Name: Hypoxische Vorkonditionierung von Marrow-abgeleiteten Progenitor-Zellen als Quelle für die Erzeugung von reifen Schwann-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Erfahren Sie die hypoxische Vorkonditionierung von Knochenmarkstromazellen zur Differenzierung in reife Schwann-Zellen. Diese Methode ermöglicht autologe Zelltherapien zur Förderung axonalem Wachstums.

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Die Autoren möchten Dr. Nai-Sum Wong für die Bereitstellung des Hypoxie-Kammerapparates und Frau Alice Lui für die technische Unterstützung anerkennen.

Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden in strikter Übereinstimmung mit dem NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und von dem Ausschuss für die Verwendung von lebenden Tieren für Lehre und Forschung, Li Ka Shing Fakultät für Medizin, der Universität von Hongkong genehmigt. Menschliche Knochenmarkproben wurden aus dem Beckenkamm gesunder Spender erhalten, nachdem sie eine einverstandene Einwilligung erhalten hatten. Die Protokolle wurden vom Institutional Review Board, der University of Hong Kong, genehmigt. 1. Vorbereitung der Ratten-MSC-Kulturen <ol><li> Ernte von MSCs aus dem Femur <ol><li> Autoklavieren Sie alle Sektionswerkzeuge ( dh feines Sezierschere , Stumpfschneidschere und Zahnpinzette) bei 180 ° C für mindestens 2 Stunden vor dem Gebrauch. </li><li> Bereiten Sie das MSC - Wachstumsmedium vor, das aus einer minimalen essentiellen Medium - Alpha - Modifikation (αMEM), ergänzt mit 15% fötalem Rinderserum (FBS) und Penicillin / Streptomycin (P / S, 1% v / v). </li><li> Opfere junge männliche Sprague Dawley Ratten (200-250 g Körpergewicht) durch Pentobarbiton Überdosierung (240 mg / kg Körpergewicht, intraperitoneal). HINWEIS: Marrow-Proben von verschiedenen Ratten sollten separat verarbeitet werden. </li><li> Lege die geopferten Tiere in Rückenlage. Reinigen Sie den Bauch und die unteren Gliedmaßen gründlich mit 70% Ethanol. </li><li> Entfernen Sie die Haut und das subkutane Gewebe über die medialen Oberschenkel mit feinen Sezierscheren und Pinzetten. Entfernen Sie die Oberschenkelmuskeln in Umfangsrichtung, bis der Femur ausgesetzt ist. Setzen Sie diese proximal und distal fort, bis die Knie- und Hüftgelenke gesehen werden. Den Femur durch das Hüft- und Kniegelenk mit stumpfen Schneidscheren abtarchen. HINWEIS: Trense den Femur nicht, um die Markhöhle in diesem Stadium freizulegen. Übertragen Sie intakte Oberschenkel zu einer laminaren Strömung Gewebekultur Haube für die weitere Verarbeitung. </li><li> Verwenden Sie stumpf gekippte Schneidscheren, um die distalen und proximalen Enden des Femurs durch die Metaphyse zu transectieren. </li><li> Legen Sie einen 70 μm Zellsieb über ein 50 mL konisches Rohr. Setzen Sie eine 21 G, 10 mL Spritze mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, 10 mM Na 2 HPO 4 , pH 7,4) in den exponierten Femurkanal ein und spülen Sie den Markinhalt durch wiederholtes Spülen in das konische Röhrchen. HINWEIS: Etwa 20 ml PBS werden verwendet, um jeden Femur zu spülen. Wenn die Farbe des gespülten Inhalts blutverschmiert und trüb ist, kann ein größeres Volumen verwendet werden. </li><li> Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 480 xg für 5 min. Den Überstand verwerfen. Das Zellpellet wird in 10 ml MSC-Wachstumsmedium resuspendiert. Die Zellen auf eine 10 cm lange Gewebekultur schichten. Die Gewebekulturschalen in einen Zellinkubator (37 ° C, 5% CO 2 ) geben. Notieren Sie den ersten Tag der Beschichtung als Tag 0. HINWEIS: In allen Schritten mit Zentrifugation die Bremse für maximale Verzögerung einstellen. </li></ol></li><li> Etablierung und Erweiterung der MSC-Kolonien HINWEIS: Dieses Protokoll rElies auf Gewebekultur plastische Adhärenz als Mittel, um für MSCs aus der Markhöhle 11 zu wählen. Der Knochenmarkgehalt darf 2 Tage lang an der Gewebekulturkunst haften. <ol><li> Am Tag 2 spülen Sie die Kulturplatten dreimal mit 10 ml PBS aus, um nicht-adhärente Zellen zu entfernen. Ersetzen Sie das PBS mit 10 ml MSC-Wachstumsmedium nach dem Spülen. Waschen Sie die Zellen mit PBS und füllen Sie mit MSC Wachstumsmedium alle 3 Tage auf. ANMERKUNG: MSC-Kolonien sollten am Tag 6-7 sichtbar sein ( Abbildung 2A ). </li><li> Passage der Zellen bis zum Tag 10 durch Entfernen des Wachstumsmediums und Spülen der Zellen mit PBS. Zugabe von 1,5 ml rekombinantem enzymatischen Zelldissoziationsreagenz und inkubieren bei 37 ° C für 5 min. Füge 3 ml MSC-Wachstumsmedium hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren. Sammeln Sie die abgetrennten Zellen durch Zentrifugation bei 250 xg für 5 min. </li><li> Quantifizierung der Zellen innerhalb des Pellets unter Verwendung eines Hämocytometers nach einer geeigneten Verdünnung in PBS. </li><li> Samen passagierte Zellen mit einer Dichte von 40.000 Zellen / cm 2 in eine 10-cm-Kulturplatte in MSC-Wachstumsmedium. HINWEIS: Ratten-MSCs sollten innerhalb von 2 Tagen nach Passage 80-90% Konfluenz erreichen (Abbildung 2B ). Zellen können wie in Schritt 1.2.2 für bis zu 8 Passagen beschrieben passagiert werden. MSCs können durch Immunzytochemie und ihre Fähigkeit zur Trilineage-Differenzierung charakterisiert werden (Abbildung 3 ) 12 . Nur MSC-Kulturen zwischen den Passagen 3 und 8 unterliegen einer nachfolgenden hypoxischen Vorkonditionierung und einer neuronalen Progenitoranreicherung. MSCs mit größerer Durchgangszahl nehmen eine abgeflachte Morphologie an (Abbildung 2C ) und produzieren nicht genügend neuronale Vorläufer. Diese Kulturen sollten verworfen werden. