Name: Sektion Mammary Gland Ganze Mounts für Läsion Identifizierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Erfahren Sie die Verarbeitung von Mammagewebe-Whole Mounts zur histopathologischen Läsionsidentifikation bei Mäusen. Diese Methode verbessert die mikroskopische Bewertung und erhöht die Zuverlässigkeit in reproduktionsbiologischen Studien.

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Die Autoren möchten Pam Ovwigho, Tenette Jones und Natasha Clayton, NIEHS, für ihre technische Kompetenz und Unterstützung bei diesem Projekt anerkennen.

Alle Tiernutzungen und -verfahren für diese Studie wurden vom NIEHS Laboratorium genehmigt Pflege und Nutzung Ausschuss und durchgeführt in einer Vereinigung für die Bewertung und Akkreditierung von Labor-Tierpflege-akkreditierte Einrichtung. 1. Mamma Vollständige Vorbereitung 2 , 3 , 6 , 7 <ol><li> Entfernen Sie die Leisten-Brustdrüsen von einer Seite einer nicht-schwangeren CD-1-weiblichen Maus, wie in Referenz 3 beschrieben , und legen Sie sie auf eine elektrostatisch aufgeladene Folie. </li><li> Decken Sie die Drüse mit Antihaft-Papier oder Film und legen Sie eine weitere Folie auf die Oberseite. Fügen Sie Druck ( dh Wassergewichte) auf die Folie, um die Drüse flach zu verbreiten, so dass die Drüse an der Folie zur Fixierung haften bleibt. </li><li> Tauchen Sie die Folien in Fixiermittel ein ( z. B. 100% Ethanol, Chloroform und Eisessig im Verhältnis 6: 3: 1)Übernachtung bei Raumtemperatur. </li><li> Die Drüsen aus dem Fixiermittel entfernen und in Ethanol für 15-30 min waschen. Nach der 30-minütigen Waschung wechseln Sie allmählich in Wasser, indem Sie 1/3 des Ethanols ausgießen und Wasser zugeben. Lassen Sie die Wäsche für ca. 5 min jedes Mal sitzen, und wiederholen Sie mit dem Zusatz von Wasser 3 mal. </li><li> Fleck ( zB Karmin-Alaun-Lösung) für 12-24 h. HINWEIS: Dickere Gewebe benötigen längere Färbezeiten. Siehe Referenz 3 zum Färben von Details. </li><li> Gießen Sie den Fleck nach der zugeteilten Zeit aus und spülen Sie die Rutschen in Wasser für 30 s. Dehydrieren der Gewebe durch Waschen der Objektträger in 70% Ethanol für 15 min, gefolgt von einer 15 min Waschung in 95% Ethanol und einer abschließenden Wäsche in 100% Ethanol für 20 min. </li><li> Lösche das Fett aus den Geweben, indem du sie in Xylol für mindestens 24 Stunden oder länger, wenn das Gewebe dick ist, so dass alle opaken oder weißen Flächen entfernt werden. </li><li> Entfernen Sie das Gewebe aus dem Xylol und fügen Sie schnell m hinzuTrägermedium zum Schieber, um Gewebetrennung zu vermeiden; Legen Sie ein Deckglas auf die Oberseite. Lassen Sie die Folie mindestens 48 Stunden lang trocknen. </li><li> Bewerten Sie das gesamte Gewebe für Anomalien, wie in 2 beschrieben . HINWEIS: Wenn Läsionen in ganzen Montierungen erkannt werden und eine Sektion notwendig ist, um ihre Identität zu etablieren, sollten die folgenden Schritte befolgt werden. </li></ol> 2. Abbau der Mamma-Ganzer Mount von einer Glasrutsche <ol><li> Entfernen Sie das Deckglas und das Montagemedium, indem Sie den Mamma-Vollgleitschieber in ein mit Xylol über Nacht gefülltes Glasfärbeglas eintauchen. HINWEIS: Dickere Gewebe und Folien mit übermäßiger Montagelösung können zusätzliche Zeit für die Deckelentfernung