Name: Eine neuartige Mamma-Fat-Pad-Transplantationstechnik zur Visualisierung der Gefäßerzeugung von vaskulären endothelialen Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Erfahren Sie eine neuartige Transplantationstechnik für Mamma-Fettpolster zur in vivo-Visualisierung der Gefäßbildung durch vaskuläre endotheliale Stammzellen. Diese Methode ermöglicht die funktionelle Bewertung transplantiertes Endothels.

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Diese Arbeit wurde von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (31530045 und 31371500 bis YAZ, 31401245 bis QCY), dem Ministerium für Wissenschaft und Technologie von China (2014CB964800), der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (XDB19000000 bis YAZ) und den Chinesen unterstützt Gesellschaft der Zellbiologie (Early Career Fellowship to QCY).

Experimentelle Verfahren wurden vom Tierpflege- und -nutzungsausschuss des Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, unter dem genehmigten Protokoll SIBCB-NAF-15-002-S335-003 genehmigt. 1. Isolierung von VESCs aus der Maus Mammadrüse <ol><li> Mammadrüse Ernte und Gewebe Verdauung. <ol><li> Verwenden Sie 8 Wochen alten Actin-GFP reifen Jungfrau Reporter Mäuse, mit Gewichten Bereich zwischen 20 und 25 g, als Gewebe Spender. Hinweis: Zellen, die aus dem Spender stammen, können durch GFP-Expression leicht verfolgt werden. </li><li> Vorbereitung des Gewebeverdauungsbasismediums, bestehend aus 5% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Pen / Strep und 25 mM HEPES in RPMI1640. Filtriere die Mischung durch einen 0,22 μm Filter zum Sterilisieren und Vorwärmen auf 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Opfer die Mäuse in einer CO 2 -Kammer. Zerlegen Sie das vierte Paar von Leisten-Brustdrüsen, indem Sie zuerst eine vertikale Haut machenNcision an der unteren abdominalen Mittellinie mit einem Skalpell (oder chirurgische Schere). Die Haut vorsichtig auf eine Seite schälen, um die Leisten-Brustdrüse mit einer Pinzette freizulegen. Erhalten Sie die vierten Leistendrüsendrüsen von beiden Seiten und schneiden Sie sie in feine Stücke in einer 6 cm Petrischale mit Schere. <ol><li> Messen Sie das Gesamtgewicht des gehackten Gewebes und legen Sie es in ein 50 ml Röhrchen. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die resultierende Gewebe-Hackfleisch kleiner als 1 mm 3 in der Größe für jedes Stück ist. Eine typische Ausbeute beträgt etwa 5.000 VESCs pro Tier. </li></ol></li><li> Bereiten Sie das Verdauungsbasismedium in einem 50-ml-Capped-Zentrifugenröhrchen mit einem Volumen von 10 ml pro 1 g Gewebehackfleisch vor. Füge Kollagenase Typ 3 bei einer Konzentration von 300 Einheiten pro 10 ml Verdauungsgrundmedium hinzu, um den Verdauungspuffer zu bilden. Mischen Sie gleichmäßig und fügen Sie es dem Gewebe Hackfleisch hinzu. </li><li> Stellen Sie das 50-ml-Zentrifugenröhrchen waagerecht auf eine Schaukelplattform und stellen Sie die Geschwindigkeit auf 100 U / min und die Temperatur auf 37 ° C ein. RührenDas Milchgewebe für 2 h. Überprüfen und manuell schütteln Sie die Tube alle 20 min, um eine ordnungsgemäße Verdauung zu gewährleisten. Anmerkung: Der Zweck der Gewebeverdauung vor FACS besteht darin, eine Einzelzelllösung aus festem Gewebe herzustellen. Daher sollte der Inhalt bis zum Ende der Verdauung eine dicke Lösung ohne sichtbare Gewebestücke sein. </li></ol></li><li> Einzellige Lösungsvorbereitung. <ol><li> Nach der Verdauung das 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit vorgewärmtem, sterilem PBS auffüllen und das Röhrchen zur gleichmäßigen Vermischung umkehren. Das Röhrchen wird bei 200 xg für 5 min zentrifugiert, um ein Zellpellet zu erhalten. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und schlagen Sie den Boden des Tubus, um das Zellpellet zu lösen. Fügen Sie in 3 ml roter Blutzell lysieren Puffer (siehe die Tabelle der Materialien) und inkubieren in einer Gewebekultur Haube bei Raumtemperatur (RT) für 5 min, um die roten Blutkörperchen zu beseitigen. </li><li> 10 ml steriles PBS zugeben und das Röhrchen gleichmäßig mischen. Zentrifugieren Sie den Gewebegehalt bei 200 xg für 5 min und ScheibeDer Überstand. In 3 ml vorgewärmtes 0,05% Trypsin geben und das Röhrchen bei 37 ° C für 5 min aufbewahren, um das verbleibende Gewebe weiter zu verdauen. </li><li> In 3 ml vorgewärmtes IMDM geben und dann 100 μl DNase I-Lösung (0,25 mg DNase I, verdünnt in 1 ml PBS) zugeben. Das Röhrchen bei 37 ° C aufbewahren, um die DNA-Filamente aufzubrechen. Führen Sie die Gewegemischung durch einen 70 μm Zellsieb, um die Zelllösung zu erhalten. Spülen Sie das Sieb zweimal mit 2 ml PBS + 5% FBS, um die enzymatische Verdauung zu neutralisieren. </li><li> Die Zellmischung bei 200 xg für 5 min zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren. Den Überstand verwerfen und das Zellpellet in 1 ml PBS + 5% FBS zur Antikörperfärbung resuspendieren. </li></ol></li><li> FACS-basierte Procr + VESC-Isolation. <ol><li> Betrachten Sie die Zellmischung, die aus Spender-Mamma-Gewebe erhalten wurde, zur Antikörper-Färbung nach veröffentlichten Routine-Protokollen 8 . Anmerkung: Die folgenden Antikörper wurden verwendet: anti-MausBlut-Linie-FITC, anti-Maus CD31 (PECAM1) -PECY7, anti-Maus CD105-APC (alle verwendet bei einer Konzentration von 1 μg / ml), anti-Maus CD201 (Procr) -biotin (bei einer Konzentration von 2,5 verwendet Μg / ml) und Streptavidin-v450 (bei einer Konzentration von 0,5 μg / ml) verwendet. <ol><li> Nach der Antikörperfärbung die Zellen mit PBS + 5% FBS auffüllen und dann bei 200 g für 5 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit 1 ml PBS + 5% FBS. Filter durch einen 40 μm Zellsieb. Platz auf Eis bis FACS Sortierung. </li></ol></li><li> Führen Sie die FACS-basierte Sortierung aus, um Procr + VESCs zu isolieren. <ol><li> Analysieren Sie die ungefärbte Probe und jede einfarbige Kontrolle, um die Spannung für jede Farbe zu bestimmen. Berechnen Sie die Kompensationsparameter, um Auto-Fluoreszenz- oder Hintergrundfärbung zu vermeiden. Richten Sie die Vorlage für die richtige Gating und Sortierung für die gewünschten Zellpopulationen ein. </li><li> Um die Hierarchie der FACS-Sortierung zu etablieren, beseitigen Sie zuerst Schutt vonAlle Ereignisse und verwerfen dann Dubletts oder Klebstoffcluster durch Auslösung mit Breite. Gate-out Blutlinie-Zellen und dann verwenden CD31 + und CD105 +, um die endothelial Populationen zu definieren. Anmerkung: Procr + Zellen wurden aus CD31 + CD105 + ECs im Vergleich zu einer FMO-Kontrolle isoliert. Eine repräsentative FACS-Analysekurve ist in 1 gezeigt . Eine FACS-isolierte VESC-Population sollte in IMDM + 50% FBS suspendiert und bis zur Weiterverarbeitung auf Eis gelagert werden. