Hypoxische Vorkonditionierung von Marrow-abgeleiteten Progenitor-Zellen als Quelle für die Erzeugung von reifen Schwann-Zellen

Das übergeordnete Ziel dieser Zellkulturmethode besteht darin, neuralen Vorläuferzellen aus dem Knochenmark anzureichern, um deren Differenzierung in funktionelle Schwann-Zellen zu ermöglichen. Diese Methode löst ein zentrales Problem in der Stammzell- und regenerativen Medizin: wie man aus einer begrenzten Quelle an neurogenen Vorläuferzellen Gliazellen erzeugt, um die axonale Regeneration und Remyelinisierung nach Verletzungen zu unterstützen. Ein Vorteil dieser Technik liegt in der effizienten Kulturkonditionierung, die die Vermehrung neuraler Zellen aus Knochenmarkstromazellen fördert und deren Einsatz in der autologen Zelltherapie ermöglicht.

Nach zwei Tagen in Kultur entfernen Sie 75 % des verbrauchten Mediums und der nicht anhaftenden Zellen und waschen die anhaftenden Zellen dreimal mit jeweils 10 Millimeter PBS. Ersetzen Sie nach dem dritten Waschschritt das PBS durch 10 Milliliter Wachstumsmedium für Markstromazellen (MSCs) und stellen Sie die Kultur wieder in den Inkubator. Sichtbare Kolonien sollten bis zum sechsten bis siebten Tag erscheinen.

Am Tag 10 die Kultur mit frischem PBS waschen und die Zellen mit 1,5 Milliliter rekombinantem enzymatischem Zell-Dissociationsreagenz ablösen. Nach fünf Minuten bei 37 Grad Celsius drei Milliliter MSC-Wachstumsmedium hinzufügen, um die Reaktion zu neutralisieren, und die abgelösten Zellen durch Zentrifugation sammeln. Den Zellpellet in fünf Milliliter frischem MSC-Wachstumsmedium resuspendieren und die Zellen mit einer Dichte von vier mal 10 hoch vier Zellen pro Quadratzentimeter in einer neuen 10-Zentimeter-Zellkulturschale ansäen.

Die Zellen sollten innerhalb von zwei Tagen nach dem Passagieren eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreichen. Für die hypoxische Präkonditionierung zunächst die Ringklemme lösen und die freiliegenden Teile mit 70 %igem Ethanol reinigen. Danach die Hypoxiekammer weiter in ihre Bestandteile zerlegen und diese in eine laminare Luftströmungskabine zur Sterilisation unter UV-Licht für 15 Minuten geben.

Als Nächstes wird eine 80 bis 90 % konfluente MSC-Kultur mit 10 Milliliter PBS gewaschen, wie gerade gezeigt, und die Kulturen werden mit frischem MSC-Wachstumsmedium, das mit 25 Millimolar HEPES ergänzt ist, behandelt. Die behandelte Kultur wird in die wieder zusammengesetzte Hypoxiekammer gegeben und die Ringklemme festgezogen. Die Verbindungsstellen der Kammer werden abgedichtet, um sicherzustellen, dass kein Gas entweichen kann, und ein Gasgemisch aus 99 % Stickstoff und 1 % Sauerstoff wird mit einer Flussrate von 10 Litern pro Minute in die Kammer eingeleitet.

Nach fünf Minuten die Kammer 16 Stunden lang in den Zellkultur-Inkubator stellen. Am nächsten Morgen die Zellen wie zuvor gezeigt ablösen und durch Zentrifugation sammeln. Den Pellet in Neuralstammzell-Medium resuspendieren und sechs mal 10 hoch drei Zellen pro Quadratzentimeter auf Low-Attachment-6-Well-Platten für die Kultur bei 37 Grad Celsius und 5 %CO2 über 12 Tage aussäen.

Bis zum sechsten bis siebten Tag sollten beträchtliche, nicht-anklebende Zellsphären zu beobachten sein. Zwischen dem 10. und 12. Tag sind in hypoxischen Kulturen mehr Neurosphären erkennbar als unter Normoxie. Am 12. Tag überführen Sie die Neurosphären mithilfe einer 10-Milliliter-Pipette in ein 15-Milliliter-Konischgefäß und sammeln die Neurosphären durch Zentrifugation ein.

Suspendieren Sie die Sphären in DMEM/F12 und geben Sie fünf bis 10 Neurosphären pro Quadratzentimeter auf mit Poly-D-Lysin-Laminin beschichtete 6-Loch-Platten, jeweils mit 1,5 Milliliter Glialinduktionsmedium pro Brunnen. Kultivieren Sie die Sphärenkultur mindestens sieben Tage lang und erneuern Sie das Medium alle drei Tage. Um die Spinalganglien zu isolieren, überführen Sie das erste Embryo in eine 10 cm große Kulturschale, die PBS bei Raumtemperatur enthält, unter dem Stereomikroskop in Bauchlage und führen Sie feine chirurgische Pinzetten beidseits des Rückenmarks ein.