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung von menschlichen BMSC-Kulturen <ol><li> 1 ml humanes Knochenmark aspirieren mit 9 ml MSC Wachstumsmedium verdünnen und die Platte auftragenZellen auf einer 10-cm-Gewebekulturschale. Pflegen Sie die Kulturen in einem Zellinkubator (37 ° C, 5% CO 2 ). </li><li> Entfernen Sie das Medium nach 2 Tagen und spülen Sie die Kulturen dreimal mit 10 ml PBS ab, um nicht-adhärente Zellen zu entfernen. Nach dem abschließenden Spülen das PBS entfernen und es mit 10 ml MSC-Wachstumsmedium ersetzen. Füllen Sie das Wachstumsmedium nach jeder 3 Tage Kultur nach dem PBS-Spülen auf. ANMERKUNG: MSC-Kolonien sollten am Tag 6-7 sichtbar sein. Die Anzahl der Kolonien kann zwischen den Fächern variieren. </li><li> Passage der Zellen am Tag 10, wie in Schritt 1.2.2 beschrieben. Quantifizierung der Zellen innerhalb des Pellets unter Verwendung eines Hämocytometers nach einer geeigneten Verdünnung in PBS. Die passierten Zellen mit einer Dichte von 40.000 Zellen / cm 2 auf eine 10 cm-Kulturplatte im MSC-Wachstumsmedium absaugen. ANMERKUNG: Menschliche MSCs (Abbildung 2D ) zeigen eine ähnliche Morphologie gegenüber Ratten-MSCs und sollten ebenfalls innerhalb von 2 Tagen nach Passage 80-90% Konfluenz erreichen. Sie sollten chara seinDurch Immunzytochemie und ihre Fähigkeit zur Trilineage-Differenzierung 12 . Wie bei Ratten-MSCs sind menschliche MSCs, die zwischen Passage 3 und 8 liegen, einer nachfolgenden hypoxischen Vorkonditionierung und neuronaler Progenitoranreicherung unterworfen. </li></ol> 3. Hypoxische Vorkonditionierung <ol><li> Demontieren Sie die Hypoxiekammerkomponenten ( dh Basis, Deckel, Schalen) nach dem Lösen der Ringklemme und wischen Sie die Einzelteile mit 70% Ethanol ab. Legen Sie die Kammerkomponenten innerhalb einer laminaren Strömungsgewebekulturhaube zur Sterilisation unter UV-Licht für 15 min. </li><li> Vor der hypoxischen Vorkonditionierung, entfernen Sie das Medium und spülen Sie die Ratte und die menschlichen MSC-Kulturen (Abschnitte 1 und 2) mit 10 ml PBS. Ersetzen Sie das PBS durch 10 ml MSC-Wachstumsmedium, ergänzt mit 25 mM HEPES. ANMERKUNG: Die MSCs, die auf 10 cm Schalen gezüchtet wurden, sollten 80-90% Konfluenz erreicht haben, bevor sie einer hypoxischen Vorkonditionierung unterzogen werden. </li><li> Legen Sie die CulIn der Hypoxiekammer. Die Kammerteile wieder zusammenbauen und die Ringklemme festziehen. Spülen Sie ein Gasgemisch aus 99% N 2 /1% O 2 in die Kammer mit einer Durchflussrate von 10 l / min für 5 min. </li><li> Die Anschlussenden der Hypoxiekammer abdichten, um sicherzustellen, dass kein Gasaustritt besteht. Legen Sie die Kammer 16 Stunden lang in den Zellinkubator (37 ° C, 5% CO 2 ). </li><li> Nach Beendigung der hypoxischen Vorkonditionierung, entfernen Sie die Kulturen aus der Kammer in Vorbereitung für die nachfolgende neuronale Progenitor Anreicherung Kultur. </li></ol> 4. Neural Progenitor Anreicherung Kultur <ol><li> Bereiten Sie das neuronale Progenitor-Medium vor, das aus Dulbecco&#39;s modifiziertem Adlermedium / Ham-Nährstoffmischung F12 (DMEM / F12), ergänzt mit B27 (2% v / v), basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF, 20 ng / ml), epidermalem Wachstumsfaktor (EGF, 20 ng / ml) und P / S (1% v / v). </li><li> Trennen Sie die hypoxisch vorkonditionierten Ratten / menschlichen MSCs, wie in Schritt 1.2.2 beschrieben.Sammeln Sie die abgetrennten Zellen durch Zentrifugation bei 250 xg für 5 min. Quantifizierung der Zellen innerhalb des Pellets unter Verwendung eines Hämocytometers nach entsprechender Verdünnung in PBS. </li><li> Resuspendieren der Zellen in neuronalen Progenitor-Medium und Samen auf Low-Attachment, 6-Well-Platten mit einer Dichte von 6.000 Zellen / cm 2 . Legen Sie die Kultur in einen Zellinkubator (37 ° C, 5% CO 2 ) für 12 Tage. Füllen Sie 75% des neuronalen Vorläufermediums alle 3 Tage auf. HINWEIS: Größere, nicht adhärente Zellcluster sollten am Tag 6-7 beobachtet werden. Am Tag 10-12 können Neurosphären mit einem Durchmesser ≥ 100 μm beobachtet werden (Abbildung 4 ). Hypoxisch vorkonditionierte MSCs sollten mehr Neurosphären im Vergleich zu MSCs ergeben, die unter normoxischen Bedingungen kultiviert wurden 9 . </li><li> Sammeln Sie Neurosphären am Tag 12, indem Sie sie in eine 10-ml-Pipette absaugen und auf ein 15-ml-Kegelrohr übertragen. Zentrifugieren Sie die Neurosphären bei 250 xg für 5 min. HINWEIS: Neurosphären können seinCharakterisiert am Tag 12 für neuronale Vorläufer Marker, wie Nestin und GFAP 7 . </li></ol> 5. Erzeugung von Schicksal-engagierten Schwann-Zellen über Coculture mit DRG-Neuronen <ol><li> Vorbereitung von gereinigten Ratten-DRG-Neuronen <ol><li> Autoklavieren Sie alle Sektionswerkzeuge ( dh Dissektionsscheren , Pinzetten, zwei Mikrodissektionszangen und Mikrodissektionsscheren) bei 180 ° C für mindestens 2 Stunden vor dem Gebrauch. </li><li> Mantel 6-Well-Gewebekulturplatten mit Poly-D-lysin (PDL, 10 μg / ml in PBS) bei 4 ° C über Nacht. Entfernen Sie die PDL und spülen Sie mit 1,5 ml PBS pro Well. </li><li> Gehen Sie mit der Beschichtung der Platten mit Laminin (10 μg / ml in PBS) bei 37 ° C für 2 h vor. Spülen Sie die Platten mit 1,5 ml PBS pro Vertiefung