benötigen. </li><li> Nach dem anfänglichen Überleben einweichen, die Folien in frisches Xylol geben und 6 h einwirken lassen. Führen Sie ein letztes Einweichen in frischem Xylol über Nacht. HINWEIS: Das Deckglas wird nach dem letzten Einweichen leicht von der Rutsche fallen. </li><li> Mit agGeliebte Hand, halten Sie die Folie und entfernen Sie vorsichtig das Deckglas mit einer Pinzette, um sicherzustellen, dass es in einem Stück entfernt wird. HINWEIS: Für den Fall, dass das Deckglas noch an der Glasrutsche befestigt ist, weiter einweichen, bis es mit geringem Aufwand entfernt werden kann. </li><li> Sobald das Deckglas entfernt ist, halten Sie die Folie senkrecht zu einer Glas Petrischale mit Xylol, nehmen Sie sorgfältig eine scharfe, wegwerfbare Rasierklinge und schieben Sie die Klinge in einer einzigen Bewegung auf die Folie. </li><li> Sobald das Gewebe entfernt ist, tauchen Sie schnell die Mamma-Pad in eine Xylol-gefüllte Glas Petrischale, um sicherzustellen, dass das Gewebe nicht an der Luft trocknet. HINWEIS: Sei vorsichtig mit diesem Schritt. Die gesamte Halterung ist dünn (≤ 1 mm) und zerbrechlich aus der Xylolverarbeitung. Alle Eindrücke oder Tränen können die Morphologie des Gewebes verändern und spätere Auswertungen komplizieren. </li></ol> 3. Gewebeverarbeitung <ol><li> Sobald das Gewebe in der Petrischale ist, muss es sorgfältig übertragen werdenZu einer etikettierten Histologiekassette. Ergreifen Sie den Rand des Fettkissens mit stumpfen Nasen, gezahnten Zangen, um Gewebeschäden zu minimieren. <ol><li> Mit einem Rasiermesser, schneiden Sie größere Gewebe (vor allem für Ratten) in der Hälfte und legen Sie sie in zwei separate etikettierte Kassetten, die die Gewebegröße unterbringen wird. Legen Sie das Gewebe nach rechts (verwenden Sie den Lymphknoten als Referenz). Stellen Sie sicher, dass das Gewebe ohne Lymphknoten in der gleichen, aufrechten Position gehalten wird, wenn es auf die Kassette übertragen wird. </li></ol></li><li> Legen Sie die Kassette bis zu 2 Stunden in einen Behälter aus Xylol, bevor Sie sie in den Gewebeprozessor legen. HINWEIS: Es wird empfohlen, die Proben am selben Tag zu verarbeiten, an dem sie in die Kassette gelegt werden. Verlängertes Einweichen in Xylol wurde nicht geprüft. </li><li> Laden Sie die maximale Anzahl der Kassetten von Hand in den Gewebeprozessor. </li><li> Bevor Sie beginnen, programmieren Sie alle Reagenzien, die für diesen Prozess in die Reagenzliste des Prozessors verwendet werden. Um die Bewegung zu automatisierenVon einer Station zur nächsten, verwenden Sie die Menüoptionen und erstellen Sie ein neues Programm. Wenn alle Schritte abgeschlossen sind, wählen Sie &#39;OK&#39;, um fortzufahren. HINWEIS: Der Prozessor erlaubt die Überprüfung aller Stationsdetails vor dem Start. <ol><li> Automatisieren Sie den Prozessor, um die Kassetten in Xylol für 30 min bei 37 ° C einzuweichen, gefolgt von einem zweiten Einweichen in frischem Xylol unter den gleichen Bedingungen. Automatisieren Sie den Prozessor, um die Kassetten aus der Xylol-Lösung zu entfernen und übertragen Sie die Gewebe auf die nächste Station, die ein 1: 1 Xylol: geschmolzenes Paraffingemisch enthält, das auf 60 ° C für 30 min eingestellt wurde. HINWEIS: Der Prozessor überträgt dann die Kassetten in eine neue