Unter Verwendung der stumpfen Dissektion das Rückenmark mit einer Pinzette vom umgebenden Bindegewebe lösen, wobei das Rückenmark entlang der Halsöffnung und des Schwanzstumpfs ausgeschnitten wird. Entfernen Sie das verbleibende Bindegewebe vom freigelegten Rückenmark, bis nur noch das Rückenmark, die Nervenwurzeln und die daran befestigten Spinalganglien übrig sind. Lösen Sie die einzelnen Spinalganglien von ihren anhängenden Nervenwurzeln.

Verwenden Sie dann einen Pipettenstift mit einer 1 ml-Pipettenspitze, um bis zu 100 dorsale Wurzelganglien in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit PBS zu überführen. Sammeln Sie die Ganglien durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets in 200 µL eines rekombinanten enzymatischen Zell-Dissociationsreagenz pro Röhrchen. Nach 10 Minuten bei 37 °C zentrifugieren Sie die dorsalen Wurzelganglien erneut und pipettieren die Pellets vorsichtig mit einer 200-µL-Pipettenspitze in Erhaltungsmedium für Neuronen der dorsalen Wurzelganglien.

Säen Sie die Zellen der Spinalganglien mit einer Dichte von fünf mal 10 hoch drei Zellen pro Quadratzentimeter auf 6-Loch-Platten, die mit Poly-D-Lysin und Laminin beschichtet sind, in jeweils 1,5 Milliliter Spinalganglien-Neuronen-Erhaltungsmedium pro Loch aus. Nach zwei Tagen Kultivierung bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 waschen Sie die Zellen und geben die neuronale Zellkultur für weitere zwei Tage in frisches Spinalganglien-Neuronen-Reinigungsmedium zurück in den Inkubator. Nach drei bis vier Zyklen der Erhaltung und Reinigung sollten die Spinalganglien-Zellkulturen positiv für den neuronalen Marker Tuj-1 und negativ für den glialen Zellmarker S100 beta testen.

Am siebten Tag der Kultivierung schwannschen Zell-ähnlicher Zellen die Zellen mit PBS spülen und anschließend mit 0,5 Milliliter rekombinantem enzymatischem Zell-Dissociationsreagenz pro Vertiefung bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten ablösen. Den Zellpellet in Co-Kultur-Medium resuspendieren und die schwannschen Zell-ähnlichen Zellen auf die gereinigte neuronale Kultur des dorsalen Wurzelganglions mit einer Dichte von 1 × 10³ Zellen pro Quadratzentimeter säen. Die Co-Kultur wird 14 Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO₂ durchgeführt. Gesunde MSCs weisen eine zugespitzte Morphologie auf, im Gegensatz zu der viereckigen Erscheinung von MSCs, die über eine hohe Anzahl von Passagen kultiviert wurden und ihre Multipotenz verloren haben.

Erweiterte MSC-Kolonien sollten die Expression von MSC-Markern, das Fehlen von hämatopoetischen Stammzellmarkern sowie die Differenzierungsfähigkeit in adipogene, osteogene und chondrogene Linien aufweisen. Gesunde MSC-Kulturen, die einer hypoxischen Präkonditionierung unterzogen wurden, bilden Neurosphären, die sowohl in Anzahl als auch in Größe größer sind. Die Reinheit des Netzwerks der Rückenwurzelganglion-Neuronen kann durch den Nachweis des neuronalen Markers Tuj-1 und das gleichzeitige Fehlen des Schwann-Zell-Markers S100 bestätigt werden.

Nach 14 Tagen in Kultur mit Dorsalwurzelganglion-Neuronen erwerben schwannsche Zell-ähnliche Zellen die Merkmale und funktionellen Eigenschaften ausgereifter, zellliniendeterminierter Schwann-Zellen. Einmal beherrscht, kann die Subpopulation der neuralen Vorläuferzellen innerhalb von 10 Tagen in menschlichen oder rativen BMSCs expandiert werden, sofern die Zellvermehrungstechnik korrekt durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig sicherzustellen, dass die BMSC-Probe über nestinpositive neurogene Vorläuferzellen verfügt und alle CD45-positiven hämatopoetischen Vorläuferzellen entfernt wurden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man BMSCs beschafft, die neuronale Vorläuferzellsubpopulation anreichert und die Differenzierung neuronaler Vorläuferzellen in fatespezifische Schwann-Zellen lenkt, um diese zur Verbesserung des axonalen Regrowths und der Remyelinisierung nach traumatischen Verletzungen einzusetzen. Mit dieser Methode können myelinisierende Gliazellen, wie reife Schwann-Zellen, gewonnen werden, die für die Entwicklung von Therapien bei demyelinisierenden Verletzungen und Erkrankungen sowohl des peripheren als auch des zentralen Nervensystems verwendet werden können.