ab. </li><li> Vorbereiten des DRG-Neuronen-Wartungsmediums, bestehend aus neurobasalem Medium, ergänzt mit B27 (2% v / v), L-Glutamin (1% v / v), Nervenwachstumsfaktor (NGF, 20 ng / ml) und P / S (1 % V / v). </li><li>Vorbereiten des DRG-Neuron-Reinigungsmediums, bestehend aus neurobasalem Medium, ergänzt mit B27 (2% v / v), L-Glutamin (1%), NGF (20 ng / ml), P / S (1%), Fluorodeoxyuridin (FDU, 10 Μg / ml) und Uridin (10 &amp; mgr; g / ml). </li><li> Opfer schwangere Ratten am Gestationstag 14-15 durch pentobarbital Überdosierung (240 mg / kg Körpergewicht, intraperitoneal). </li><li> Lege die geopferten Tiere in Rückenlage. Reinigen Sie den Bauch gründlich mit 70% Ethanol. </li><li> Schneide die untere Bauchwand des Tieres in Längsrichtung mit feiner Sezierschere und Pinzette. Identifizieren und entfernen Sie den Uterus mit Sektionsschere. Schneide die Uteruswand, um die Embryonen auszusetzen und zu extrahieren. Übertragen Sie die Embryos in eine sterile, 10 cm Kulturschale mit PBS gefüllt. Legen Sie die Kulturschale auf Eis. </li><li> Übertragen Sie den Embryo, der für die Sektion vorgesehen ist, in eine sterile, 10 cm große Kulturschale, die mit PBS (Raumtemperatur) gefüllt ist, und positionieren Sie sie unter einem Sektionsmikroskop. Haben Sie den Embryo in anfälliger Position. NICHTE: Das weißliche Rückenmark und die angehängten DRGs können über den dorsalen Aspekt des Embryos durch seine lichtdurchlässige Haut gesehen werden. </li><li> Setzen Sie die Mikrodissektionszange auf beiden Seiten des Rückenmarks ein und verwenden Sie die stumpfe Dissektion, um das Abtasten des abweichenden Weichgewebes zu trennen. Schneiden Sie das Rückenmark frei von dem Tier mit Mikrodissektion Pinzette entlang der Halsöffnung und Heck Stummel. Führen Sie weitere stumpfe Dissektion über den ventralen Aspekt der Schnur, um es von umgebenden Weichgewebe zu befreien. </li><li> Verwenden Sie Mikrodissektionszangen, um restliches Weichgewebe über den dorsalen Aspekt des befreiten Rückenmarks zu entfernen. HINWEIS: In diesem Stadium sollten nur das Rückenmark, Nervenwurzeln und angeschlossene DRG bleiben. </li><li> Trennen Sie einzelne DRGs von ihren verbindenden Nervenwurzeln mit Mikrodissektionszangen. Verwenden Sie einen Pipettenstift, der an einer 1-ml-Spitze befestigt ist, um die DRGs in ein 1,5 ml steriles Zentrifugenröhrchen zu bringen, das PBS enthält. HINWEIS: Für jede 1,5 mL Röhre, maximal100 DRGs können untergebracht werden. </li><li> Die DRGs bei 250 xg für 5 min zentrifugieren und in rekombinantem enzymatischen Zelldissoziationsreagenz (200 &amp; mgr; l pro Röhrchen) resuspendieren. Inkubieren (37 ° C, 5% CO 2 ) für 10 min. Die DRGs bei 250 xg für 5 min zentrifugieren, den Überstand entfernen und in DRG-Neuron-Wartungsmedium resuspendieren. Das Pellet wird durch sanftes Triturieren mit einer 200 μl Pipettenspitze abgetrennt. Die Zellen innerhalb des Pellets mit einem Hämocytometer nach einer geeigneten Verdünnung quantifizieren. </li><li> Die Zellen mit einer Dichte von 5.000 Zellen / cm 2 in PDL / Laminin-beschichtete 6-Well-Platten in 1,5 ml DRG-Neuron-Wartungsmedium pro Vertiefung absaugen. Nach zwei Tagen Kultur entfernen Sie das DRG-Neuron-Wartungsmedium, spülen mit PBS und ersetzen durch DRG-Neuron-Reinigungsmedium. HINWEIS: Für jeden Reinigungszyklus die DRG-Kulturen mit dem Reinigungsmedium für 2 Tage behandeln, gefolgt von einem Tag der Inkubation im Wartungsmedium. Nach 3-4 Reinigungszyklen, die remOval aller endogenen glia wird erwartet 7 Das dauert ca. 14 Tage. Gereinigte Kulturen testen positiv auf den neuronalen Marker TUJ1 und fehlen für die S100β-Expression (Abbildung 5 ). </li></ol></li><li> Erzeugung von Schwann-Zell-Zellen <ol><li> Bereiten Sie das Gliainduktionsmedium, bestehend aus αMEM, ergänzt mit β-Heregulin (100 ng / ml), bFGF (10 ng / ml), Plättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF-AA, 5 ng / ml), FBS (10%) und P / S (1% v / v). </li><li> Die in Abschnitt 4 hergestellten Neurosphären in PDL / Laminin-beschichteten 6-Well-Platten mit einer Dichte von 5-10 Kugeln pro cm 2 in 1,5 ml Gliainduktionsmedium pro Well auftragen. Ersetzen Sie das Gliainduktionsmedium alle 2 Tage nach dem Spülen der Zellen mit PBS. ANMERKUNG: Zellen aus seedierten Neurosphären werden nach Tag 2 nach außen ausgewandert. Am Tag 7 haben die Migrationszellen ein verjüngtes Aussehen und sollten die Immunopositivität für die Schwann-Zelle nachweisenMarker p75 Neurotrophin Rezeptor (p75) und S100β 7 . Diese Zellen werden als SCLCs bezeichnet. </li></ol></li><li> Kokultur von SCLCs mit DRG-Neuronen <ol><li> Bereiten Sie das Kokulturmedium vor, das aus dem DRG-Neuron-Wartungsmedium (Schritt 5.1.4) und dem Gliainduktionsmedium (Schritt 5.2.1) im Verhältnis 1: 1 Volumen-zu-Volumen besteht. </li><li> Vorbereitung des Schwann-Zell-Wartungsmediums aus DMEM / F12, ergänzt mit FBS (5%), β-Heregulin (10 ng / ml) und P / S (1% v / v). </li><li> Entfernen Sie das Kulturmedium von Tag 7 SCLCs, spülen Sie sie mit PBS und inkubieren Sie sie mit 0,5 ml / Vertiefung des rekombinanten enzymatischen Zelldissoziationsreagens bei 37 ° C für 5 min. Die SCLCs im Kokulturmedium resuspendieren. </li><li> Die Zellen mit einem Hämocytometer nach einer entsprechenden Verdünnung quantifizieren. </li><li> Die SCLCs auf gereinigte DRG-Neuron-Kulturen mit einer Dichte von 1.000 Zellen / cm 2 säen. Halten