrotubuli-Populationen im intakten Embryo erfassen kann.