Mikrokristallographie von Proteinkristallen und

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Methoden der Röntgenkristallographie vorzustellen, die auf Mikrokristalle angewendet werden, insbesondere auf solche, die in Zellen gebildet werden und als Kristalle in vivo betrachtet werden. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes liegt darin, dass er ein einfaches und effizientes Verfahren zur Herstellung, Detektion und Analyse von Mikrokristallen bietet. Diese Methode zielt darauf ab, die Nutzung von Mikrokristallen zu erleichtern, indem Kristalle verwendet werden, die innerhalb lebender Zellen gezüchtet wurden, wodurch der Bedarf an komplexen Reinigungsverfahren und Aprocox-Sedierungstests entfällt.

In diesem Video konzentrieren wir uns auf die einfache Vorbereitung und Handhabung für Röntgenbeugungsexperimente an einer Synchrotron-Strahllinie. Wir zeigen die Schritte, die sich am stärksten von der klassischen Kristallographie unterscheiden. In dieser Demonstration verwenden wir Kristalle des vitalen Polyhedronproteins, die erfolgreich gezüchtet wurden, doch die Methode kann ebenfalls auf Proteine angewandt werden, die Kristalle in bakteriellen, insecten-, säugetier- oder hefetypischen Zellen bilden.

Zunächst inkubieren Sie 30 Milliliter Sf9-Zellen, die das Polyhedrinprotein des Cypovirus überexprimieren, drei Tage lang bei 27 Grad Celsius auf einer rotierenden Plattform. Überführen Sie 500 Mikroliter der Sf9-Zellkultur mit einer sterilen serologischen Pipette in ein Mikrozentrifugenröhrchen, wobei darauf geachtet werden muss, dass die Sterilität der Hauptkultur durch die Verwendung eines Biosicherheitswerkbanks der Klasse II und die Einhaltung standardmäßiger aseptischer Techniken gewahrt bleibt. Pipettieren Sie fünf Mikroliter der Zellen aus dem Mikrozentrifugenröhrchen auf einen Objektträger.

Dann kippen Sie vorsichtig einen Glasdeckel über die Probe, wobei eine Kante den Tropfen berührt, und senken Sie den Deckel vorsichtig auf die Flüssigkeit ab, wobei die Bildung von Luftblasen vermieden werden sollte. Anschließend wird die Probe mit einem umgekehrten Mikroskop abgebildet. Untersuchen Sie die Zellen sorgfältig, beginnend mit einer 200fachen Vergrößerung, und erhöhen Sie die Vergrößerung auf das Maximum, sobald ein potenzieller Kristall erkannt wird.

Suchen Sie nach scharfen Kanten und Veränderungen der Brechungsindex. Wenn Kristalle identifiziert wurden, untersuchen Sie die Kultur täglich, um das Kristallwachstum durch Wiederholung der vorherigen Schritte zu überwachen. Für Sf9-Zellen die Kultur in ein Zentrifugenröhrchen überführen, um sie zu ernten.

Stellen Sie das Röhrchen auf Eis und fahren Sie so schnell wie möglich mit dem nächsten Schritt fort. Für die Isolierung von kristallhaltigen Zellen pipettieren Sie vier Milliliter infizierter Sf9-Zellen in ein Röhrchen, das für die Durchflusszytometrie-Analyse geeignet ist. Bereiten Sie ein zweites Röhrchen mit einer äquivalenten Anzahl von Sf9-Zellen aus einer Kontrollkultur (mock-infiziert) als Kontrolle vor.

Fügen Sie anschließend beiden Proben Propidiumjodid bis zu einer Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter hinzu, kurz vor der Durchflusszytometrie. Geben Sie nun Zellen der Kontrollprobe auf einen Standard-Durchflusszytometer, der in der Lage ist, Zellen entsprechend FSC und SSC zu sortieren. Analysieren Sie mindestens 20.000 Ereignisse.

Nachdem tote Zellen, Zellklumpen und Trümmer von der Analyse ausgeschlossen wurden, erstellen Sie das FSC-zu-SSC-Diagramm. Anschließend analysieren Sie mindestens 20.000 Ereignisse der kristallhaltigen Probe. Vergleichen Sie das FSC-zu-SSC-Diagramm mit der Kontrolle und achten Sie auf das Auftreten einer deutlichen Population, die kristallhaltigen Zellen entspricht.

Definieren Sie die Tore um die kristallhaltige Zellpopulation, die gewöhnlich bei höherem SSC oder FSC erscheint. Sortieren Sie anhand dieser Tore etwa 150.000 bis 200.000 kristallhaltige Zellen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das zuvor mit 50 Mikrolitern PBS-Puffer gefüllt wurde. Untersuchen Sie die sortierten Proben mittels Lichtmikroskopie wie zuvor beschrieben, um zu bestätigen, welche Population mit kristallhaltigen Zellen assoziiert ist.

Zu diesem Zeitpunkt können die Zellen mit Lösungen schwerer Atome inkubiert werden, falls eine experimentelle Phasenbestimmung erforderlich ist. Dieser Ansatz folgt der Untersuchung verschiedener Verbindungen und Inkubationszeiten, wie im Text und in anderen Übersichtsarbeiten beschrieben. Bereiten Sie die Werkzeuge zur Probenaufnahme vor, indem Sie zunächst ein Mikrogitter, das auf einer Nadel befestigt ist, an das Ende eines magnetischen Stabs anbringen.