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. In vivo VESC-Schiffsbildungs-Assay mit dem Mamma-Fett-Pad <ol><li> Primäre ECs für die Transplantation vorbereiten. <ol><li> Die FACS-sortierten Zellen mit 10 ml PBS + 5% FBS auffüllen und dann bei 200 xg für 5 min zentrifugieren, um die Zellen bis zum Boden zu säubern. </li><li> Die Flüssigkeit sorgfältig einatmen, die Zellzahl mit einem Hämocytometer zerlegen und das Zellpellet mit der Basalmembranmatrixmischung resuspendieren (consiStachel von 50% Basalmembranmatrix und PBS mit 20% FBS, ergänzt mit 100 ng / mL rmVEGF und 60 U / ml Heparin), um eine Arbeitskonzentration von 15.000 Zellen / 15 μl zu erreichen. Hinweis: Die Basismembranmatrixmischung sollte immer auf Eis gelagert werden. </li><li> Seriell verdünnen die sortierten und gezählten Zellen, um die erforderlichen Eingangskonzentrationen in einem 1,5-ml-Mikroröhrchen zu erreichen, wobei sichergestellt wird, dass die endgültigen Einspritzvolumina insgesamt 15 μl nicht überschreiten. Füge 0,1% Trypanblau zu jeder Röhre für eine bessere Inhaltsvisualisierung während der Transplantation hinzu. Pipette gründlich mischen. Die Röhrchen bis zum Gebrauch auf Eis aufbewahren. Hinweis: Eine erfolgreiche Schiffsgenerierung konnte mit mindestens 100 VESC erreicht werden. </li></ol></li><li> Transplantation primäre ECs auf die Brust-Fett-Pad. <ol><li> Desinfizieren Sie die chirurgischen Instrumente und Tisch. Bei Verwendung der gleichen Instrumente bei mehreren Tieren kann ein Wulststerilzer zur Desinfektion verwendet werden. </li><li> Anästhesieren Sie das 3-wöchige BALB / c-Nude-MikrofonE unter Verwendung des Anästhesieprotokolls, das von Ihrem Tierarzt und IACUC empfohlen wird. Lege jede Maus in Rückenlage, mit dem Rücken auf der Operationstabelle. Immobilisieren Sie die Gliedmaßen mit Klebeband. </li><li> Dip ein Wattestäbchen in Iod-basierte antiseptische Lösung. Wischen Sie den gesamten Bauchbereich der Maus gründlich ab, um die Hautoberfläche vor der Operation zu sterilisieren. </li><li> Halten Sie und heben Sie die Bauchhaut der Maus mit Pinzette an. Verwenden Sie ein chirurgisches Skalpell, um einen kleinen, 1 cm vertikalen Schnitt zu machen. Machen Sie zwei Schnitte von etwa 0,5 - 1 cm Länge, jeweils in Richtung Hinterbein, um einen umgedrehten, Y-förmigen Schnitt zu erzielen. <ol><li> Verwenden Sie Pinzette und ein Wattestäbchen, um die Haut vorsichtig vom Bauch zu trennen und die Haut seitlich zu stecken, um die Leisten-Mamidrüsen zu entlarven. Legen Sie die Maus unter ein Stereoskop und stellen Sie die Vergrößerung auf 2.0X. Achten Sie darauf, den Fokus so einzustellen, dass das Mamma-Fett-Pad deutlich sichtbar und betrieben werden kann. </li></ol></li><li> Legen Sie eine 27G 1/2 &quot;needlE auf Eis vorkühlen. Prime eine 1-ml-Spritze mit Basalmembran-Matrix-Mischung im Voraus, um mögliche Luftblasen zu entfernen, die in der Nadel-Befestigungsregion gefangen sind. 15 μl gemischte Lösung auf die Kappe des Mikrozentrifugenröhrchens pipettieren und dann das gesamte Volumen in die grundierte Spritze absaugen. </li><li> Halten Sie das Mamma-Fett-Pad vor dem Leisten-Lymphknoten, mit feinen Pinzetten, und heben Sie es leicht für eine einfache Injektion. Setzen Sie etwa 1/4 der Spritze Nadel sanft in die Fett-Pad. <ol><li> Lösen Sie die Pinzette aus dem Fad-Pad, um die Spritzen-Nadel zu greifen und zu stabilisieren. Die Lösung langsam einspritzen, um Flüssigkeitsleck zu vermeiden. Halten Sie für ein paar Sekunden, um sicherzustellen, dass die Zellmischung verfestigt wird, um die Leckage beim Herausziehen der Nadel zu minimieren. </li></ol></li><li> Schließen Sie die Hautklappe mit resorbierbaren Nähten. Naht die Hautklappe mit der Größe 5-0 nicht reaktive Monofilament Naht und schließen Sie die Wunden mit einem Chirurgen-Stil Knoten, jeder Knoten approximCa. 0,3 cm auseinander. Alternativ schließen Sie die Haut mit Wundheftklammern. </li><li> Legen Sie betriebene Mäuse in einen separaten Käfig zur Verwertung. Legen Sie eine Heizlampe über den Käfig, um zu verhindern, dass die anästhesierten Mäuse an einer Hypothermie leiden. Legen Sie weiches Papier und Baumwolle an der Unterseite des Käfigs, um die Mäuse warm nach der Operation zu halten. <ol><li> Beobachten Sie die Mäuse sorgfältig, bis alle Empfänger ganz wach sind. Für die nächsten Tage gelten postoperative Analgetika präventiv für alle Tiere oder wie vom Tierarzt geleitet. Anwenden von Antibiotika nach dem zugelassenen Tierprotokoll, wenn eine Wundinfektion auftritt. Wenn die chirurgische Wunde mit Wundheftklammern verschlossen wurde, entfernen Sie die Wundclips 10 Tage nach der Operation, wenn die Wunde vollständig geschlossen ist. