Name: Mikrokristallographie von Proteinkristallen und In Cellulo Beugung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Erfahren Sie die Röntgenkristallographie von Mikrokristallen in lebenden Zellen. Diese Methode vereinfacht die Kristallherstellung und eliminiert aufwendige Reinigungsprozesse für strukturbiologische Analysen.

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Die Autoren möchten Chan-Sien Lay für die Bereitstellung von Bildern von gereinigten Mikrokristallen, Daniel Eriksson und Tom Caradoc-Davies für die Unterstützung bei der MX2-Strahllinie des australischen Synchrotron und Kathryn Flanagan und Andrew Fryga aus der FlowCore-Anlage an der Monash University für ihre Unschätzbare Hilfe

<ol><li>Tari, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+structural+biology+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Bio+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">The utility of structural biology in drug discovery.</a> Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).</li>
<li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (2), 0(2014).</li>
<li>Redecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natively+inhibited+Trypanosoma+brucei+cathepsin+B+structure+determined+by+using+an+X-ray+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser.</a> Science. 339 (2013), 227-230 (2013).</li>
<li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="https://elifesciences.org/articles/01345">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2 (0), e01345(2013).</li>
<li>Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/0889311X.2010.527964">Macromolecular microcrystallography.</a> Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).</li>
<li>Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-crystallography+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Micro-crystallography comes of age.</a> Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).</li>
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<li>Nelson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+cross-beta+spine+of+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils.</a> Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).</li>
<li>Coulibaly, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+organization+of+cypovirus+polyhedra%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular organization of cypovirus polyhedra.</a> Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).</li>
<li>Coulibaly, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atomic+structure+of+baculovirus+polyhedra+reveals+the+independent+emergence+of+infectious+crystals+in+DNA+and+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).</li>
<li>Johansson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+photosynthetic+reaction+centre+determined+by+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography.</a> Nat Comm. 4, (2013).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+Cryo-cooling+Crystals+of+Membrane+Proteins+Grown+in+Lipidic+Mesophases+for+Structure+Determination+by+Macromolecular+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
<li>Roedig, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micro-patterned+silicon+chip+as+sample+holder+for+macromolecular+crystallography+experiments+with+minimal+background+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering.</a> Sci Rep. 5, 10451(2015).</li>
<li>Koopmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+crystallization+opens+new+routes+in+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology.</a> Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).</li>
<li>Gallat, F. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+crystallography+at+X-ray+free-electron+lasers%3A+the+next+generation+of+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Phil+Trans+R+Soc+B%22%5BJournal%5D)">In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology.</a> Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497(2014).</li>
<li>Duszenko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+crystallization+in+combination+with+highly+brilliant+radiation+sources+offers+novel+opportunities+for+the+structural+analysis+of+post-translationally+modified+eukaryotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst.+F%22%5BJournal%5D)">In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins.</a> Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).</li>
<li>Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+cellulo+structure+determination+of+a+novel+cypovirus+polyhedrin%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin.</a> Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).</li>
<li>Sawaya, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystal+structure+obtained+at+2.9+%C3%85+resolution+from+injecting+bacterial+cells+into+an+X-ray+free-electron+laser+beam%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).</li>
<li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Diffraction-Quality+Protein+Crystal+Processed+as+an+Autophagic+Cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo.</a> Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).</li>
<li>Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipeline+for+structure+determination+of+in+vivo-grown+crystals+using+in+cellulo+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction.</a> Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).</li>
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<li>Mori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Bombyx+mori+cytoplasmic+polyhedrosis+virus+polyhedrin+in+insect+cells+by+using+a+baculovirus+expression+vector%2C+and+its+assembly+into+polyhedra%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra.</a> J Gen Virol. 74, Pt 1 99-102 (1993).</li>
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<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Cryst D. 66, Pt 2 125-132 (2010).</li>
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<li>Foadi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+procedures+for+the+optimal+selection+of+data+sets+from+multiple+crystals+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).</li>
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<li>Hasegawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+crystallization+of+human+IgG+in+the+endoplasmic+reticulum+of+engineered+Chinese+hamster+ovary+%28CHO%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells.</a> J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).</li>
<li>Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Delivery+of+Protein+Microcrystals+in+Lipidic+Cubic+Phase+for+Serial+Femtosecond+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography.</a> J Vis Exp. (115), e54463(2016).</li>
<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeshAndCollect%3A+an+automated+multi-crystal+data-collection+workflow+for+synchrotron+macromolecular+crystallography+beamlines%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst.+D%22%5BJournal%5D)">MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines.</a> Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).</li>
<li>Fan, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcineurin+crystals+formed+using+the+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Micros+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system.</a> Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).</li>
<li>Nass, K. <a target="_blank" href="NULL">Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers</a>. , Hamburg University. PhD dissertation (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll bietet zwei Ansätze zur Analyse von Mikrokristallen mit dem Ziel, die Analyse von sehr kleinen Kristallen zu erleichtern, die in der Vergangenheit übersehen worden wären. Kritische Schritte zur Mikrokristallreinigung Das dargestellte Protokoll wurde mit Bombyx mori CPV1 Polyhedrin optimiert, das in Sf9-Zellen als Modellsystem exprimiert wird. In vivo zeigen Mikrokristalle jedoch eine große Variabilität des mechanischen Widerstandes. ...

