Hypoxische Vorkonditionierung von Marrow-abgeleiteten Progenitor-Zellen als Quelle für die Erzeugung von reifen Schwann-Zellen

Das übergeordnete Ziel dieser Zellkulturtechnik ist die Anreicherung von neuralen Vorläuferzellen des Knochenmarks, um deren Differenzierung in funktionsfähige Schwann-Zellen zu erleichtern. Diese Methode befasst sich mit einem Schlüsselproblem in der Stammzell- und regenerativen Medizin: Wie kann eine begrenzte Quelle von Neuroprogenitoren genutzt werden, um Gliazellen zu erzeugen, um das posttraumatische axonale Nachwachsen und die Remyelinisierung zu unterstützen. Ein Vorteil dieser Technik ist die Verwendung einer effizienten Kulturkonditionierung, um die Expansion von Nervenzellen aus Knochenmarkstromazellen für deren Verwendung in der autologen Zelltherapie zu erleichtern.

Entfernen Sie nach zwei Tagen in Kultur 75 % des verbrauchten Mediums und der nicht adhärenten Zellen und spülen Sie die adhärenten Zellen mit drei 10-Millimeter-PBS-Wäschen. Ersetzen Sie nach der dritten Wäsche das PBS durch 10 Milliliter Wachstumsmedium aus Knochenmarkstomazellen (MSC) und stellen Sie die Kultur wieder in den Inkubator ein. Sichtbare Kolonien sollten am sechsten bis siebten Tag erscheinen.

Waschen Sie die Kultur an Tag 10 in frischem PBS und lösen Sie die Zellen mit 1,5 Millilitern rekombinantem enzymatischem Zelldissoziationsreagenz. Nach fünf Minuten bei 37 Grad Celsius fügen Sie drei Milliliter MSC-Wachstumsmedium hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren und die abgelösten Zellen durch Zentrifugation zu sammeln. Resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern frischem MSC-Wachstumsmedium und säen Sie die Zellen mit einer Dichte von viermal 10 bis 10 Zellen pro Quadratzentimeter in einer neuen 10 Zentimeter großen Gewebekulturplatte aus.

Die Zellen sollten innerhalb von zwei Tagen nach der Passage eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreichen. Für eine hypoxische Vorkonditionierung zuerst die Ringklemme lösen und die freiliegenden Teile mit 70%Ethanol reinigen. Zerlegen Sie die Hypoxiekammer weiter in Komponenten und legen Sie sie zur Sterilisation unter UV-Licht für 15 Minuten in eine Laminar-Flow-Haube.

Waschen Sie anschließend eine 80 bis 90 % konfluente MSC-Kultur mit 10 Millilitern PBS, wie gerade gezeigt, und behandeln Sie die Kulturen mit frischem MSC-Wachstumsmedium, das mit 25 Millimolar Hepes ergänzt wird. Legen Sie die behandelte Kultur in die wieder zusammengesetzte Hypoxiekammer und ziehen Sie die Ringklemme fest. Versiegeln Sie die Verbindungsenden der Kammer, um sicherzustellen, dass kein Gas austritt, und spülen Sie ein Gasgemisch aus 99 % Stickstoff und 1 % Sauerstoff mit einer Durchflussmenge von 10 Litern pro Minute in die Kammer.

Stellen Sie die Kammer nach fünf Minuten für 16 Stunden in den Zellkultur-Inkubator. Am nächsten Morgen lösen Sie die Zellen wie gerade gezeigt und sammeln sie durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet in neuronalem Vorläufermedium und säen Sie sechsmal 10 bis zu den dritten Zellen pro Quadratzentimeter auf 6-Well-Platten mit geringer Bindung für ihre Kultur bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 für 12 Tage.

Größenhafte, nicht adhärente Zellkugeln sollten bis zum sechsten bis siebten Tag beobachtet werden. An den Tagen 10 bis 12 traten in Hypoxie-konditionierten Kulturen mehr Neurosphären auf als in denen unter Normoxie. Am Tag 12 verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um die Neurosphären in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen zu überführen und die Neurosphären durch Zentrifugation zu sammeln.

Resuspendieren Sie die Kugeln in DMEM/F12 und plättieren Sie fünf bis 10 Neurosphären pro Quadratzentimeter auf Poly-D-Lysin-Laminin-beschichtete 6-Well-Platten in 1,5 Millilitern glialem Induktionsmedium pro Well. Bewahren Sie die Kugelzellkultur mindestens sieben Tage lang auf und erneuern Sie das Medium alle drei Tage. Um die Spinalganglien zu entnehmen, wird der erste Embryo in eine 10 Zentimeter große Kulturschale mit PBS bei Raumtemperatur unter einem Präpariermikroskop in Bauchlage übertragen und eine Mikro-Präparierzange entlang beider Seiten des Rückenmarks eingeführt.