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Vollständige Gewebevorbereitung für die mikroskopische Beobachtung <ol><li> Gewebeernte <ol><li> Bei 2 - 4 Wochen nach der Implantation den Empfänger BALB / c anästhesierenNacktmäusen mit einer intraperitonealen Injektion von 2,5% Anästhesierungsmittel in einer Dosierung von 0,12 ml pro 20 g Körpergewicht, wie in Schritt 2.2.2. Anmerkung: Das positive Gefäßwachstum kann 2 - 4 Wochen nach der Zelltransplantation nachgewiesen werden. </li><li> Markieren Sie die systemische Zirkulation des Empfängers mit einer Schwanzveneninjektion von Isolectin-647-Farbstoff bei einer Dosierung von 50 μg / 25 g Körpergewicht, resuspendiert in 50 μl sterilem PBS. Erlaube eine Ruhezeit von 5 - 10 min. Opfer die Mäuse mit CO 2 . </li><li> Den Bereich des Brustgewebes herausziehen, wo die Zellen zunächst nach Schritt 2.2.4 injiziert wurden; Chirurgische Schere benutzen. Mit einer chirurgischen Klinge das Gewebe in etwa 3 bis 4 mm 3 Würfel in einer 6-cm-Petrischale schneiden. </li></ol></li><li> Gewebeverdauung und Vorbereitung auf Antikörperfärbung. <ol><li> Die Gewebestücke in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen, verdünnt mit 10 ml vorgewärmtem Verdauungsgrundmedium (Schritt 1.1.2), ergänzt mit Kollagenase III, verdauen(300 U pro 10 ml). </li><li> Legen Sie das 15-ml-Zentrifugenröhrchen waagerecht auf eine Kippplattform, wobei die Geschwindigkeit auf 100 U / min eingestellt ist und die Temperatur für ca. 1 h auf 37 ° C eingestellt ist, um die Gewebestruktur zu lösen und übermäßiges Adipozytengewebe zu entfernen. Anmerkung: Adipozyten neigen dazu, Auto-Fluoreszenz zu produzieren, die zu einem lärmenden fluoreszierenden Hintergrund führen könnte. Am Ende der Verdauung sollten die Gewebeteile ein weiches, bewölktes Aussehen haben. Die optimale Verdauungsperiode hängt von der Größe der gehackten Gewebestücke ab und sollte daher entsprechend angepasst werden, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Da die Gewebevaskulatur bereits mit fluoreszenzmarkiertem Isolectin markiert wurde, sollten alle nachfolgenden Verfahren vor Licht geschützt werden. </li><li> Die Gewebestücke mit PBS bei RT für 10 min waschen. Fixieren Sie das Ganzband-Gewebe sorgfältig, indem Sie die Stücke sorgfältig in eine 6-cm-Petrischale halb voll mit 4% PFA (pH 7,2 - 7,4) platzieren, um die Fluoreszenz zu erhalten. Legen Sie die PetrischaleAuf einer Schaukelplattform und sanft das Gewebe für 30 min bei RT rühren. Hinweis: PFA ist krebserzeugend und sollte mit Vorsicht behandelt werden. </li><li> Entfernen Sie die verbleibende PFA und waschen Sie das feste Gewebe dreimal mit Ganzputz-Waschpuffer (0,1% Tween in PBS), mit einem 10-minütigen Intervall zwischen jeder Wäsche. </li></ol></li><li> Vollständige Gewebe-Antikörper-Färbung. <ol><li> Verdünnen Sie den primären Antikörper in Antikörper-Färbepuffer in einem 2-ml-Zentrifugenröhrchen. Das Gewebe mit primärem Antikörper über Nacht bei 4 ° C inkubieren. Anmerkung: Als primäre Antikörper wurden Ratten-anti-CD31 (Konzentration: 10 μg / ml) oder Ratten-Anti-VE-Cadherin (CD144 / Cdh5; Konzentration: 2,5 μg / ml) verwendet. Sowohl CD31 als auch VE-Cadherin sind Zelloberflächenmarker, die verwendet werden, um Endothel zu erkennen. 5x Antikörper-Färbepuffer wird mit 500 mM Maleinsäure, pH 7,5, hergestellt; 750 mM NaCl; Und 0,5% (v / v) Tween in PBS auflösen. Bei der Vorbereitung der frischen 1x Arbeitslösung nur ein geeignetes Serumvolumen (5%) einfüllen9 </li><li> Entfernen Sie den Antikörper-Färbepuffer und waschen Sie das Ganzband-Gewebe dreimal mit Waschpuffer, mit einem 10-minütigen Intervall. Inkubieren Sie das Gewebe mit sekundärem Antikörper (siehe Tabelle der Materialien ) plus DAPI bei RT für 4 h auf einer Schaukelplattform oder über Nacht bei 4 ° C. Hinweis: Verwenden Sie DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindol) mit einer Endkonzentration von 5 μg / ml, um die Kerne zu visualisieren. </li><li> Waschen Sie das Ganzband-Gewebe mit Waschpuffer 3 mal für jeweils 10 min. Inkubieren Sie die Gewebestücke in 80% Glycerin oder 80% Saccharose über Nacht, um das Gewebe zur besseren Konservierung zu dehydratisieren. </li><li> Legen Sie die einzelnen Gewebestücke auf einen Glasschieber und entfernen Sie den übermäßigen Dehydratationspuffer. Bedecken Sie das Gewebe mit dem Montagemedium, legen Sie ein Deckglas und drücken Sie das Gewebe vorsichtig, um es zu setzen. </li><li> Führen Sie konfokale mikroskopische Bilderfassung durch. Für Vollmauerdrüsen, erwerben Bilder mit einem 40X mit NA = 1,3 Öl objectiVe Erfassen Sie Fliesen-Scans von Z-Stacks bei einer optischen Schnittauflösung von 1.024 x 1.024 und einer Schichttrennung von 1,0 - 1,2 μm. Hinweis: Um das korrekte Fluoreszenz-Lichtsignal zu erfassen, sollte der Filterstrahl-Splitter auf Triple Dichroic (TD) 488/553/638 eingestellt werden, wobei die Verstärkungseinstellung bei PMT Gain 600-800 liegt. Es sollten folgende Anreiz- / Emissionsquellen verwendet werden: mGFP, mit Anregungs- / Emissionsmaxima von 488/509 nm; MTomato mit Anregungs- / Emissionsmaxima von 532/588 nm; Alexa-647, mit Erregungs- / Emissionsmaxima von 594/665; Und DAPI mit Erregungs- / Emissionsmaxima von 350/470. </li></ol></li></ol> 4. Abstufung mit einem genetisch modifizierten Mausmodell <ol><li> Erkennung von Procr + VESCs mit dem Mausmodell. <ol><li> Verwenden Sie die Procr CreERT2-IRES-tdTomato / + (bezeichnet als Procr CreERT2 ) Knock-in Maus-Stamm. Hinweis: In diesem Mausmodell eine CreERT2-IRES-tdTomato- Kassette Procr 11 eingefügt. <ol><li> Cross Procr CreERT2 Mäuse mit dem Rosa26 mTtomatomGFP (bezeichnet als R26 mTmG ) Reporterstamm, um das Schicksal von endogenen Procr + ECs in vivo 11 zu verfolgen. Identifizieren Sie alle markierten endogenen Procr + ECs und ihre Abkömmlinge mit GFP-Expression. </li></ol></li><li> Manipulieren Sie Tamoxifen-Lösung 11 (10 mg Tamoxifen, gelöst in 1 ml Erdnußöl + 10% Ethanol, um eine Stammlösung von 10 mg / ml zu bilden) intraperitoneal in einer Dosis von 4 mg / 25 g Körpergewicht während der Pubertätsstufe (5 Wochen Alt), um das Entwicklungsschicksal von Procr + ECs zu verfolgen. </li><li> Analysieren Sie die Klon-bildende Effizienz von markierten Zellen durch Vollmontage-Immunfärbung nach den in Schritt 3 beschriebenen Herstellungsschritten. Erhalten Sie Mamma-Fett-Pads von behandelten Mäusen sowohl nach kurzzeitiger (2 Tage) und verlängerte Zeiträume (bis zu 10 Monate). Siehe Abbildung 3 . </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Angiogenese-Assays stellen einen guten experimentellen Ansatz dar, um die Gefäßdynamik zu untersuchen. Maus retinalen Gefäß, die postnatal entwickelt, hat sich als ein attraktives Modell sein Angiogenese 12 zu studieren. Obwohl es relativ zugänglich ist, ist die tatsächliche Manipulation innerhalb des Retina-Gefäßbettes ziemlich schwierig. Bisher war die am besten beschriebene in vivo- Transplantation der Plug-Assay, der Zellen in einer Basalmembran-Matrixmasse umgibt und chirurgisch imp...