Sie die Cocultures für 14 Tage, mit Medium Ersatz alle 2 Tage. HINWEIS: Während der Kokultur haben SCLCs die spindelartige Morphologie erworben, die typisch für reife Schwann-Zellen ist (Abbildung 6 ). Diese Zellen bestehen nach dem Entzug von Wachstumsfaktoren in ihrem Phänotyp und sind in der Lage, Axone in vitro und in vivo 7 , 10 zu myelinieren. Die Positivität der Schwann-Zellmarker ( dh p75 und S100β) sollte durch Immunfluoreszenz überwacht werden. </li><li> Nach Beendigung der Kokultur, Passage-engagierte Schwann-Zellen, wie in Schritt 1.2.2 beschrieben. Verwenden Sie 0,5 ml Dissoziationsreagenz pro Vertiefung. Die Zellen mit einem Hämocytometer nach einer entsprechenden Verdünnung quantifizieren. </li><li> Resuspendieren Sie Schicksal-engagierte Schwann-Zellen in Schwann-Zell-Wartungsmedium mit einer Dichte von 10.000 Zellen / cm 2 . Samenzellen in PDL / Laminin-beschichtete 6-Well-Platten für Immunfluoreszenz. ANMERKUNG: Cocultures enthalten zwangsläufig MSCs, die einen Fibroblasten angenommen habenZelle Schicksal 7 . Diese Zellen werden zusammen mit Schicksal-engagierten Schwann-Zellen nach der Fertigstellung der Kokultur passagiert. Schwann-Zellen, die oben auf diesem Fibroblasten-Substrat liegen, können nach dem Spülen mit &quot;kalten Strahlen&quot; von PBS (4 ° C), wie es an anderer Stelle beschrieben wurde, leicht abgelöst und weiter ausgebaut werden. Schicksal-engagierte Schwann-Zellen können im Wartungsmedium für 1 Monat erweitert werden. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wiliams, R. R., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+transplantation%3A+a+repair+strategy+for+spinal+cord+injury%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury?</a> Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).</li>
<li>Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+transplantation+for+spinal+cord+injury+repair%3A+its+significant+therapeutic+potential+and+prospectus%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus.</a> Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).</li>
<li>Lindvall, O., Kokaia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+human+neurodegenerative+disorders--time+for+clinical+translation%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Stem cells in human neurodegenerative disorders--time for clinical translation?</a> J Clin Invest. 120 (1), 29-40 (2010).</li>
<li>Terzic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Differentiation+of+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+From+Mouse+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Directed Differentiation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Transplant. 25 (2), 411-424 (2016).</li>
<li>Takashima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroepithelial+cells+supply+an+initial+transient+wave+of+MSC+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation.</a> Cell. 129 (7), 1377-1388 (2007).</li>
<li>Felling, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem%2Fprogenitor+cells+participate+in+the+regenerative+response+to+perinatal+hypoxia%2Fischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia.</a> J Neurosci. 26 (16), 4359-4369 (2006).</li>
<li>Shea, G. K., Tsui, A. Y., Chan, Y. S., Shum, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+Schwann+cells+achieve+fate+commitment--a+prerequisite+for+remyelination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived Schwann cells achieve fate commitment--a prerequisite for remyelination therapy.</a> Exp Neurol. 224 (2), 448-458 (2010).</li>
<li>Jessen, K. R., Mirsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+development+of+glial+cells+in+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The origin and development of glial cells in peripheral nerves.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (9), 671-682 (2005).</li>
<li>Mung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+generation+of+neural+progenitors+from+adult+bone+marrow+stromal+cells+by+hypoxic+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning.</a> Stem Cell Res Ther. 7 (1), 146(2016).</li>
<li>Ao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regeneration+of+transected+sciatic+nerves+of+adult+rats+using+chitosan+nerve+conduits+seeded+with+bone+marrow+stromal+cell-derived+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells.</a> Biomaterials. 32 (3), 787-796 (2011).</li>
<li>Tondreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+BM+mesenchymal+stem+cells+by+plastic+adhesion+or+negative+selection%3A+phenotype%2C+proliferation+kinetics+and+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential.</a> Cytotherapy. 6 (4), 372-379 (2004).</li>
<li>Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mesenchymal+stem+cells%3A+characterization%2C+differentiation%2C+and+application+in+cell+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy.</a> J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).</li>
<li>Jirsova, K., Sodaar, P., Mandys, V., Bar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+jet%3A+a+method+to+obtain+pure+Schwann+cell+cultures+without+the+need+for+cytotoxic%2C+apoptosis-inducing+drug+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cold jet: a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic, apoptosis-inducing drug treatment.</a> J. Neurosci. Methods. 78 (1-2), 133-137 (1997).</li>
</ol>