Trennen Sie das Rückenmark mit einer stumpfen Dissektion vom umgebenden Weichgewebe und schneiden Sie das Rückenmark entlang der Halsöffnung und des Schwanzstummels mit einer Pinzette heraus. Entfernen Sie das restliche Weichgewebe aus dem befreiten Rückenmark, bis nur noch das Rückenmark, die Nervenwurzeln und das daran befestigte Spinalganglion übrig sind. Lösen Sie die einzelnen Spinalganglien von ihren verbindenden Nervenwurzeln.

Verwenden Sie dann einen Pipettenstift, der mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze ausgestattet ist, um bis zu 100 Spinalganglien in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit PBS zu übertragen. Sammeln Sie die Ganglien durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets in 200 Mikrolitern rekombinantem enzymatischem Zelldissoziationsreagenz pro Röhrchen. Nach 10 Minuten bei 37 Grad Celsius zentrifugieren Sie die Spinalganglien erneut mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um die Pellets im Erhaltungsmedium für Neuronen des Spinalganglion vorsichtig zu verreiben.

Die Zellen des Spinalganglienzelles werden mit fünf mal 10 bis 3 Zellen pro Quadratzentimeter auf Poly-D-Lysin-Laminin-beschichtete 6-Well-Platten in 1,5 Millilitern Erhaltungsmedium für Neuronen des dorsalen Wurzelganglien-Neurons pro Well ausgesät. Nach zwei Tagen in Kultur bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 waschen Sie die Zellen und geben Sie die neuronalen Zellkulturen für weitere zwei Tage in den Inkubator in frisches Aufreinigungsmedium für Spinalganglien-Neuronen zurück. Nach drei bis vier Erhaltungs- und Aufreinigungszyklen sollten die Zellkulturen der Spinalganglien positiv auf den neuronalen Marker Tuj-1 und negativ auf den Gliazellmarker S100 beta getestet werden.

Am siebten Tag der zellähnlichen Schwann-Zellkultur spülen Sie die Zellen in PBS, gefolgt von einer Dissoziation mit 0,5 Millilitern rekombinantem enzymatischem Zelldissoziationsreagenz pro Vertiefung bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten. Resuspendieren Sie das Zellpellet in Co-Kulturmedium und säen Sie die Schwann-Zell-ähnlichen Zellen auf die gereinigte Neuronenkultur des Spinalganglien-Neurons bei einmal 10 bis drei Zellen pro Quadratzentimeter für 14 Tage Co-Kultur bei 37 Grad Celsius und 5% CO2. Gesunde MSCs weisen eine konische Morphologie auf, im Gegensatz zum viereckigen Erscheinungsbild von MSCs, die über eine hohe Anzahl von Passagen erhalten geblieben sind und ihre Multipotenz verloren haben.

Erweiterte MSC-Kolonien sollten die Expression von MSC-Markern, das Fehlen von hämatopoetischen Stammzellmarkern und die Fähigkeit zur Differenzierung in adiogene, osteogene und chondrogene Linien nachweisen. Gesunde MSC-Kulturen, die einer hypoxischen Präkonditionierung unterzogen wurden, weisen Neurosphären auf, die sowohl in der Anzahl als auch in der Größe größer sind. Die Reinheit des Neuronennetzwerks des Spinalganglien-Neurons kann durch die Expression des neuronalen Markers Tuj-1 und das gleichzeitige Fehlen des Schwann-Zell-Markers S100 bestätigt werden.

Nach 14 Tagen in Co-Kultur mit Neuronen des Spinalgangliens erwerben Schwann-Zell-ähnliche Zellen die Eigenschaften und funktionellen Eigenschaften reifer, schicksalsgebundener Schwann-Zellen. Einmal gemeistert, kann die subpopulation des neuronalen Vorläufers in BMSCs von Menschen oder Ratten innerhalb von 10 Tagen erweitert werden, wenn die Zellexpansionstechnik richtig durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, zu bestätigen, dass die BMSC-Probe mit Nestin-positiven Neurovorläufern ausgestattet ist und die CD45-positiven hämatopoetischen Vorläuferzellen alle entfernt wurden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man BMSCs beschafft, für die subpopulation der neuralen Vorläufer anreichert und die Differenzierung der neuralen Vorläuferzellen in schicksalhafte Schwann-Zellen lenkt, um das posttraumatische axonale Nachwachsen und die Remyelinisierung zu verbessern. Nach diesem Verfahren können myelinisierende Gliazellen, wie z. B. reife Schwann-Zellen, für ihre Verwendung bei der Entwicklung von Therapien für demyelinisierende Verletzungen und Erkrankungen sowohl des peripheren als auch des zentralen Nervensystems gewonnen werden.