Während der Entwicklung und Homöostase findet das Gefäßwachstum und die Umgestaltung nach Organwachstum und -reparatur statt. Die Angiogenese beschreibt die Erzeugung neuer Gefäße aus bereits vorhandenen Blutgefäßen und wird als eine wichtige Kraft angesehen, die diese dynamischen vaskulären Veränderungen vermittelt. Jedes Blutgefäß ist mit einer Schicht von Endothelzellen (ECs) innerlich ausgekleidet, und sie scheinen die Grundlage der Gefäßarchitektur zu sein. Der Mechanismus, durch den der EC-Pool während der Homöostase aufgefüllt wird, blieb lange Zeit unklar, und es wurden Argumente erhoben, ob der Gefäßumsatz das Ergebnis einer reifen EG-Proliferation ist oder der Beitrag der vaskulären Stamm- / Vorläuferzellaktivitäten ist. Aufgrund des Mangels an direkten physiologischen Beweisen blieb die Existenz und die zelluläre Identität der vaskulären endothelialen Stammzellen (VESCs) ebenfalls umstritten. Eine der häufigsten Ansätze zur Verifizierung des Stammzellverhaltens ist durch den TransplanTaten von putativen Stammzellen in Empfängermäusen. Diese Methode misst das Stemnesspotential der Kandidatenstammzellen in vivo. Die Transplantation wurde zuerst auf die Untersuchung von Knochenmarkstammzellen 1 angewendet, die zur Etablierung der hierarchischen Eigenschaften des hämatopoetischen Systems 2 beigetragen haben. Im endothelialen Feld wurde ein unterhalb der Flankenhaut subkutan eingelegter Basalmembranmatrix ( z. B. Matrigel) -Stift ein Standard- In-vivo- Angiogenese-Assay, der verwendet wurde, um die Gefäßbildungsfähigkeiten von transplantierten ECs zu adressieren. Mehrere experimentelle Methoden, einschließlich Koloniebildung in 3D-Kultursystemen und Transplantation, haben potenzielle EC-Progenitor- / VESC-Populationen 3 , 4 , 5 , 6 vorgeschlagen . Da jedoch ECs, die in die Basalmembranmatrix eingebettet sind, relativ getrennt sindDas umliegende Gewebe, bietet dies nicht die optimale Nischenumgebung, die erforderlich ist, um das angiogenetische Potential von transplantierten Zellen vollständig zu erforschen. Infolgedessen sind die im Matrixstecker gebildeten Gefäße überwiegend kapillarartig und funktionell unermesslich. Die Brustdrüse entwickelt sich postnatal, wobei das robusteste Wachstum während der Pubertät und Schwangerschaft auftritt. Im Pubertalstadium erleidet das Mammaepithel eine rasche Expansion, um das ganze Brustfettkissen zu besetzen, begleitet von der effizienten Umgestaltung der umgebenden Gefäßstrukturen. So bietet die Brustdrüse ein hervorragendes Modell für die Untersuchung der Angiogenese. Es bietet Raum, Matrix und reiche angiogene Reize aus dem wachsenden Mammaepithel und ist daher eine ideale Pfropfstelle für die Beurteilung des angiogenen Potentials exogener Zellen. Darüber hinaus ermöglicht das Brustfett-Pad die geformten exogenen Gefäße mit dem Wirtszirkulationssystem zu integrieren, so dass weitere fUnreduzierte Bewertung und einen Vorteil gegenüber der subkutanen Transplantation darstellen. Obwohl in vitro Kultivierungs- und Transplantationsassays als wirksame Methode zur Untersuchung der Regenerationseigenschaften einer Zellpopulation sind, ist es bekannt, dass solche Assays die Plastizität stimulieren können, wenn die Zellen von ihren nativen Lebensräumen entfernt werden, und Veränderungen können induziert werden, wenn Zellen von der Verbindung getrennt werden Ihre physiologische Umgebung 7 . Daher ist die Erlangung eines direkten In-vivo- Nachweises des Zellschicksals der Schlüsselansatz, um das gegenwärtige Verständnis des Verhaltens der endothelialen Populationen voranzutreiben. Die genetische Schicksalskartierung ( dh in vivo- Linienverfolgung) ist für die Identifizierung von VESCs und für die Untersuchung ihrer Eigenschaften im Körpersystem zwingend erforderlich, da sie in ihrem physiologischen Kontext in vivo Stammzellenverhalten offenbaren kann und die eigentliche Stämme sein können Beurteilt Lineage traciNg liefert einen direkten Beweis für die langfristige Persistenz ( dh die Selbsterneuerung) der Kandidaten-VESCs und ihre Fähigkeit, Zelltypen für das Ursprungsgewebe ( dh Differenzierungspotenz) zu erzeugen. Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Mamma-Fett-Pad-Transplantationstechnik und eine Lineage-Tracing-Methode, um die Gefäßerzeugungsfähigkeit von VESCs zu beobachten. Diese Techniken überwinden Mängel der derzeit verfügbaren Assays und bieten einen neuen Weg, um die Stammzelleneigenschaften von VESCs optimal zu bewerten. Diese Ansätze sind effiziente Werkzeuge, die verwendet werden können, um das Verhalten und die Gefäßformung von endothelialen Populationen zu beurteilen sowie die vaskuläre Zellpotenzveränderung innerhalb einer pathologischen Umgebung zu bestimmen.