Kammer, die 1 h geschmolzenes Paraffin enthält. Nach 1 h werden die Proben automatisch in eine neue Kammer aus frischem geschmolzenem Paraffin überführt und für weitere 2 h verarbeitet. Beide Schritte werden bei 60 ° C durchgeführt. </li><li> Der Prozessor überträgt dann die Kassetten an die Station, die geschmolzene Para enthältFfin für 1 h. Dann werden die Proben automatisch auf die endgültige Station von frischem geschmolzenem Paraffin übertragen und für weitere 2 h verarbeitet. Beide Schritte werden bei 60 ° C durchgeführt. </li></ol></li></ol> 4. Einbetten des verarbeiteten Mammagewebes <ol><li> Legen Sie die Kassetten in den 58 ° C-Paraffin-Haltetank der Einbettstation, bis sie bereit sind, das Gewebe in die Form einzubetten. </li><li> Entfernen Sie die Kassettenabdeckung, um die beste Formgröße für das Gewebe zu bestimmen. Stellen Sie sicher, dass die Form groß genug ist, um das Gewebe aufzunehmen, und lassen Sie genügend Platz, um eine gewebefreie Grenze von Paraffin um den Umfang zu haben. </li><li> Füge 3-4 mm geschmolzenes Paraffin der Form hinzu und orientiere die Mamma-Vollmontage-Oberfläche, die angrenzt an den Boden des Glasschiebers und den Boden der Kassette, nach oben in der Form. </li><li> Übertragen Sie die Form auf eine Kühlplatte und richten Sie das Gewebe nach Bedarf schnell ein, so dass es parallel zur Form ist. BOttom HINWEIS: Sobald das Paraffin aushärtet, wird das Gewebe an Ort und Stelle gebaut. </li><li> Mit warmer Pinzette, legen Sie die beschriftete, untere Hälfte der Kassette auf die Oberseite der Form; Mit der Pinzette fest drücken. </li><li> Füge zusätzliches geschmolzenes Paraffin der Form in einer kontinuierlichen Bewegung hinzu, um die gesamte Kassette zu bedecken. Bewegen Sie die Form von der warmen Platte zu einer kalten Platte, um die Aushärtung des Blocks zu vervollständigen. </li><li> Entfernen Sie den Block aus der Form, wenn das Paraffin vollständig verfestigt, um Risse oder Luftblasen zu vermeiden. HINWEIS: Das Paraffin-eingebettete Gewebe bei Raumtemperatur aufbewahren, bis es fertig ist. </li></ol> 5. Schnitt des Paraffin-eingebetteten Mamma-Gewebes auf dem Mikrotom <ol><li> Vor dem Schneiden die Paraffinblöcke bei -20 ° C für 1 h inkubieren. ANMERKUNG: Es wird ein restliches Befestigungsmedium in dem Block aus dem ursprünglichen, abgedeckten, vollständig montierten Gewebe geben. Das Kühlen des Blocks verbessert die Blockierung und das Rippen. </li><li> Bereiten Sie das Mikrofon vorRotom durch Einschalten des Wasserbades, mit frischem destilliertem Wasser, und Einstellung der Temperatur auf 42-45 ° C. Legen Sie eine frische, flache Klinge auf das Mikrotom und legen Sie sie auf 4 μm. HINWEIS: Die Abschnittsqualität wird mit Abschnitten, die dicker als 4 μm sind, aufgrund des Vorhandenseins des restlichen Befestigungsmediums im Gewebe reduziert. </li><li> Setzen Sie den Block in das Mikrotom ein, wobei das Wachs der Klinge zugewandt ist und mit der vertikalen Ebene ausgerichtet ist. Dann befeuchten Sie einen Abschnitt von Gaze-Pad in kaltem Wasser und legen Sie es auf den Block für einige Minuten. </li><li> Sektionieren Sie den Block, indem Sie das große Rad im Uhrzeigersinn drehen, in Kombination mit dem groben fortgeschrittenen Rad, bis eine volle Fläche oder ein repräsentativer