Alle Autoren dieses Manuskripts haben keine Offenbarungen.

Es ist wichtig, die &quot;Stämme&quot; von MSCs vor der Anreicherung von neuronalen Vorläufern durch hypoxische Vorkonditionierung und Neurosphären-Kultur zu bewahren. Aus unserer Erfahrung können multipotenten MSCs zuverlässig durch ihre langgestreckte fibroblastenartige Morphologie identifiziert werden. Im Gegensatz dazu nehmen MSCs, die eine abgeflachte, viereckige Morphologie mit prominenten zytoskeletalen Stressfasern angenommen haben, nicht leicht neurales Zellschicksal an und sollte verworfen werden. Im Allgemein...

Die Transplantation von neuronalen Vorläufern und deren Derivaten zeigt Versprechen als Behandlungsstrategie nach traumatischer Nervenverletzung 1 , 2 und Neurodegeneration 3 , 4 . Vor der klinischen Anwendung ist es wichtig, i) eine Methode für den Zugang und die Erweiterung einer autologen Quelle von Stamm- / Vorläuferzellen und ii) ein Mittel, um sie auf relevante, reife Zelltypen zu lenken, zu gewährleisten. Unser Interesse an der Zelltherapie bei Rückenmarksverletzungen führte uns dazu, eine robuste, autologe Zellquelle neuraler Vorläufer aus adulten Geweben zu suchen. Eine Subpopulation von MSCs stammt aus dem Neuralwappen und ist leicht aus der Markhöhle zugänglich. Diese Zellen sind neuronale Vorläufer, die Neuronen und Glia erzeugen können 5 . Tiermodelle der zerebralen Ischämie zeigen, dass Hypoxie die Prol<html> Iferation und multipotenz der neuronalen progenitoren im gehirn 6 Dies war die Grundlage für die Verwendung der hypoxischen Vorkonditionierung als Mittel zur Ausweitung auf margen-abgeleitete neuronale Vorläufer. Die Transplantation von Schwann-Zellen in das verletzte Rückenmark fördert die Regeneration 2 . SCLCs können aus MSCs mittels Supplementierung mit gliogenen Faktoren ( dh β-Heregulin, bFGF und PDGF-AA) erzeugt werden, zeigen aber phänotypische Instabilität. Nach dem Abzug der Wachstumsfaktoren kehren sie zu einem fibroblastenähnlichen Phänotyp 7 zurück . Phänotypische Instabilität ist bei der Zelltransplantation aufgrund des Risikos einer abweichenden Differenzierung und Karzinogenese unerwünscht. Da Schwann-Zellvorläufer mit Axonbündeln innerhalb des embryonalen peripheren Nervs 8 assoziiert sind, wurden wir zu kokulturen SCLCs mit gereinigten embryonalen DRG-Neuronen 7 ,Ass = &quot;xref&quot;&gt; 9 Die resultierenden reifen Schwann-Zellen sind schicksalhaft engagiert und zeigen die Funktion in vitro 7 , 9 und in vivo 10 . Unser Protokoll für die Anreicherung von neuronalen Progenitoren aus MSCs ist einfach und effizient und führt zu einer Erhöhung der Zellzahl für nachfolgende Assays. Die Ableitung von Schicksal-engagierten Schwann-Zellen über die Coculture-Plattform ermöglicht die Untersuchung der Glia-Differenzierung und die Erzeugung von stabilen und funktionellen Schwann-Zellen für eine mögliche klinische Anwendung.

<table><tbody><tr><td>&alpha; MEM</td><td>Sigmaaldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermofisher scientific</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Thermofisher scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biosera</td><td>FB-1280/500</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher scientific</td><td>17504-001</td><td></td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)</td><td>Thermofisher scientific</td><td></td><td></td>PHG0313</tr><tr><td>Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-18B/100UG</td><td></td></tr><tr><td>Nervenwachstumsfaktor (NGF)</td><td>Millipore</td><td>NC011</td><td></td></tr><tr><td>Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor-AA (PDGF-AA)</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>Heregulin beta-3, EGF-Domäne (&beta;-Her)</td><td>Millipore</td><td>01-201</td><td></td></tr><tr><td>Uridin</td><td>Sigmaaldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluro-2' - Desoxyuridin (FDU)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin (PDL)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>P7886-1G</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin (P/S)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Platte für adhärente Kultur</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Wird für die Selektion von MSCs durch Gewebekultur-Adhärenz</td></tr> verwendet <tr><td>6-Well-Platte für adhärente Kultur</td><td>TPP</td><td>92006</td><td>Wird für die Expansion von MSCs nach Passage</td></tr><tr><td>verwendet UltraLow 6-Well-Platte für nicht-adhärente Kultur</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>Wird für die Anreicherung von neuralen Vorläuferzellen</td></tr> verwendet Anti-Human-CD90<tr><td>(Thy-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>555593</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>550256</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mensch/Ratte STRO-1</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1038</td><td></td></tr><tr><td>menschenfeindliches Nestin</td><td>F& Forschung D Systems</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>555480</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratten-CD90(Thy-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>554895</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratten-CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>551123</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratten-Nestin</td><td>BD Biosciences</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratten-CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>554875</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S100&Beta;</td><td>Dako</td><td>Z031101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p75</td><td>Millipore</td><td>MAB5386</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFAP</td><td>Sigmaaldrich</td><td>G3893</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klasse III-beta-Tubulin (Tuj-1)</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Humane</td><td>Kerne Millipore</td><td>MAB1281</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxiekammer</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Puffer</td><td>Sigmaaldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