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsin-Ethylen-Diamin-Tetraessigsäure (EDTA) (1x)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>25300-062</td><td>0,05 % Trypsin</td></tr><tr><td>0,22 & Mikro; m Filteranlage</td><td>Merck Millipore AG</td><td>SLGP033RB</td><td>0,22 &Mikro; m Filter</td></tr><tr><td>2-Methylbutanol-2, ReagentPlus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24, 048-6</td><td>Tert Amylalkohol</td></tr><tr><td>222, Tribromethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25g</td><td>222, Tribromethanol</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>70 &micro; m Cell Sieb</td><td>BD FAL</td><td>352350</td><td>70 &micro; m Cell Strainer</td></tr><tr><td>Adhäsionsmikroskop Objektträger</td><td>CITOGLAS</td><td>188105</td><td>Glasobjektträger</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD105 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1051-82, Klon MJ7/18</td><td>für FACS analusis Verwendung bei 1 & Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD201 Biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-2012-82</td><td>für die Verwendung mit FACS analusis bei 2,5 &; Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD31 PE-Cyanin 7</td><td>eBioscience</td><td>25-0311-82, Klon 390</td><td>für die Verwendung von FACS analusis bei 1 & Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>BD FACSJazz Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>655489</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Sigma</td><td>100190332</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Zentrifuge</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ 3</td><td>Worthington-Biochem</td><td>#LS004183</td><td>Kollagenase III</td></tr><tr><td>Konfokale Mikroskopie</td><td>Leica</td><td>sp8</td><td>Konfokal</td></tr><tr><td>Desoxyribonuklease I aus der bovinen Bauchspeicheldrüse</td><td>Sigma</td><td>D2463-5VL</td><td>Dnase I</td></tr><tr><td>Donkey Anti-Rat Cy3</td><td>Jackson ImmunResearch</td><td>712-165-150</td><td>Sekundärer Antikörper, Verwendung bei 0,5 &; Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Dumont Pinzette</td><td>WPI</td><td>500342</td><td>Froceps</td></tr><tr><td>Dumont Pinzette - Micro-Blunted Tips</td><td>FST</td><td>11253-20</td><td>Pinzette</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Hyklon</td><td>SH30396.03</td><td>FBS</td></tr><tr><td>FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119</td><td>BioLegend</td><td>78022</td><td>Blutabstammungscocktail für die FACS-Analyse, Verwendung bei 25 &; Mikro; L pro Test</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G6279</td><td>Glycerin</td></tr><tr><td>Iscov's Modified Dulbecco's Medium</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>12440-053</td><td>IMDM</td></tr><tr><td>Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora&nbsp; 647</td><td>Invitrogen</td><td>Z32450</td><td>Isolectin-647</td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp; Matrix (Wachstumsfaktor reduziert)</td><td>BD</td><td>356231</td><td>Matrigel</td></tr><tr><td>Mausstamm (Actin-GFP)</td><td>Jax Laboratories</td><td>3773</td><td>Actin-GFP</td></tr><tr><td>Mausstamm (C57BL/6)</td><td>SLAC</td><td>C57BL/6</td><td>C57BL/6</td></tr><tr><td>Mausstamm&nbsp; (BALB/c nackt)</td><td>SLAC</td><td>BALB/c nackt</td><td>Nacktmäuse</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Penicilin Streptomycin</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>5140-122</td><td>Pen/Strep</td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (pH7,2) 1x</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>c20012500BT</td><td>PBS</td></tr><tr><td>PRIM1640</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>c11875500CP</td><td>PRIM1640</td></tr><tr><td>ProLong Gold Anti-Fade-Reagenz</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td>Eindeckmedium</td></tr><tr><td>Ratte anti CD144</td><td>BD Biosciences 550548</td><td></td><td>für die Ganzmontageanalyse, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy für endotheliale Tight Junction, Verwendung bei 2,5 &; Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Ratte Anti-CD31-Biotin</td><td>BD Biosciences</td><td>553371</td><td>für die Ganz-Mount-Analuse, Anti-CD31/PECAM1-Antikörper für das Adhäsionsmolekül der endothelialen Oberfläche, Verwendung bei 10 &; Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Lysierungspuffer für rote Blutkörperchen</td><td>Sigma</td><td>R7767-100ML</td><td>Lysierungspuffer für rote Blutkörperchen</td></tr><tr><td>Gerade/Scharf-Blunt/10 cm</td><td>FST</td><td>14028-10</td><td>Feine Schere</td></tr><tr><td>Streptavidin eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td>für die FACS-Analyse bei 0,5 & Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>101551374</td><td>TAM</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-250ML</td><td>TritonX</td></tr><tr><td>Wax Coated Braided Silk (Größe 5-0 USP (1 Metric), 18 Zoll (45 cm) SCHWARZ auf C-1 Nadel)</td><td>COVIDIEN</td><td>S1173</td><td>Naht&nbsp;</td></tr><tr><td>Sterile Einweg-Kapsel</td><td>Swann Morton</td><td>#10</td><td>Skalpell</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Yifeng Medical</td><td>20160101</td><td>Antiseptische Lösung</td></tr></tbody></table>