Blockabschnitt erhalten wird. HINWEIS: Das Gewebe ist dünn, weil Xylol Clearing während der Voll-Mount-Prozess. Blockieren Sie den Block ordnungsgemäß mit der Klinge, um die Anzahl der Schnitte bei der Erlangung eines repräsentativen Abschnitts zu minimieren. </li><li> Wähle das BandSchneiden Sie das Band sorgfältig in das warme (45 ° C) Wasserbad (vorbereitet), lassen Sie Gewebefalten abführen und sorgfältig einen Abschnitt auf eine saubere Glasrutsche schweben. </li><li> Legen Sie die Objektträger aufrecht auf ein Trockengestell, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Die Schläuche in einer leicht geöffneten Schiebebox über Nacht bei 37 ° C inkubieren. </li></ol> 6. Automatisierte und manuelle H &amp; E-Färbung von Sektions-Mamma-Geweben <ol><li> Vor der Färbung werden die Objektträger bei Raumtemperatur gelagert. </li><li> Für automatisierte Färbung wählen Sie H &amp; E aus den Fleckoptionen im Hauptmenü. Deparaffinierung, Färbung und Dehydratation sind alle auf dem automatisierten Stainer abgeschlossen. Verwenden Sie das Montagemedium und ein Deckglas, um die Abschnitte zu montieren. </li><li> Wenn man die Schieber manuell färbt, deparaffiniere man die Schnitte durch Eintauchen der Schieber in Xylol für 5 min. Überführung in frisches Xylol und Wiederholung für 5 min. </li><li> Rehydrieren Sie die Dias durch Eintauchen von ThEm zweimal in 100% Ethanol für jeweils 3 min gefolgt von zwei Wiederholungen in frischem 95% igem Ethanol und zwei getrennten Waschungen in 1X Waschpuffer bei jeweils 5 min. </li><li> Spülen Sie die Folien in destilliertem Wasser. </li><li> Füge die Folien dem Hämatoxylin für 1-2 min hinzu. Entfernen Sie die Folien und spülen Sie sie mit laufendem Leitungswasser für 5 min. HINWEIS: Hämatoxylin vor jedem Gebrauch filtrieren. </li><li> Legen Sie die Objektträger in 1% Eisessig für 30 s, um die Farbdifferenzierung zu fördern, und dann im laufenden Leitungswasser für 1 min ausspülen. </li><li> Fügen Sie Folien zu 1X PBS für 30 s bis 1 min hinzu, um die Gewebeabschnitte zu blau, gefolgt von einem 5 min Spülen in Leitungswasser und dann in 95% Alkohol für 15 - 20 s. </li><li> Gegenfärbung mit Eosinlösung für 30 s bis 1 min. Danach dehydrieren die Dias zweimal in frischem 95% igem Ethanol, gefolgt von zwei frischen Wiederholungen in 100% Ethanol. Führen Sie jede Wäsche für 5 min. </li><li> Die Rutschen in Xylol, mit zwei Änderungen in Xylol für jeweils 5 min. </li><li> DeckelDer Gewebeabschnitt mit Montagemedium und trockene Wohnung über Nacht bei Raumtemperatur. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine gegensätzlichen Interessen, um in Bezug auf die Forschung, die Autorenschaft und / oder die Veröffentlichung dieses Artikels zu erklären.

Die Brustdrüsen-Vollmontage ist ein mächtiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die normale Mamma-Entwicklung und morphologische Veränderungen zu veranschaulichen, die auftreten können und bestehen nach der Exposition gegenüber Chemikalien, einschließlich endokriner Disruptoren. Wenn ein ganzer Berg und ein H &amp; E-Abschnitt aus demselben Tier zusammen beurteilt werden, können sie einen genauen visuellen Schnappschuss von frühen Veränderungen liefern, die in einen krankeren Zustand übergehen können. <p class...