hypoxische vorkonditionierung von marrow-abgeleiteten progenitor-zellen als quelle für die erzeugung von reifen schwann-zellen

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Dieses Manuskript beschreibt ein Mittel, um neuronale Progenitoren aus der Pop-Pop-Pop-Population (MSC) zu bereichern und danach auf das reife Schwann-Zellschicksal zu lenken. Wir unterwarfen Ratten- und menschliche MSCs vorübergehenden hypoxischen Zuständen (1% Sauerstoff für 16 h), gefolgt von einer Expansion als Neurosphären auf Niedrig-Attachment-Substrate mit epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) / basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) -Anpassung. Neurosphären wurden auf Poly-D-Lysin / Laminin-beschichtete Gewebekultur-Plastik ausgesät und in einem gliogenen Cocktail mit β-Heregulin, bFGF und Thrombozyten-Wachstumsfaktor (PDGF) kultiviert, um Schwann-Zell-ähnliche Zellen (SCLCs) zu erzeugen. Die SCLCs wurden für 2 Wochen mit gereinigten Dorsalwurzelganglien (DRG) -Neuronen, die von E14-15-schwangeren Sprague-Dawley-Ratten erhalten wurden, über die Kokultur gerichtet. Reife Schwann-Zellen zeigen die Persistenz bei der S100β / p75-Expression und können Myelinsegmente bilden. Auf diese Weise erzeugte Zellen haben das Potential aAnwendungen in autologen Zelltransplantationen nach Rückenmarksverletzungen sowie bei der Krankheitsmodellierung.

Eine Übersicht über die wichtigsten Stufen in unserem Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Zusammenfassend werden Ratten- und menschliche MSCs durch die Einhaltung von Gewebekulturplastik ausgewählt. Expandierte MSCs sind mit Hypoxie vorkonditioniert und unterliegen dann Neurosphären-bildenden Bedingungen. Neurosphären sind plattiert und können in SCLCs differenzieren. SCLCs werden mit gereinigten DRG-Neuronen cocultured, um Schicksal-engagierte Schwann...

Marrow Stromazellen (MSCs) mit neuronalen Potenzial gibt es im Knochenmark. Unser Protokoll bereichert diese Population von Zellen durch hypoxische Vorkonditionierung und leitet sie dann zu reifen Schwann-Zellen.

Hypoxische Vorkonditionierung von Marrow-abgeleiteten Progenitor-Zellen als Quelle für die Erzeugung von reifen Schwann-Zellen