Die Verwendung der Röntgenkristallographie zur Bestimmung hochauflösender Strukturen biologischer Makromoleküle hat in den letzten zwei Jahrzehnten einen stetigen Fortschritt erfahren. Die zunehmende Aufnahme der Röntgenkristallographie durch nicht-erfahrene Forscher veranschaulicht die Demokratisierung dieses Ansatzes in vielen Bereichen der Biowissenschaften 1 . Historisch gesehen wurden Kristalle mit Abmessungen unter ~ 10 μm als anspruchsvoll, wenn nicht unbrauchbar, für die Strukturbestimmung betrachtet. Die zunehmende Verfügbarkeit von dedizierten Mikrofokus-Strahllinien bei Synchrotronstrahlungsquellen weltweit und technologischen Fortschritten, wie die Entwicklung von Werkzeugen zur Manipulation von Mikrokristallen, hat viel von diesen Barrieren entfernt, die den breiten Einsatz der Röntgenmikrokristallographie vereiteln. Fortschritte in der seriellen Röntgenmikrokristallographie 2 , 3 und Mikroelektronenbeugung 4 haDass die Verwendung von Mikro- und Nanokristallen zur Strukturbestimmung nicht nur möglich ist, sondern auch manchmal der Verwendung von großen Kristallen 5 , 6 , 7 bevorzugt ist. Diese Fortschritte wurden zuerst auf die Untersuchung von Peptiden 8 und natürlichen Kristallen angewendet, die von Insektenviren 9 , 10 produziert wurden . Sie werden nun für ein breites Spektrum biologischer Makromoleküle eingesetzt, darunter die schwierigsten Systeme wie Membranproteine ​​und Großkomplexe 11 . Um die Analyse dieser Mikrokristalle zu erleichtern, wurden sie in Meso , insbesondere Membranproteinen 12 und in Mikrofluidik-Chips 13, analysiert. Die Verfügbarkeit dieser neuartigen Mikrokristallographie-Methoden hat die Möglichkeit der Verwendung inVivo-Kristallisation als neuer Weg für die Strukturbiologie 14 , 15 , 16, die eine Alternative zur klassischen in vitro- Kristallogenese bietet. Unglücklicherweise, auch wenn in vivo Kristalle produziert werden können, bleiben mehrere Hindernisse wie der Abbau oder Verlust von Liganden während der Reinigung aus Zellen, Schwierigkeiten bei der Manipulation und Visualisierung der Kristalle an der Synchrotron-Strahllinie und langwierigen Röntgenbeugungsexperimenten. Als Alternative wurden auch Kristalle direkt innerhalb der Zelle ohne Reinigungsschritt 17 , 18 , 19 analysiert. Eine vergleichende Analyse deutet darauf hin, dass solche in Cellulo- Ansätze effizienter sein können als die Analyse von gereinigten Kristallen und Ertragsdaten höherer Auflösung 20 . Dieses Protokoll ist inNeigten dazu, Forschern neu zu helfen, die Protein-Mikrokristallographie neu zu machen. Es bietet Methoden zur Fokussierung auf Probenvorbereitung und Manipulation für Röntgenbeugungsexperimente an einer Synchrotron-Strahllinie. Es werden zwei Möglichkeiten vorgeschlagen, isolierte Kristalle für klassische Mikrokristallographie oder kristallhaltige Zellen zu verwenden, die nach Durchflusszytometrie für die Celluloanalyse sortiert sind ( Abbildung 1 ).