Das Mamma-Ganzes ist eine nützliche und preiswerte Methode, die in vielen Ratten- und Maus-Studien durchgeführt wird, um sowohl normale als auch chemisch induzierte, abnormale Entwicklung zu verstehen. Im Allgemeinen wird eine in verschiedenen Stadien während der Nagetierentwicklung gesammelte Brustdrüse ( dh Adoleszenz, Pubertät, Mittel- bis Spätschwangerschaft und Involutionsphase) morphologische Veränderungen in der Gewebe- und Zellarchitektur zeigen, die durch parokrine, endokrine und autokrine Faktoren beeinflusst werden 1 In der alternden Ratte werden die epithelialen und stromalen Teile der Drüse immer dichter, was die Messung morphologischer Parameter in einem ganzen Berg schwierig macht. So ist es üblich, eine Drüse zur histologischen Auswertung zu sammeln, um Veränderungen auf mikroskopischer Ebene zu identifizieren. Beide Verfahren sind besonders nützlich bei Studien mit chemischer Exposition ( dh Umwelt oder Pharma) oder zur Untersuchung der morphologischen Veränderungen, begleitet von genetischen VeränderungenAtions Techniken und Fähigkeiten zur Verwendung der Brustdrüse bei der Risikobewertung entwickeln sich weiter. Während die Vollmontagevorbereitung routinemäßig und standardisiert ist, gehen die Modifikationen zum Schnitt weiter 2 , 3 . Viele Forschungsgruppen aus verschiedenen Bereichen ( das heißt, die Wissenschaft, die Regierung und die Industrie) haben koronale / Längsschnitte von Brustgeweben als ein bevorzugtes Verfahren angepasst, während einige Labors noch Querschnittschnitt durch die 4 Haut. Die letztere Methode führt zu einer unangemessenen Darstellung der Epidermis (Haut), anstatt des Gewebes von Interesse: das Brustdrüsenepithel 2 . Koronale oder Längsschnitte sind für die Charakterisierung des normalen Gewebes 5 nützlicher und verbessern den Nachweis von Anomalien und Läsionen aufgrund der erhöhten Oberfläche und der Anzahl der vorhandenen Strukturen erheblich. Insgesamt macht das das ganze moEine geeignete Methode für die vergleichende histopathologische Beurteilung der Brustdrüse 1 , 2 . Ob mit einer Maus oder eine Ratte, Abrufen und Erhaltung des 4. und 5. Inguinaldrüsen hoch für den Vergleich der gesamten empfohlen montieren zu einem kontralateralen H &amp; E Abschnitt. Bei der Verwendung in Kombination, die H &amp; E Abschnitt und ganze Mount bieten eine genaue Darstellung der zellulären und morphologischen Veränderungen durch Umweltbelastung induziert. Dies trifft besonders bei bestimmten Nagetierstämmen zu, bei denen das Modell eine geringe Anfälligkeit für die Tumorbildung besitzt oder ein Tumor nicht grob sichtbar ist. Unter bestimmten Umständen kann das Erhalten des erforderlichen Gewebes nicht immer mit beiden Techniken ( dh unzureichende Gewebemenge, Ressourcen oder unerwartete experimentelle Ergebnisse) möglich sein. In unserem Fall wurden Anomalien in der Mamma ganze Berg beobachtet, während HistopathoLogische Befunde in der kontralateralen H &amp; E-Drüse waren meist normal. Die überwältigende Diskrepanz zwischen den kontralateralen Drüsen führte uns dazu, ein wirtschaftliches und effizientes Verfahren zu entwickeln, um die Anomalien in den ganzen Bergen zu identifizieren. Unter Verwendung eines modifizierten Verarbeitungs- und Einbettungsverfahrens wurden qualitativ hochwertige H &amp; E-gefärbte Abschnitte aus Paraffin-eingebetteten ganzen Montierungen hergestellt. Wir stellen uns vor, dass dieses Protokoll zu einem leistungsfähigen Erkennungsinstrument für chemische Expositionseffekte wird, die Inter-Lab-Vergleiche verbessern.