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Das übergeordnete Ziel dieser Zellkulturmethode besteht darin, neuralen Vorläuferzellen aus dem Knochenmark anzureichern, um deren Differenzierung in funktionelle Schwann-Zellen zu ermöglichen. Diese Methode löst ein zentrales Problem in der Stammzell- und regenerativen Medizin: wie man aus einer begrenzten Quelle an neurogenen Vorläuferzellen Gliazellen erzeugt, um die axonale Regeneration und Remyelinisierung nach Verletzungen zu unterstützen. Ein Vorteil dieser Technik liegt in der effizienten Kulturkonditionierung, die die Vermehrung neuraler Zellen aus Knochenmarkstromazellen fördert und deren Einsatz in der autologen Zelltherapie ermöglicht.Nach zwei Tagen in Kultur entfernen Sie 75 % des verbrauchten Mediums und der nicht anhaftenden Zellen und waschen die anhaftenden Zellen dreimal mit jeweils 10 Millimeter PBS. Ersetzen Sie nach dem dritten Waschschritt das PBS durch 10 Milliliter Wachstumsmedium für Markstromazellen (MSCs) und stellen Sie die Kultur wieder in den Inkubator. Sichtbare Kolonien sollten bis zum sechsten bis siebten Tag erscheinen.Am Tag 10 die Kultur mit frischem PBS waschen und die Zellen mit 1,5 Milliliter rekombinantem enzymatischem Zell-Dissociationsreagenz ablösen. Nach fünf Minuten bei 37 Grad Celsius drei Milliliter MSC-Wachstumsmedium hinzufügen, um die Reaktion zu neutralisieren, und die abgelösten Zellen durch Zentrifugation sammeln. Den Zellpellet in fünf Milliliter frischem MSC-Wachstumsmedium resuspendieren und die Zellen mit einer Dichte von vier mal 10 hoch vier Zellen pro Quadratzentimeter in einer neuen 10-Zentimeter-Zellkulturschale ansäen.Die Zellen sollten innerhalb von zwei Tagen nach dem Passagieren eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreichen. Für die hypoxische Präkonditionierung zunächst die Ringklemme lösen und die freiliegenden Teile mit 70 %igem Ethanol reinigen. Danach die Hypoxiekammer weiter in ihre Bestandteile zerlegen und diese in eine laminare Luftströmungskabine zur Sterilisation unter UV-Licht für 15 Minuten geben.Als Nächstes wird eine 80 bis 90 % konfluente MSC-Kultur mit 10 Milliliter PBS gewaschen, wie gerade gezeigt, und die Kulturen werden mit frischem MSC-Wachstumsmedium, das mit 25 Millimolar HEPES ergänzt ist, behandelt. Die behandelte Kultur wird in die wieder zusammengesetzte Hypoxiekammer gegeben und die Ringklemme festgezogen. Die Verbindungsstellen der Kammer werden abgedichtet, um sicherzustellen, dass kein Gas entweichen kann, und ein Gasgemisch aus 99 % Stickstoff und 1 % Sauerstoff wird mit einer Flussrate von 10 Litern pro Minute in die Kammer eingeleitet.Nach fünf Minuten die Kammer 16 Stunden lang in den Zellkultur-Inkubator stellen. Am nächsten Morgen die Zellen wie zuvor gezeigt ablösen und durch Zentrifugation sammeln. Den Pellet in Neuralstammzell-Medium resuspendieren und sechs mal 10 hoch drei Zellen pro Quadratzentimeter auf Low-Attachment-6-Well-Platten für die Kultur bei 37 Grad Celsius und 5 %CO2 über 12 Tage aussäen.Bis zum sechsten bis siebten Tag sollten beträchtliche, nicht-anklebende Zellsphären zu beobachten sein. Zwischen dem 10. und 12. Tag sind in hypoxischen Kulturen mehr Neurosphären erkennbar als unter Normoxie. Am 12. Tag überführen Sie die Neurosphären mithilfe einer 10-Milliliter-Pipette in ein 15-Milliliter-Konischgefäß und sammeln die Neurosphären durch Zentrifugation ein.Suspendieren Sie die Sphären in DMEM/F12 und geben Sie fünf bis 10 Neurosphären pro Quadratzentimeter auf mit Poly-D-Lysin-Laminin beschichtete 6-Loch-Platten, jeweils mit 1,5 Milliliter Glialinduktionsmedium pro Brunnen. Kultivieren Sie die Sphärenkultur mindestens sieben Tage lang und erneuern Sie das Medium alle drei Tage. Um die Spinalganglien zu isolieren, überführen Sie das erste Embryo in eine 10 cm große Kulturschale, die PBS bei Raumtemperatur enthält, unter dem Stereomikroskop in Bauchlage und führen Sie feine chirurgische Pinzetten beidseits des Rückenmarks ein.Unter Verwendung der stumpfen Dissektion das Rückenmark mit einer Pinzette vom umgebenden Bindegewebe lösen, wobei das Rückenmark entlang der Halsöffnung und des Schwanzstumpfs ausgeschnitten wird. Entfernen Sie das verbleibende Bindegewebe vom freigelegten Rückenmark, bis nur noch das Rückenmark, die Nervenwurzeln und die daran befestigten Spinalganglien übrig sind. Lösen Sie die einzelnen Spinalganglien von ihren anhängenden Nervenwurzeln. Verwenden Sie dann einen Pipettenstift mit einer 1 ml-Pipettenspitze, um bis zu 100 dorsale Wurzelganglien in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit PBS zu überführen. Sammeln Sie die Ganglien durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets in 200 µL eines rekombinanten enzymatischen Zell-Dissociationsreagenz pro Röhrchen. Nach 10 Minuten bei 37 °C zentrifugieren Sie die dorsalen Wurzelganglien erneut und pipettieren die Pellets vorsichtig mit einer 200-µL-Pipettenspitze in Erhaltungsmedium für Neuronen der dorsalen Wurzelganglien.Säen Sie die Zellen der Spinalganglien mit einer Dichte von fünf mal 10 hoch drei Zellen pro Quadratzentimeter auf 6-Loch-Platten, die mit Poly-D-Lysin und Laminin beschichtet sind, in jeweils 1,5 Milliliter Spinalganglien-Neuronen-Erhaltungsmedium pro Loch aus. Nach zwei Tagen Kultivierung bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 waschen Sie die Zellen und geben die neuronale Zellkultur für weitere zwei Tage in frisches Spinalganglien-Neuronen-Reinigungsmedium zurück in den Inkubator. Nach drei bis vier Zyklen der Erhaltung und Reinigung sollten die Spinalganglien-Zellkulturen positiv für den neuronalen Marker Tuj-1 und negativ für den glialen Zellmarker S100 beta testen.Am siebten Tag der Kultivierung schwannschen Zell-ähnlicher Zellen die Zellen mit PBS spülen und anschließend mit 0,5 Milliliter rekombinantem enzymatischem Zell-Dissociationsreagenz pro Vertiefung bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten ablösen. Den Zellpellet in Co-Kultur-Medium resuspendieren und die schwannschen Zell-ähnlichen Zellen auf die gereinigte neuronale Kultur des dorsalen Wurzelganglions mit einer Dichte von 1 × 10³ Zellen pro Quadratzentimeter säen. Die Co-Kultur wird 14 Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO₂ durchgeführt. Gesunde MSCs weisen eine zugespitzte Morphologie auf, im Gegensatz zu der viereckigen Erscheinung von MSCs, die über eine hohe Anzahl von Passagen kultiviert wurden und ihre Multipotenz verloren haben.Erweiterte MSC-Kolonien sollten die Expression von MSC-Markern, das Fehlen von hämatopoetischen Stammzellmarkern sowie die Differenzierungsfähigkeit in adipogene, osteogene und chondrogene Linien aufweisen. Gesunde MSC-Kulturen, die einer hypoxischen Präkonditionierung unterzogen wurden, bilden Neurosphären, die sowohl in Anzahl als auch in Größe größer sind. Die Reinheit des Netzwerks der Rückenwurzelganglion-Neuronen kann durch den Nachweis des neuronalen Markers Tuj-1 und das gleichzeitige Fehlen des Schwann-Zell-Markers S100 bestätigt werden.Nach 14 Tagen in Kultur mit Dorsalwurzelganglion-Neuronen erwerben schwannsche Zell-ähnliche Zellen die Merkmale und funktionellen Eigenschaften ausgereifter, zellliniendeterminierter Schwann-Zellen. Einmal beherrscht, kann die Subpopulation der neuralen Vorläuferzellen innerhalb von 10 Tagen in menschlichen oder rativen BMSCs expandiert werden, sofern die Zellvermehrungstechnik korrekt durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig sicherzustellen, dass die BMSC-Probe über nestinpositive neurogene Vorläuferzellen verfügt und alle CD45-positiven hämatopoetischen Vorläuferzellen entfernt wurden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man BMSCs beschafft, die neuronale Vorläuferzellsubpopulation anreichert und die Differenzierung neuronaler Vorläuferzellen in fatespezifische Schwann-Zellen lenkt, um diese zur Verbesserung des axonalen Regrowths und der Remyelinisierung nach traumatischen Verletzungen einzusetzen. Mit dieser Methode können myelinisierende Gliazellen, wie reife Schwann-Zellen, gewonnen werden, die für die Entwicklung von Therapien bei demyelinisierenden Verletzungen und Erkrankungen sowohl des peripheren als auch des zentralen Nervensystems verwendet werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Gewinnung von Schwann-Zell-ähnlichen Zellen aus multipotenten Knochenmark-Stromazellen (BMSCs). Zunächst werden die BMSCs einer Hypoxiebehandlung unterzogen, gefolgt von einer gerichteten Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen. Anschließend werden spezifische Medien und Kulturbedingungen eingesetzt, um die Transformation dieser Vorläuferzellen in Schwann-Zell-ähnliche Zellen zu induzieren.