<table><tbody><tr><td>Sf9 Zellen</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SF900-SFM Insektenmedium</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 L Zellkulturflasche</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schüttelinkubator für Insektenzellkulturen</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL konische Röhrchen</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge mit Schwenkeimern für 50 mL Rohre</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator ausgestattet mit einer 19 mm Sonde</td><td>Soniprep 150&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasobjektträger</td><td>Hampton Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Influx Zellsortierer&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hampton Schwere Atomsiebe</td><td>Hampton Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromesh</td><td>Mitigen</td><td></td><td>700/25 Maschen bieten eine größere Oberfläche. Indizierte Netze können für systematische Studien erworben werden.</td></tr><tr><td>Papierdocht</td><td>Mitigen</td><td></td><td>Die Größe des Papierdochts kann für einen optimalen Durchfluss variiert werden. Dies hängt weitgehend von der Art der verwendeten Kristalle und des verwendeten Kryoprotektivums ab.</td></tr><tr><td>Ethylenglykol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MX2 Mikrofokus-Beamline</td><td>Australisches Synchrotron</td><td></td><td>Eine Liste der verfügbaren Mikrofokus-Beamlines finden Sie in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793&ndash; 1806, doi:10.1071/CH14455.</td></tr></tbody></table>

mikrokristallographie von proteinkristallen und<em&gt; in cellulo</em&gt; beugung

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Das Aufkommen von hochwertigen Mikrofokus-Strahllinien bei vielen Synchrotronanlagen ermöglichte die Routineanalyse von Kristallen kleiner als 10 μm in ihrer größten Dimension, die eine Herausforderung darstellte. Wir stellen zwei alternative Arbeitsabläufe für die Strukturbestimmung von Proteinmikrokristallen durch Röntgenkristallographie mit besonderem Fokus auf in vivo gewachsene Kristalle dar. Die Mikrokristalle werden entweder durch Ultraschallbehandlung aus Zellen extrahiert und durch Differentialzentrifugation gereinigt oder in Cellulo nach Zellsortierung durch Durchflusszytometrie von kristallhaltigen Zellen analysiert. Gegebenenfalls werden gereinigte Kristalle oder kristallhaltige Zellen in schweren Atomlösungen für die experimentelle Phasierung eingeweicht. Diese Proben werden dann auf Beugungsexperimente in ähnlicher Weise durch Aufbringen auf einen Mikromesh-Träger und Blitzkühlung in flüssigem Stickstoff vorbereitet. Wir beschreiben und vergleichen serielle Beugungsexperimente von isolierten Mikrokristallen und Kristall-Enthaltende Zellen, die eine Mikrofokus-Synchrotron-Strahllinie verwenden, um Datensätze zu erzeugen, die für Phasing, Modellbau und Verfeinerung geeignet sind. Diese Arbeitsabläufe werden beispielhaft mit Kristallen des Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) Polyhedrins, das durch Infektion von Insektenzellen mit einem rekombinanten Baculovirus produziert wird, veranschaulicht. In diesem Fall Studie, in der Cellulo- Analyse ist effizienter als die Analyse der gereinigten Kristalle und liefert eine Struktur in ~ 8 Tage von Expression zu Verfeinerung.