Platzieren Sie den Stab seitlich in die Nut eines Dialyseschwimmers. Nehmen Sie dann mit einer Pinzette einen Papierdocht auf und verriegeln Sie diese. Überprüfen Sie nochmals, ob der Aufbau vollständig ist, bevor Sie fortfahren.

Mischen Sie die Zellen nun mit einem gleichen Volumen einer 0,4 %igen Trypanblaulösung, um eine Endkonzentration von 0,2 % zu erreichen. Nach dem erneuten Aufschwemmen der Zellen pipettieren Sie 0,5 Mikroliter der sortierten Zellen auf das Mikrogitter. Nachdem die Zellen sich auf der Oberfläche des Mikrogitters abgesetzt haben, entfernen Sie den größten Teil der überschüssigen Flüssigkeit, indem Sie sie mit einem Papierdocht abblotten. Falls das Mikrogitter nicht ausreichend abgeblottet wird, befinden sich die Zellen in unterschiedlichen Tiefen innerhalb der überschüssigen Flüssigkeit, was ihre Ausrichtung zum Röntgenstrahl am Synchrotron erschweren wird.

Außerdem erhöht die überschüssige Flüssigkeit die Hintergrundstreuung von Röntgenstrahlen. Wird das Mikrogitter zu stark abgetupft, wird die Flüssigkeit vollständig entfernt, und die Probe bleibt nicht in den Gitteröffnungen erhalten. Bei optimaler Abtupfung verbleibt lediglich eine dünne Flüssigkeitsschicht auf dem Mikrogitter, die die Probe schützt und in die Gitteröffnungen zwingt.

Einige Kristalle erfordern die Verwendung eines Kryoschutzmittels. Dies ist in unserem Fall nicht erforderlich, aber das Vorgehen wäre dasselbe wie beim Auftragen der Probe und anschließendem Abtupfen. Stellen Sie sicher, dass nur eine dünne Flüssigkeitsschicht verbleibt.

Kühlen Sie das Mikrogitter sofort in flüssigem Stickstoff ab und übertragen Sie es auf einen Roboterpuck für den Transport zu einer Synchrotron-Mikrofokus-Strahllinie. Aufgrund der geringen Größe der In-vivo-Kristalle sammeln Sie Bruchstück-Daten an einer Mikrofokus-Kristallographie-Strahllinie. Bringen Sie zunächst das Mikrogitter am Goniometer an.

Beginnen Sie nun damit, das Mikrogitter mittels der frontalen und seitlichen Ausrichtung auf die Strahlachse zu zentrieren. Stellen Sie bei frontaler Ausrichtung des Mikrogitters die Ausrichtung fein ab, indem Sie das Zentrum einer der horizontalen Bahnen des Mikrogitters ausrichten. Sammeln Sie die Daten entlang dieser horizontalen Bahn mit nur geringfügigen Nachjustierungen der Ausrichtung.

Nachdem alle Kristalle der Spur getestet wurden, fahren Sie mit der nächsten Spur fort und wiederholen Sie den Ausrichtungsprozess. Stellen Sie sicher, dass die bereits bearbeiteten Spuren eindeutig gekennzeichnet sind, damit keine Kristalle übersehen oder zweimal mittels der Farbänderung durch Trypanblau behandelt werden. Ein Überblick über zwei Methoden zur Strukturbestimmung unter Verwendung von in-vivo-Mikrokristallen wird präsentiert.

Die obere Zeile beschreibt die klassische Methode, bei der Kristalle aus Zellen gereinigt werden, während die untere Zeile den Ansatz der In-cellulo-Kristallographie zeigt, bei dem die Kristalle für die Datensammlung in den Wirtszellen verbleiben. Bei der In-cellulo-Methode wird das Durchflusszytometrieprofil nicht infizierter Zellen mit dem Profil kristallhaltiger Zellen verglichen, um zu bestimmen, welche Zellpopulation ausgewählt werden sollte, um kristallhaltige Zellen von den anderen Zellen zu trennen. In diesem Beispiel weisen Zellen, die Polyeder enthalten, eine stärkere seitliche Streuung auf als nicht infizierte Zellen.

Mit Trypanblau gefärbte Zellen können mithilfe von Kameras, die an den meisten Synchrotron-Strahllinien verfügbar sind, leicht visualisiert werden. Da gereinigte Kristalle aufgrund ihrer geringen Größe mühsam zu identifizieren und mit dem Röntgenstrahl auszurichten sind, ist es beim Datensammeln am besten, ein Rastermuster zu verfolgen, um Zentrierprozeduren zu minimieren und eine doppelte Belichtung derselben Zelle oder desselben Kristalls oder das Übersehen von Zellen und Kristallen zu vermeiden. Wenn man den Ablauf einmal beherrscht, dauert dieser Durchlauf etwa einen halben Tag, von der Ernte der kristallhaltigen Zellen bis zur Datensammlung.

Dieses Verfahren ist mit der Behandlung mit Schwermetallatomen zur experimentellen Phasenbestimmung kompatibel. Im Fall des Polyeders wurde die normale Struktur innerhalb von acht Tagen ab Beginn der Proteinexpression erhalten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit flüssigem Stickstoff äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen gegen Erstickung und Verbrennungen getroffen werden müssen.