<table><tbody><tr><td>Xylol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td>Eindeckmedien zum Eindecken ganzer Passepartouts und E-Sektionen</td></tr><tr><td>Leica automatisierter Prozessor</td><td>Leica Biosystems</td><td>Modell # ST5020</td><td></td></tr><tr><td>HM 355S Automatisches Mikrotom</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>905200</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Leica Biosystems</td><td>EM-400</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus Objektträger</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4951PLUS-001</td><td>elektrostatisch aufgeladen</td></tr><tr><td>Fisher Finest 24x60x1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td>Deckgläser</td></tr><tr><td>Varistain Gemini ES Automatischer Objektträgerfärber</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A78000014</td><td></td></tr><tr><td>Sta-On</td><td>Leica Biosystems</td><td>3803107</td><td>flüssiger Klebstoff; wird im Wasserbad beim Trennen</td></tr><tr><td>verwendet Modifiziertes Harris Hämatoxylin 72711</td><td>Richard-Allan Scientific (Teil von Thermo Scientific)</td><td>72711</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801600</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumcarbonat</td><td>SkyTech Laboratories</td><td>LCQ500</td><td></td></tr><tr><td>Eisessigsäure</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>wird in Carnoys Fixiermittel</td></tr><tr><td>Chloroform</td> benötigt <td>Macron Fine Chemicals</td><td>4440-04</td><td>wird in Carnoys Fixiermittel</td></tr><tr><td>benötigt 100 % Ethanol</td><td>Die Warner Graham Company</td><td>6505001050000</td><td>in Carnoys Fixiermittel und Waschobjekten benötigt</td></tr><tr><td>95 % Ethanol</td><td>Die Warner Graham Company</td><td>6505011137320190</td><td></td></tr><tr><td>Karmin-Alaun</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022-25G</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium-Kaliumsulfat-Dodecahydrat, Sigma Ultra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7210-500G</td><td></td></tr><tr><td>Automatisierungs-Waschpuffer, 20X</td><td>Biocare Medical</td><td>TWB945</td><td></td></tr></tbody></table>

sektion mammary gland ganze mounts für läsion identifizierung

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Die normale Brustdrüsenentwicklung kann durch die Exposition gegenüber Umweltgiftstoffen und pharmazeutischen Produkten, übermäßige Exposition gegenüber Hormonen und genetischen Veränderungen verändert werden. Mamma-Drüsen-Vollmontage sind eine kostengünstige Methode, um die Progression von morphologischen Veränderungen, die nach der Exposition auftreten können, zu erfassen. Allerdings, im späteren Leben, wenn Anomalien anfälliger zu entwickeln sind, kann alleiniges Vertrauen auf diese eine Methode nicht immer genug Informationen liefern, um eine korrekte Diagnose der Anomalie zu machen. Historisch gesehen wird bei chemischen Prüfrichtungsstudien eine einzelne Brustdrüse bei Nekropsie entfernt und als Hämatoxylin- und Eosin (H &amp; E) -befleckter Abschnitt hergestellt. Die Einbeziehung der kontralateralen Mamma-Ganzkörpersammlung und -analyse verringert die Wahrscheinlichkeit einer falsch-negativen Bewertung. Die Auswertung des ganzen Berges ist durch die Anwesenheit von ein oder zwei ganzen Brustdrüsen auf einer Folie begrenzt, und in einigen Fällen sind die Anomalien, die im ganzen Berg beobachtet werden, neinT gleichmäßig im H &amp; E-Bereich vertreten. Das Ziel dieser Studie war es, ein Protokoll für die Umwandlung von Deckel-Mamma-Vollbefestigungen zu H &amp; E-gefärbten Abschnitten zu entwickeln, so dass Läsionen, die sonst verpasst wurden oder schwer zu diagnostizieren sind, identifiziert werden können. Hier beschreiben wir eine Methode zur Herstellung eines hochwertigen, von Paraffin eingebetteten H &amp; E-Abschnitts aus einer Brustdrüse, die zunächst als Ganzes hergestellt wurde. Im Vergleich zu einem Gewebe, das absichtlich auf H &amp; E-Schnitt vorbereitet wurde, erfordert die gesamte Halterung eine zusätzliche Vorbereitung für die Gewebeentfernung und -verarbeitung. Allerdings wird diese Methode als preiswert angesehen, da es übliche Laborreagenzien und wenig zusätzliche Zeit erfordert. Infolgedessen kann diese Methode wertvolle Informationen darüber liefern, wie chemische und umweltbedingte Expositionen die normale Mamma-Entwicklung verändern, sowie Anzeigeänderungen, die aufgrund genetischer Veränderungen auftreten.