eine neuartige mamma-fat-pad-transplantationstechnik zur visualisierung der gefäßerzeugung von vaskulären endothelialen stammzellen

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelzellen (ECs) sind die grundlegenden Bausteine ​​der Gefäßarchitektur und vermitteln das vaskuläre Wachstum und die Umgestaltung, um eine ordnungsgemäße Gefäßentwicklung und Homöostase zu gewährleisten. Allerdings bleiben Studien über die endotheliale Linienhierarchie aufgrund des Mangels an Instrumenten, um Zugang zu erhalten, sowie um ihr Verhalten in vivo direkt zu bewerten. Um dieses Manko anzusprechen, wurde ein neues Gewebemodell entwickelt, um die Angiogenese mit dem Brustfettkissen zu untersuchen. Die Milchdrüse entwickelt sich vor allem in den postnatalen Stadien, einschließlich der Pubertät und der Schwangerschaft, bei denen eine robuste Epithelproliferation von einer umfangreichen vaskulären Remodellierung begleitet wird. Mamma-Fett-Pads bieten Raum, Matrix und reiche angiogene Reize aus dem wachsenden Mamma-Epithel. Darüber hinaus befinden sich Mamma-Fett-Pads außerhalb der Peritonealhöhle, so dass sie eine leicht zugängliche Pfropfstelle für die Beurteilung des angiogenen Potentials exogener Zellen sind. Diese Arbeit beschreibt auch eine EffizienzNt-Tracing-Ansatz mit fluoreszierenden Reporter-Mäusen, um die Zielpopulation von vaskulären endothelialen Stammzellen (VESCs) in vivo spezifisch zu markieren. Diese Linienverfolgungsmethode, gepaart mit der nachfolgenden Gewebe-Vollmontage-Mikroskopie, ermöglicht die direkte Visualisierung von zielgerichteten Zellen und deren Nachkommen, durch die die Proliferationsfähigkeit quantifiziert werden kann und die Differenzierungsverpflichtung schicksaliert werden kann. Unter Verwendung dieser Verfahren wurde eine Population von Bipotenten-Protein-C-Rezeptor (Procr), die VESCs exprimieren, kürzlich in multiplen Gefßsystemen identifiziert worden. Procr + VESCs, die sowohl neue ECs als auch Perizyten verursachen, tragen aktiv zur Angiogenese bei der Entwicklung, Homöostase und Verletzungsreparatur bei. Insgesamt beschreibt dieses Manuskript eine neue Mamma-Fett-Pad-Transplantation und In-vivo- Lineage-Tracing-Techniken, die verwendet werden können, um die Stammzellen-Eigenschaften von VESCs zu bewerten.

Mamma VESCs Isolierung: Um die endotheliale Population für den konsequenten Transplantationstest zu isolieren, wurden reife (8 Wochen alte) Jungfrauen-Mamma-Drüsen als Spendermaterial geerntet. Endothelzellen wurden unter Verwendung einer Antikörper-basierten Zellsortierungstechnik isoliert. Repräsentative Pläne der FACS-Analyse der VESC-Population in 8 Wochen alten C57BL / 6-Milchdrüsen-ECs sind in Abbildung...

Diese Arbeit zeigt einen neuartigen Ansatz zur Bewertung der Proliferations-, Differenzierungs- und Gefäßbildungspotenziale vaskulärer endothelialer Stammzellen (VESCs) durch Mamma-Fett-Pad-Transplantation, gefolgt von einer ganzheitlichen Gewebepräparation für die mikroskopische Beobachtung. Eine Abstammungsstrategie zur Untersuchung des Verhaltens von VESCs in vivo wird ebenfalls vorgestellt.

Eine neuartige Mamma-Fat-Pad-Transplantationstechnik zur Visualisierung der Gefäßerzeugung von vaskulären endothelialen Stammzellen