Eine Übersicht über beide alternativen Methoden zur Strukturbestimmung mit in vivo Mikrokristallen wird dargestellt ( Abbildung 1 ). Polyeder kann leicht durch Beschallung und Zentrifugation gereinigt werden. Aufgrund ihrer Dichte bilden sie eine Schicht am Boden des Rohres unter einer Trennschicht, die durch Pipettieren entfernt werden kann ( Abbildung 3a und 3b ). Die Probe wird dann mehreren Runden d...

Ein Protokoll wird für die Röntgenkristallographie unter Verwendung von Proteinmikrokristallen vorgestellt. Zwei Beispiele, die in vivo- gewachsenen Mikrokristallen nach der Reinigung oder in Cellulo analysieren, werden verglichen.

Mikrokristallographie von Proteinkristallen und<em&gt; In Cellulo</em&gt; Beugung

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Methoden der Röntgenkristallographie vorzustellen, die auf Mikrokristalle angewendet werden, insbesondere auf solche, die in Zellen gebildet werden und als Kristalle in vivo betrachtet werden. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes liegt darin, dass er ein einfaches und effizientes Verfahren zur Herstellung, Detektion und Analyse von Mikrokristallen bietet. Diese Methode zielt darauf ab, die Nutzung von Mikrokristallen zu erleichtern, indem Kristalle verwendet werden, die innerhalb lebender Zellen gezüchtet wurden, wodurch der Bedarf an komplexen Reinigungsverfahren und Aprocox-Sedierungstests entfällt.In diesem Video konzentrieren wir uns auf die einfache Vorbereitung und Handhabung für Röntgenbeugungsexperimente an einer Synchrotron-Strahllinie. Wir zeigen die Schritte, die sich am stärksten von der klassischen Kristallographie unterscheiden. In dieser Demonstration verwenden wir Kristalle des vitalen Polyhedronproteins, die erfolgreich gezüchtet wurden, doch die Methode kann ebenfalls auf Proteine angewandt werden, die Kristalle in bakteriellen, insecten-, säugetier- oder hefetypischen Zellen bilden.Zunächst inkubieren Sie 30 Mil

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Auswertung zweidimensionaler (2D) Kristallisation Studien für die Bildung geordneter membrane protein-Arrays ist eine höchst kritische und schwierige Aufgabe in Elektronenkristallographie. Hier beschreiben wir unseren Ansatz in Screening und Identifizierung von 2D-Kristallen von überwiegend kleinen Membranproteine ​​im Bereich von 15 - 90kDa.

Die Beurteilung Zweidimensionale Kristallisation Trials of Small Membranproteinen für Strukturbiologie Studien Electron Crystallography

Dieser Artikel beschreibt die Kryo-Elektronenmikroskopie-Methode, die verwendet wird, um qualitativ hochwertige mikroskopische Bilder von Makromolekülen in ihrem nahezu nativen Zustand zu erhalten. Die Methode liefert Bilder, die sich für die weitere computergestützte Verarbeitung mit dem Einzelpartikelansatz eignen, der entwickelt wurde, um die 3D-Rekonstruktion eines Makromoleküls zu erzeugen.

Gebote und Verbote der Kryo-Elektronenmikroskopie: A Primer für Probenvorbereitung und High Quality Data Collection für Makromolekulare 3D-Rekonstruktion

Dieses Protokoll beschreibt im Detail wie fabrizieren und mikrofluidischen Geräte zur Röntgenbeugung Datenerfassung bei Raumtemperatur betrieben. Darüber hinaus beschreibt die Kristallisation von Proteinen durch dynamische Lichtstreuung zu überwachen und Informationen zum Verarbeiten und analysieren erhalten Beugung Daten.