Diese Methode ist wirksam bei der Unterstützung von Diagnosen, die sonst verpasst worden sein könnten, wenn der ursprüngliche kontralaterale H &amp; E-Abschnitt des Mamma-Pad keine histologischen Veränderungen zeigte. Allerdings ist das Ergebnis nur dann sinnvoll, wenn während der anfänglichen Vollmontagevorbereitung sowie bei der Vorbereitung des Gewebes für die histologische Auswertung geboten wird. Paraffin Einbettung wird Schutz bieten und wird dazu beitragen, das Gewebe für zukünfti...

Wir entwickelten eine Methode zur erfolgreichen Entfernung, Verarbeitung, Sektion und Flecken, zur histopathologischen Auswertung, Mammagewebe, das ursprünglich auf Rutschen als ganze Reittiere fixiert worden war. Diese Methode kann die Sammlung und Auswertung von Brustdrüsen-Vollbehältern in Reproduktions- und Entwicklungsprüfungsstudien fördern.

Sektion Mammary Gland Ganze Mounts für Läsion Identifizierung

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, hochwertig gefärbte Schnitte aus ganz montiertem Mausbrustgewebe herzustellen, um Läsionen auf mikroskopischer Ebene identifizieren zu können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Beurteilung der Brustdrüse zu beantworten, beispielsweise die histopathologische Identifizierung von Läsionstypen, die makroskopisch in ganz montierten Brustdrüsen entdeckt wurden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Wahrscheinlichkeit erhöht, Läsionen nachzuweisen, die möglicherweise innerhalb der Brustdrüsen vorhanden sind, wenn ganz montierte Gewebeproben verwendet werden.Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir Ganzpräparat-Phänotypen mit histopathologischen Befunden von formalinfestierten H-und-E-gefärbten kontralateralen Drüsen desselben Tieres verglichen. Dabei fiel eine Diskrepanz in den Diagnosen auf: In den Ganzpräparaten waren mehr Läsionen erkennbar. Die visuelle Darstellung dieser Methode ist wichtig, da die Schritte zur Entnahme und Einbettung des Ganzpräparats entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens sind.Die Drüse ist aufgrund ihrer dünnen, brüchigen Beschaffenheit empfindlich. Nach der Herstellung von Ganzpräparaten der Speicheldrüse und der Analyse des Gewebes auf Anomalien gemäß dem Textprotokoll die Deckgläser und das Einbettungsmedium entfernen, indem die Objektträger in ein Glasfärbungsgefäß mit Xylol getaucht werden. Über Nacht oder länger inkubieren.Überführen Sie die Objektträger in frisches Xylol und lassen Sie die Proben sechs Stunden lang darin einweichen. Danach überführen Sie die Proben erneut in frisches Xylol und lassen sie über Nacht einweichen. Anschließend halten Sie mit einer behandschuhten Hand den Objektträger fest und entfernen vorsichtig mit einer Pinzette die Deckglas in einem Stück.Die Leichtigkeit, mit der die Deckglas entfernt werden kann, kann je nach Dicke des Montagemediums und der Zeit seit der Abdeckung des Präparats variieren. Daher ist es unerlässlich, dass der Objektträger so lange in Xylol verbleibt, bis das Deckglas leicht ablösbar ist. Sobald das Deckglas entfernt ist, verwenden Sie eine scharfe Einweg-Rasierklinge, um die Probe zu entfernen, indem Sie die Klinge in einer einzigen Bewegung über den Objektträger schieben.Bringen Sie den Gewebeprozess