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, das Proliferations-, Differenzierungs- und Gefäßbildungsvermögen von vaskulären endothelialen Stammzellen mittels einer Transplantationstechnik in das Brustfettgewebe gefolgt von einer Ganzpräparat-Herstellung zur mikroskopischen Beobachtung zu bewerten. Diese Methode bietet einen neuen Ansatz, um die Stammzelleigenschaften vaskulärer endothelialer Stammzellen in vivo optimal zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Brustdrüse während der Pubertät eine ideale angiogene Umgebung für die Bildung und Einlagerung neu gebildeter Gefäße bereitstellt.Dies ermöglicht die funktionelle Beurteilung transplantierten endothelialen Zellen. Die Bedeutung dieser Technik beschränkt sich nicht auf die Untersuchung der endothelialen Funktion. Sie kann sich auch auf die Bewertung des Einflusses angiogener Faktoren auf die lokalisierte Umbildung von Gefäßen erstrecken.Diese Ans&auml;tze sind effiziente Werkzeuge, die auf verschiedene Disziplinen angewendet werden k&ouml;nnen, einschlie&szlig;lich Untersuchungen der Endothelzellpopulation im Tumorumfeld und von Ver&auml;nderungen in der Zellpotenz. Die Durchf&uuml;hrung des Verfahrens wird von Wenqian Song, einer Doktorandin aus unserem Labor, demonstriert. Nachdem das auf Gewebeverdauung basierende Medium vorbereitet und acht Wochen alte reife, virginische Actin-GFP-Reporter-M&auml;use gem&auml;&szlig; dem schriftlichen Protokoll geopfert wurden, entfernen Sie mit einem Skalpell das vierte Paar der inguinalen Brustdr&uuml;sen, indem Sie zun&auml;chst einen vertikalen Hautschnitt entlang der unteren Bauchmitte anlegen.Wiegen Sie das zerkleinerte Gewebe und geben Sie es in ein 50-Milliliter-Gefäß. Um den Verdauungspuffer herzustellen, geben Sie 300 Einheiten Kollagenase Typ drei pro 10 Milliliter Verdauungsgrundmedium hinzu. Gleichmäßig mischen und zum zerkleinerten Gewebe geben.Platzieren Sie das 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen horizontal auf einer Schüttelplattform und stellen Sie die Geschwindigkeit auf 100 U/min sowie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein. Schütteln Sie das Brustdrüsengewebe zwei Stunden lang. Nach der Verdauung füllen Sie das 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit vorher erwärmtem sterilen PBS auf und kippen Sie das Röhrchen um, um es gleichmäßig zu mischen.Anschließend die Probe bei 200 × g für fünf Minuten zentrifugieren. Den Überstand entfernen und den Boden des Röhrchens vorsichtig anstoßen, um den Zellpellet aufzulösen. Danach drei Milliliter Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen hinzufügen und das Röhrchen fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die roten Blutkörperchen zu eliminieren.Geben Sie 10 Milliliter sterile PBS hinzu und drehen Sie das Röhrchen um, um es gleichmäßig zu mischen. Zentrifugieren Sie anschließend das Gewebe, entfernen Sie den Überstand und geben Sie 3 Milliliter vorgewärmtes 0,05 %iges Trypsin hinzu. Inkubieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um das verbleibende Gewebe weiter abzubauen. Danach geben Sie 3 Milliliter vorgewärmtes IMDM hinzu und fügen 100 Mikroliter DNase-I-Lösung zu. Die Röhre bei 37 Grad Celsius inkubieren, um die DNA-Filamente aufzubrechen. Anschließend die Gewebemischung durch einen 70-Mikron-Zellsieb leiten, um die Zellsuspension zu erhalten. Verwenden Sie zwei Milliliter PBS mit 5 % FBS, um den Sieb zweimal zu spülen und die enzymatische Verdauung zu neutralisieren.Zentrifugieren Sie die Zellmischung bei 200 × g für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter PBS mit 5 % FBS für die Antikörpermarkierung. Nach der Antikörpermarkierung füllen Sie die Zellen mit PBS mit 5 % FBS auf und zentrifugieren die Probe anschließend bei 200 × g für fünf Minuten.Danach, nach dem Verwerfen des Überstandes, einen Milliliter PBS mit 5 % FBS verwenden, um die Zellen erneut aufzuschwemmen. Die Suspension durch einen 40-Mikrometer-Zellsieb filtern. Anschließend die FACS-basierte Sortierung durchführen, um protein-C-Rezeptor-positive vaskuläre endotheliale Stammzellen gemäß dem Textprotokoll zu isolieren.Fülle die mittels FACS sortierten Zellen mit 10 Milliliter PBS plus 5 % FBS auf und zentrifugiere die Proben anschließend bei 200 × g für fünf Minuten, um die Zellen am Boden des Röhrchens abzusetzen. Nach dem vorsichtigen Absaugen der Flüssigkeit zähle die Zellen mit einem Hämozytometer und resuspendiere das Zellpellet in einer Mischung aus Basalmembran-Matrix auf eine Konzentration von 15.000 Zellen pro 15 Mikroliter. Verdünne die sortierten und gezählten Zellen seriell in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, um die erforderlichen Eingabekonzentrationen zu erreichen, und achte darauf, dass die endgültigen Injektionsvolumina 15 Mikroliter nicht überschreiten.Fügen Sie dann 0,1 % Trypanblau jedem Röhrchen hinzu, um die Sichtbarmachung des Inhalts während der Transplantation zu verbessern. Gründlich pipettieren, um zu mischen, und bewahren Sie die Röhrchen bis zur Verwendung auf Eis auf. Um primäre endotheliale Zellen oder EZs in das Brustfettgewebe zu transplantieren, legen Sie jede Maus in Rückenlage mit dem Rücken auf dem Operationstisch.Verwenden Sie dann Klebeband, um die Gliedmaßen zu fixieren. Tauchen Sie einen Wattestäbchen in eine Jod-haltige antiseptische Lösung. Wischen Sie damit die gesamte Bauchgegend der Maus gründlich ab, um die Hautoberfläche vor der Operation zu sterilisieren.Verwenden Sie anschließend eine Pinzette, um die Bauchhaut der Maus zu halten und anzuheben. Führen Sie dann mit einem chirurgischen Skalpell einen kleinen, einen Zentimeter langen vertikalen Schnitt durch. Führen Sie zwei weitere Schnitte von etwa 0,5 bis einem Zentimeter Länge in Richtung der Hinterbeine durch, um einen umgekehrt Y-förmigen Schnitt zu erzielen.Verwenden Sie Pinzette und Wattestäbchen, um die Haut vorsichtig vom Bauch zu lösen, und heften Sie die Haut seitlich fest, um die inguinalen Brustdrüsen freizulegen. Danach stellen Sie die Maus unter ein Stereomikroskop und stellen die Vergrößerung auf 2X ein. Legen Sie eine 27-Gauge-½-Zoll-Nadel zur Vorabkühlung auf Eis.Nachdem die Spritze vorbereitet wurde, pipettieren Sie 15 Mikroliter der Basalmembran-Matrixlösung auf die Kappe des Mikrozentrifugenröhrchens und saugen anschließend das gesamte Volumen in die vorbereitete Spritze auf. Um eine vollständige Injektion des Zellinhalts sicherzustellen, achten Sie darauf, dass sich nach dem Vorbereiten der Spritze und dem Aufnehmen der Zellen keine Luft in der Nadel befindet. Halten Sie mit feinen Pinzetten das Brustfettgewebe vor dem inguinalen Lymphknoten fest und heben Sie es leicht an, um eine einfache Injektion zu ermöglichen.Danach vorsichtig etwa ein Viertel der Spritzennadel in das Fettgewebe einführen. Die Pinzette vom Fettgewebe lösen, um die Spritzennadel zu greifen und zu stabilisieren. Die Lösung langsam injizieren, um ein Auslaufen der Flüssigkeit zu verhindern.Halten Sie die Nadel anschließend einige Sekunden lang an Ort und Stelle, um sicherzustellen, dass die Zellmischung verfestigt ist und so ein Austreten beim Herausziehen der Nadel minimiert wird. Verschließen Sie die Hautlappen mit resorbierbarem 5-0-Darmnahtmaterial und nähen Sie die Wunden mit chirurgischen Knoten, wobei jeder Knoten etwa 0,3 Zentimeter voneinander entfernt ist. Um das Gewebe zu gewinnen, markieren Sie den systemischen Kreislauf des Empfängers durch eine Injektion von Isolectin-647-Farbstoff in PBS in die Schwanzvene.Ein Ruheintervall von fünf bis 10 Minuten einhalten. Nach der Tötung der Mäuse gemäß dem Textprotokoll mit einer chirurgischen Schere den Bereich des Brustgewebes auspräparieren, in den die Zellen ursprünglich injiziert wurden. In einer sechs Zentimeter großen Petrischale das Gewebe mit einem chirurgischen Skalpell in Würfel von etwa drei bis vier Kubikmillimetern zerkleinern.Um anschließend die Gewebestücke zu verdauen, überführen Sie diese in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das mit 10 Milliliter vorgewärmtem Digestionsmedium ergänzt um Kollagenase drei gefüllt ist. Stellen Sie das 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen horizontal auf eine schwingende Plattform bei 100 U/min und 37 Grad Celsius für etwa eine Stunde, um die Gewebestruktur aufzulösen und überschüssiges Adipozytengewebe zu entfernen. Danach waschen Sie das Gewebe mit PBS bei Raumtemperatur zehn Minuten lang.Danach, um die Fluoreszenz zu erhalten, fixieren Sie das Ganzpräparat, indem Sie die Gewebestücke vorsichtig in eine sechs Zentimeter große Petrischale geben, die zur Hälfte mit 4 % PFA gefüllt ist. Stellen Sie die Petrischale auf eine schwingende Plattform und agitieren Sie das Gewebe sanft für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen des Gewebes und der Inkubation in dem verdünnten primären Antikörper gemäß dem schriftlichen Protokoll, entfernen Sie die Färbung und waschen Sie das Gewebe dreimal für jeweils 10 Minuten mit Waschpuffer.Anschließend inkubieren Sie das Gewebe vier Stunden bei Raumtemperatur auf einer schwingenden Plattform oder über Nacht bei vier Grad Celsius mit Sekundärantikörper und DAPI. Nach dem Waschen der Probe gemäß dem Textprotokoll überführen Sie das Gewebe über Nacht in 80 % Glycerin oder 80 % Saccharose, um es zu dehydrieren und besser zu konservieren. Montieren Sie das Gewebe und führen Sie die konfokale Mikroskopie gemäß dem Textprotokoll durch.Ein repräsentatives Ergebnis der Zellisolierung mittels FACS wird hier gezeigt. Blutlinien wurden ausgeschlossen, und CD31-positive, CD105-positive Zellen wurden zur Definition von endothelialen Zellen verwendet, gefolgt von der Anreicherung protein-C-Rezeptor-positiver endothelialer Stammzellen. Diese konfokale Aufnahme zeigt ein empfängnisfähiges Brustfettgewebe an der Transplantationsstelle.Blutgefäße, die sich aus transplantierten protein-C-Rezeptor-positiven endothelialen Zellen gebildet haben, haben sich integriert und zur Wirtsbrustdrüsen-Gefäßversorgung beigetragen. Die Gefäßversorgung des Empfängers wird in dieser Abbildung dargestellt. Die intravenöse Injektion von Isolektin bei Empfängermäusen zeigte, dass protein-C-Rezeptor-positive endotheliale Zellen durchgängige, funktionelle Blutgefäße gebildet hatten.Wenn die Transplantationsprozedur einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in unter fünf Minuten durchgeführt werden. Während des Durchführens der Prozedur ist es wichtig, dass Sie daran denken, die Empfängertiere nach der Operation sorgfältig zu überwachen. Sollten Anzeichen von Belastung und Infektion beobachtet werden, sind angemessene Versorgungsmaßnahmen zu ergreifen.Nach dem Verfahren können weitere Methoden wie das Zelllinien-Tracing durchgeführt werden, um das Verhalten gezielter Zellen während verschiedener biologischer Prozesse in vivo zu untersuchen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Gefäßbiologie den Weg, um die Potenz von Endothel-Subpopulationen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu erforschen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Transplantation in das Brustfettgewebe und die Ganzpräparat-Gewebetechnik verwendet, um die gefäßbildende Fähigkeit von Endothel-Populationen zu untersuchen und auch die Funktionalität der gebildeten Gefäße zu bewerten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieser Artikel veranschaulicht das Verfahren, nach DeOme KB...