Mikrofluidische Chips für In Situ Crystal-Röntgenbeugung und In Situ dynamische Lichtstreuung für serielle Kristallographie

In diesem Papier wird das Herstellungsprotokoll von mikrofluidischen Chips erläutert, das für die Proteinkristallisation auf dem Chip mit der Dialysemethode und in situ Röntgenbeugungsexperimenten entwickelt wurde. Der Mikroherstellungsprozess ermöglicht es, eine semipermeable regenerierte Zellulosedialysemembran mit einem beliebigen Molekulargewichts-Cut-off zwischen zwei Schichten des Chips zu integrieren.

Kristallisation von Proteinen auf Chip durch Mikrodialyse für In Situ-Röntgenbeugungsstudien

Hier beschreiben wir die in unserem Labor entwickelten Verfahren zur Herstellung von Pulvern aus niedermolekularen Kristallen für Mikrokristall-Elektronenbeugungsexperimente (MicroED).

Mikrokristall-Elektronenbeugung kleiner Moleküle

Die Strukturbestimmung makromolekularer Komplexe mittels KryoEM ist für bestimmte Klassen von Proteinen und Komplexen zur Routine geworden. Hier wird diese Pipeline zusammengefasst (Probenvorbereitung, Screening, Datenerfassung und -verarbeitung) und die Leser werden auf weitere detaillierte Ressourcen und Variablen geleitet, die bei anspruchsvolleren Proben geändert werden können.

Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie: Von der Probe zur Struktur

Lipidmonoschichten werden seit Jahrzehnten als Grundlage für die Bildung von zweidimensionalen (2D) Proteinkristallen für Strukturstudien verwendet. Sie sind an der Luft-Wasser-Grenzfläche stabil und können als dünnes Trägermaterial für die Elektronenbildgebung dienen. Hier stellen wir die bewährten Schritte zur Herstellung von Lipidmonolayern für biologische Studien vor.

Probenvorbereitung mit einer Lipid-Monolayer-Methode für elektronenkristallographische Untersuchungen

Dieser Beitrag beschreibt, wie man die Proteinkristallisation auf Crystal-on-Crystal-Geräten einrichtet und wie man eine automatisierte serielle Datenerfassung bei Raumtemperatur mit der On-Chip-Kristallisationsplattform durchführt.

On-Chip-Kristallisation und großflächige serielle Beugung bei Raumtemperatur

Hochauflösende Kryo-EM-Karten von Makromolekülen können auch mit 200-kV-TEM-Mikroskopen erreicht werden. Dieses Protokoll zeigt die Best Practices für die Einstellung genauer optischer Ausrichtungen, Datenerfassungsschemata und Auswahl von Bildbereichen, die für die erfolgreiche Erfassung hochauflösender Datensätze mit einem 200-kV-TEM unerlässlich sind.

Routinemäßige Sammlung von hochauflösenden Kryo-EM-Datensätzen mit einem 200-KV-Transmissionselektronenmikroskop

Das vorgestellte Protokoll beschreibt einen einfachen Ansatz für das Screening der Proteinkristallisationsbedingungen und des Kristallwachstums unter Verwendung einer 96-Well-Hochdurchsatz-Dialyseplatte. Der Einsatz von Dialysatorröhrchen für die großskalige Züchtung von Mikrokristallen wird auch für serielle Kristallographie und MicroED-Anwendungen demonstriert.

Hochdurchsatz-Proteinkristallisation mittels Mikrodialyse

Erfahren Sie die Röntgenkristallographie von Mikrokristallen in lebenden Zellen. Diese Methode vereinfacht die Kristallherstellung und eliminiert aufwendige Reinigungsprozesse für strukturbiologische Analysen.

Mikrokristallographie von Proteinkristallen und

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