Mikrokristallographie von Proteinkristallen und In Cellulo Beugung

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Einführung von Röntgenkristallographie-Methoden, die auf Mikrokristalle angewendet werden, insbesondere auf solche, die in Zellen hergestellt werden, die als In-vivo-Kristalle gelten. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er einen einfachen und effizienten Prozess zur Herstellung, Detektion und Analyse von Mikrokristallen bietet. Diese Methode zielt darauf ab, die Verwendung von Mikrokristallen zu erleichtern, indem Kristalle verwendet werden, die in lebenden Zellen gezüchtet werden, wodurch komplexe Reinigungsprozesse und Aprocox-Sedierungsversuche überflüssig werden.

In diesem Video konzentrieren wir uns auf die einfache Vorbereitung und Manipulation von Röntgenablenkungsexperimenten an einer Synchrotron-Beamline. Wir zeigen die Schritte, die sich am meisten von der klassischen Kristallographie unterscheiden. In dieser Demonstration werden wir Kristalle aus dem lebenswichtigen Polyederprotein verwenden, die erfolgreich gezüchtet wurden, aber die Methode kann auch auf Proteine angewendet werden, die Kristalle in Bakterien-, Insekten-, Säugetier- oder Hefezellen bilden.

Inkubieren Sie zunächst 30 Milliliter Sf9-Zellen über der Expression des Cypovirus-Polyederproteins drei Tage lang bei 27 Grad Celsius auf einer rotierenden Plattform. Übertragen Sie 500 Mikroliter Sf9-Zellkultur mit einer sterilen serologischen Pipette in ein Mikrozentrifugenröhrchen und achten Sie darauf, dass die Sterilität der Hauptkultur aufrechterhalten wird, indem Sie eine Biosicherheitswerkbank der Klasse II verwenden und aseptische Standardtechniken befolgen. Pipettieren Sie fünf Mikroliter Zellen aus dem Mikrozentrifugenröhrchen auf einen Objektträger.

Winkeln Sie dann vorsichtig einen Glasdeckel über die Probe an, wobei eine Kante den Tropfen berührt, und senken Sie den Deckglas vorsichtig auf die Flüssigkeit ab, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Als nächstes bildest du den Objektträger mit einem inversen Mikroskop ab. Untersuchen Sie die Zellen sorgfältig, beginnend mit 200-facher Vergrößerung und zoomen Sie mit maximaler Vergrößerung, wenn Sie einen potenziellen Kristall erkennen.

Achten Sie auf scharfe Kanten und Änderungen der Fraktur. Wenn Kristalle identifiziert werden, untersuchen Sie die Kultur täglich, um das Kristallwachstum zu überwachen, indem Sie die vorherigen Schritte wiederholen. Bei Sf9-Zellen wird die Kultur in ein Zentrifugenröhrchen umgefüllt.

Legen Sie das Rohr auf Eis und fahren Sie so schnell wie möglich mit dem nächsten Schritt fort. Für die Isolierung von kristallhaltigen Zellen pipettieren Sie vier Milliliter infizierter Sf9-Zellen in ein Röhrchen, das für die Durchflusszytometrie-Analyse geeignet ist. Bereiten Sie ein zweites Röhrchen mit einer entsprechenden Anzahl von Sf9-Zellen aus einer simulierten infizierten Kultur als Kontrolle vor.

Als nächstes fügen Sie beiden Proben Propidiumiodid bis zu einer Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter hinzu, kurz bevor die durchflusszytometrische Auswertung durchgeführt wird. Bringen Sie nun Kontrollprobenzellen auf ein Standard-Durchflusszytometer an, das in der Lage ist, die Zellen nach FSC und SSC zu sortieren. Analysieren Sie mindestens 20.000 Ereignisse.

Nachdem Sie tote Zellen, Zellklumpen und Ablagerungen aus der Analyse verworfen haben, generieren Sie das Diagramm FSC zu SSC. Analysieren Sie anschließend mindestens 20.000 Ereignisse der kristallhaltigen Probe. Vergleichen Sie das Diagramm von FSC zu SSC mit der Kontrolle, und suchen Sie nach dem Erscheinungsbild einer eindeutigen Population, die kristallhaltigen Zellen entspricht.

Definieren Sie die Gates um die kristallhaltige Zellpopulation, die normalerweise bei höherem SSC oder FSC auftreten. Mit diesem Gating sortieren Sie etwa 150.000 bis 200.000 der kristallhaltigen Zellen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit 50 Mikrolitern PBS-Puffer vorgefüllt ist. Bilden Sie die sortierten Proben wie zuvor beschrieben durch Lichtmikroskopie ab, um zu bestätigen, welche Population mit kristallhaltigen Zellen assoziiert ist.

In diesem Stadium können Zellen mit Lösungen mit schweren Atomen inkubiert werden, wenn eine experimentelle Phaseneinteilung erforderlich ist. Dieser Ansatz folgt dem Screening verschiedener Verbindungen und Inkubationszeiten, wie im Text und in anderen Übersichtsarbeiten beschrieben. Richten Sie die Werkzeuge für die Montage der Probe ein, indem Sie zuerst ein Mikronetz an einem Stift am Ende eines Magnetstabs befestigen.