Brustepithelzellen Transplantation

Ein Verfahren zur Aussaat Titan mit Blut in Kontakt Biomaterialien mit autologen Zellen und Prüfung Biokompatibilität beschrieben. Diese Methode verwendet endothelialen Vorläuferzellen und Titan Rohre, innerhalb von Minuten von chirurgischen Implantation in porcine Hohlvenen ausgesät. Diese Technik ist geeignet für viele andere implantierbare biomedizinische Geräte.

Autologe endotheliale Vorläuferzellen Cell-Sätechnik und Biokompatibilitätstestung Für Herz-Kreislauf-Geräte in Großtiermodell

Vaskularisierung ist der Schlüssel zur erfolgreichen Ansätze in der Gewebezüchtung. Daher werden sichere Technologien erforderlich, um die Entwicklung von Gefäßnetze im Gewebekonstrukte bewerten. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und kostengünstige Methode zur Visualisierung und Quantifizierung Vaskularisierung in vivo.

Ein Vollhautdefekt Modell zur Vaskularisierung von Biomaterialien Bewerten<em&gt; In Vivo</em

Wir beschreiben einen Matrigel-Plug-Assay, um das angiogene Potenzial eines Pools von Faktoren zu veranschaulichen, die von Krebszellen sezerniert werden, unter Verwendung von zwei komplementären Bildgebungsmodalitäten, Ultraschall und Endomikroskopie. Das Matrigel, ein extrazelluläres Matrix (ECM)-Imigel, wird verwendet, um den Wirt (die Maus) mit angiogenen Faktoren vertraut zu machen, die an das konditionierte Medium (C.M.) sezerniert werden.

Überwachungsfunktionen und Morphologie der Gefäßversorgung von Faktoren durch schnell wachsende Tumor erzeugende Zellen sezerniert rekrutiert

Hier zur Gewebezüchtung Gefäßimplantate, die zum Pfropfen in Mäusen durch Impfen Doppel partiell pluripotenten Stammzellen funktional erzeugen präsentieren wir ein Protokoll (PiPSC) - abgeleiteten glatten Muskelzellen und PiPSC - abgeleitete Endothelzellen auf einer dezellularisierten Gefäßgerüst Bioreaktor.

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Die Isolierung von murinen Fettgewebe stammenden mikrovaskuläre Fragmente als Vaskularisation Einheiten für Tissue Engineering

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Reinigung, Quantifizierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikeln (EVs) / Exosomen aus nicht adhärenten / mesenchymalen Mamma-Epithelzellen und zur Verwendung derselben zur Übertragung der Brustdrüsen-bildenden Fähigkeit zu luminalen Mamma-Epithelzellen. EVs / Exosomen, die aus Stamm-ähnlichen Mamma-Epithelzellen gewonnen werden, können diese Zell-Eigenschaft in Zellen übertragen, die die EVs / Exosomen einnehmen.

Übertragung der Mamma-Drüsen-bildenden Fähigkeit zwischen Mamma-Basal-Epithelzellen und Mamma-Luminalzellen über extrazelluläre Vesikel / Exosomen

Dieser Artikel beschreibt eine Transplantationsmethode, um Spenderratten-Epithelzellen in das interskapulierliche weiße Fettpolster von Empfängertieren zu transplantieren. Diese Methode kann verwendet werden, um wirtliche und/oder Spendereffekte auf die Entwicklung von Brustepithel zu untersuchen und eliminiert die Notwendigkeit einer Vorabklärung, wodurch die Nützlichkeit dieser Technik erweitert wird.

Ratte Mammary Epithel Cell Transplantation in das interskapulierische weiße Fettpad

Dieser Assay verwendet embryonale Stammzellen der Maus, die in Embryoidkörperchen differenziert sind, die in 3D-Kollagengel kultiviert werden, um die biologischen Prozesse zu analysieren, die die Keimangiogenese in vitro steuern. Die Technik kann zum Testen von Medikamenten, zur Modellierung von Krankheiten und zur Untersuchung spezifischer Gene im Zusammenhang mit embryonal tödlichen Deletionen eingesetzt werden.

In vitro Dreidimensionaler Keimtest der Angiogenese unter Verwendung embryonaler Stammzellen der Maus für die Modellierung von Gefäßerkrankungen und Arzneimitteltests

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Implantation eines Tissue-Engineering-Gefäßtransplantats in die Halsschlagader der Maus mittels Manschettentechnik

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Erfahren Sie eine neuartige Transplantationstechnik für Mamma-Fettpolster zur in vivo-Visualisierung der Gefäßbildung durch vaskuläre endotheliale Stammzellen. Diese Methode ermöglicht die funktionelle Bewertung transplantiertes Endothels.

Eine neuartige Mamma-Fat-Pad-Transplantationstechnik zur Visualisierung der Gefäßerzeugung von vaskulären endothelialen Stammzellen (Video) | JoVE Journal

Eine neuartige Mamma-Fat-Pad-Transplantationstechnik zur Visualisierung der Gefäßerzeugung von vaskulären endothelialen Stammzellen

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