Erzeugung von Schwann-Zell-ähnlichen Zellen aus Stromazellen des Knochenmarks

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Isolierung von Neuronen des dorsalen Wurzelganglion (DRG) aus Rattenembryonen und deren Co-Kultivierung mit Schwann-Zell-Vorläufern, um reife Schwann-Zellen zu erzeugen. Die isolierten DRGs werden verarbeitet, um Neuronen und Gliazellen zu isolieren. Die isolierten Zellen werden kultiviert, um die Neuronen zu reinigen, die dann mit Schwann-Zell-ähnlichen Zellen (SCLCs) in einem Co-Kulturmedium co-kultiviert werden. Die Interaktion mit den DRG-Neuronen führt...

Isolierung von DRG-Neuronen und Kokultur mit Schwann-Zell-Vorläufern zur Erzeugung von Schwann-Zellen

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten. Allerdings Progression durch einem pluripotenten Zustand und mühsame Wieder Differenzierung noch behindert klinischen Übersetzung. Hier beschreiben wir die Ableitung der erwachsenen menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umsetzung in induzierten neuronalen Vorläuferzellen und die nachfolgende Differenzierung in neuronale Abstammungen.

Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Wir zeigen, wie zu identifizieren und zu isolieren 6 Teilmengen der myeloischen Vorläuferzellen aus murinen Knochenmark mit einer Kombination von magnetischen und Fluoreszenz (MACS und FACS) sortieren. Dieses Protokoll kann für in-vitro- Kultur-Assays (Methylcellulose oder Flüssigkeit Kulturen), in Vivo Adoptiv Transfer Experimente und RNS/Protein-Analysen verwendet werden.

Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark

Die Neuron-Glia-Interaktionen bei der Neurodegeneration sind aufgrund unzureichender Werkzeuge und Methoden nicht gut verstanden. Hier beschreiben wir optimierte Protokolle zur Gewinnung induzierter Neuronen, Oligodendrozytenvorläuferzellen und Oligodendrozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen und geben Beispiele für die Werte dieser Methoden zum Verständnis zelltypspezifischer Beiträge bei der Alzheimer-Krankheit.

Generierung humaner Neuronen und Oligodendrozyten aus pluripotenten Stammzellen zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen

Wir beschreiben drei Methoden der Knochenmarktransplantation (BMT): BMT mit Ganzkörperbestrahlung, BMT mit abgeschirmter Bestrahlung und BMT-Methode ohne Vorkonditionierung (adoptive BMT) zur Untersuchung der klonalen Hämatopoese in Mausmodellen.

Knochenmarktransplantationsverfahren bei Mäusen zur Untersuchung der klonalen Hämatopoese

Dieses Protokoll beschreibt die intrafemorale Injektion einiger hämatopoetischer oder leukämischer Stammzellen, einschließlich geneditierter Zellen, in murine Xenotransplantatmodelle, die nicht nur eine schnelle und sichere Transplantation von Zellen, sondern auch serielle Analysen des Knochenmarks ermöglichen.

Vereinfachte intrafemorale Injektionen mit lebenden Mäusen ermöglichen eine kontinuierliche Knochenmarkanalyse

In dieser Arbeit etablierten wir in vivo Osteo-Organoide, die durch knochenmorphogenetische Protein-2-beladene Gelatinegerüste ausgelöst wurden, um therapeutische hämatopoetische Stamm-/Vorläuferzellen für die Rekonstruktion eines geschädigten hämatopoetischen und Immunsystems zu gewinnen. Insgesamt kann dieser Ansatz eine vielversprechende Zellquelle für Zelltherapien darstellen.

In-vivo-Osteo-Organoid-Ansatz zur Gewinnung therapeutischer hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen

In diesem Protokoll wird die Ableitung von kardialen Vorläuferzellen sowohl aus maus als auch aus menschlichen embryonalen Stammzellen veranschaulicht. Eine wichtige Strategie in diesem Protokoll besteht darin, kardiale Vorläuferzellen mit Durchflusszytometrie unter Verwendung von Fluoreszenzreportern anzureichern, die in die embryonalen Stammzelllinien eingebaut werden.

Ableitung von Herzvorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen

Erfahren Sie die hypoxische Vorkonditionierung von Knochenmarkstromazellen zur Differenzierung in reife Schwann-Zellen. Diese Methode ermöglicht autologe Zelltherapien zur Förderung axonalem Wachstums.

Hypoxische Vorkonditionierung von Marrow-abgeleiteten Progenitor-Zellen als Quelle für die Erzeugung von reifen Schwann-Zellen

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