Platzieren Sie den Stab seitlich in der Spalte einer Dialyse-Schwimmboje. Nehmen Sie dann mit einer Pinzette einen Papierdocht und verschließen Sie sie. Vergewissern Sie sich, dass die Einrichtung abgeschlossen ist, bevor Sie fortfahren.

Mischen Sie nun die Zellen mit einem gleichen Volumen von 0,4 %Trypanblau-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 0,2 %Nach dem Resuspendieren der Zellen pipettieren Sie 0,5 Mikroliter der sortierten Zellen auf das Mikronetz. Nachdem Sie die Zellen auf der Mikronetzoberfläche abgelagert haben, entfernen Sie den größten Teil der überschüssigen Flüssigkeit, indem Sie sie mit einem Papierdocht abtupfen. Wenn das Mikronetz nicht ausreichend getupft ist, befinden sich die Zellen in unterschiedlichen Tiefen in der überschüssigen Flüssigkeit, was ihre Ausrichtung auf den Röntgenstrahl am Synchrotron erschwert.

Darüber hinaus erhöht die überschüssige Flüssigkeit die Hintergrund-Röntgenstreuung. Wenn das Mikronetz zu stark getupft wird, wird die Flüssigkeit vollständig entfernt und die Probe wird nicht in den Gitteröffnungen gehalten. Bei optimaler Blottung verbleibt nur eine dünne Flüssigkeitsschicht auf dem Mikronetz, die die Probe schützt und in die Gitteröffnungen drückt.

Bei einigen Kristallen ist die Verwendung eines Kryoprotektivums erforderlich. Dies ist in unserem Fall nicht erforderlich, aber die Vorgehensweise wäre die gleiche wie beim Auftragen der Probe und dem anschließenden Abtupfen. Stellen Sie sicher, dass nur eine dünne Schicht Flüssigkeit übrig bleibt.

Kühlen Sie das Mikronetz sofort in flüssigem Stickstoff ab und übertragen Sie es auf einen Roboterpuck für den Transport zu einer Synchrotron-Mikrofokus-Beamline. Aufgrund der geringen Größe von in vivo-Kristallen können Sie Fraktionsdaten auf einer Mikrofokus-Kristallographie-Beamline sammeln. Montieren Sie zunächst das Mikronetz auf dem Goniometer.

Beginnen Sie nun damit, das Mikronetz mit dem Strahlengang zu zentrieren, wobei Sie die Ausrichtung von der Fläche nach oben und von der Seite verwenden. Wenn das Mikronetz mit der Vorderseite nach oben zeigt, können Sie die Ausrichtung fein abstimmen, indem Sie die Mitte einer der horizontalen Fahrspuren des Mikronetzes ausrichten. Sammeln Sie Daten entlang dieser horizontalen Fahrspur mit nur geringfügigen Anpassungen an der Achse.

Sobald alle Kristalle der Fahrspur getestet wurden, gehen Sie zur nächsten Fahrspur und wiederholen Sie den Ausrichtungsvorgang. Stellen Sie sicher, dass die verarbeiteten Bahnen eindeutig gekennzeichnet sind, damit Kristalle nicht übersehen oder zweimal abgeschossen werden, wobei Sie sich an der Farbänderung in Trypanblau orientieren. Es wird ein Überblick über zwei Methoden zur Strukturbestimmung mit in vivo Mikrokristallen gegeben.

Die obere Reihe beschreibt den klassischen Ansatz der Reinigung von Kristallen aus Zellen, während die untere Reihe den In-Cellulo-Kristallographie-Ansatz zeigt, bei dem die Kristalle für die Datenerfassung in den Wirtszellen verbleiben. Für den In-Cellulo-Ansatz wird das Durchflusszytometrie-Profil von nicht infizierten Zellen mit einem Profil von kristallhaltigen Zellen verglichen und verwendet, um zu bestimmen, welche Zellpopulation ausgewählt werden sollte, um kristallhaltige Zellen von den anderen Zellen zu trennen. In diesem Beispiel weisen Zellen, die Polyeder enthalten, eine höhere Seitenstreuung auf als nicht infizierte Zellen.

Mit Trypanblau gefärbte Zellen können mit Kameras, die an den meisten Synchrotron-Beamlines verfügbar sind, leicht sichtbar gemacht werden. Während gereinigte Kristalle aufgrund ihrer geringen Größe mühsam zu identifizieren und mit dem Röntgenstrahl auszurichten sind, ist es bei der Datenerfassung am besten, in einem Gittermuster vorzugehen, um Zentrierungsvorgänge zu minimieren und zu vermeiden, dass dieselbe Zelle oder derselbe Kristall zweimal belichtet wird oder Zellen und Kristalle fehlen. Einmal gemeistert, dauert es von der Ernte der kristallhaltigen Zellen bis zur Datenerfassung etwa einen halben Tag.

Dieses Verfahren ist kompatibel mit Heavy-Atom-Soaks für experimentelle Phasen. Im Fall des Polyeders wurde die normale Struktur innerhalb von acht Tagen nach Beginn der Proteinexpression erreicht. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit flüssigem Stickstoff äußerst gefährlich sein kann und dass Vorkehrungen gegen Erstickung und Verbrennungen getroffen werden müssen.