dann schnell in eine mit Xylol gefüllte Glaspetrischale ein, um sicherzustellen, dass das Gewebe nicht an der Luft austrocknet. Schneiden Sie größere Gewebestücke mit einem Rasiermesser der Länge nach durch. Um Gewebeschäden zu minimieren, greifen Sie dann mit stumpfen, gezahnten Pinzetten die Kante des Fettgewebes und legen die Hälften mit der Oberseite nach oben in zwei separate, beschriftete Kassetten, die der Größe des Gewebes entsprechen.Stellen Sie die Kassette bis zu zwei Stunden lang in ein Behältnis mit Xylol, bevor Sie sie in den Gewebeprozessor gibt. Danach laden Sie manuell die maximale Anzahl an Kassetten in den Gewebeprozessor. Programmieren Sie den Prozessor vor dem Start für die Gewebeverarbeitung.Um den Vorgang zu automatisieren, wählen Sie die Station sowie Temperatur und Vakuum ein und aus. Automatisieren Sie den Prozessor, sodass die Kassetten 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in Xylol getränkt werden, gefolgt von einer zweiten Behandlung in frischem Xylol unter denselben Bedingungen. Anschließend automatisieren Sie den Prozessor so, dass die Kassetten aus der Xylollösung entfernt und die Gewebe in eine Kammer innerhalb des Prozessors überführt werden, die eine 1:1-Mischung aus Xylol und geschmolzenem Paraffin enthält, die 30 Minuten lang auf 60 Grad Celsius gehalten wird.Wenn alle Schritte abgeschlossen sind, wählen Sie „okay“ oder „start“, um fortzufahren. Stellen Sie die Kassetten in den Haltebehälter eines Paraffinbades mit 58 Grad Celsius, bis sie in die Form gegeben werden können. Entfernen Sie die Kassettenabdeckungen, um die geeignete Formgröße für die Gewebe zu bestimmen.Geben Sie drei bis vier Millimeter geschmolzenes Paraffin aus dem Ausguss in die Form und orientieren Sie das Gewebe im geschmolzenen Paraffin so, dass die Brustganpräparatoberfläche, die zuvor an der Unterseite des Objektträgers und der Unterseite der Kassette lag, in der Form nach oben weist. Überführen Sie die Form auf eine Kühlplatte und justieren Sie das Gewebe schnell nach Bedarf, sodass es parallel zur Bodenfläche der Form liegt. Setzen Sie die beschriftete Kassette mithilfe einer Pinzette fest auf die Form. Geben Sie zusätzlichen geschmolzenen Paraffin in kontinuierlicher Bewegung in die Form, um die gesamte Kassette zu bedecken. Bewegen Sie die Form von der warmen Platte auf eine kalte Platte, um die Fixierung in der exakt gewählten Position für die Schnittführung zu fördern. Wenn der Paraffinblock vollständig erstarrt ist, lösen Sie den Block von der Form. Und lagern Sie es bei Raumtemperatur, bis es zum Schneiden bereit ist. Vor dem Schneiden inkubieren Sie die Paraffinblöcke eine Stunde lang bei minus 20 Grad Celsius. Bereiten Sie dann das Mikrotom vor, indem Sie das Wasserbad mit frischem destilliertem Wasser einschalten und die Temperatur auf 42 bis 45 Grad Celsius einstellen.Als Nächstes ein neues flaches Messer am Mikrotom anbringen und auf vier Mikrometer einstellen. Den Block mit der Wachsoberfläche zum Messer zeigend und in der vertikalen Ebene ausgerichtet in das Mikrotom einsetzen. Anschließend einen Abschnitt eines Gazetuchs mit kaltem Wasser befeuchten und mehrere Minuten lang auf den Block legen.Schneiden Sie den Block, indem Sie das große Rad im Uhrzeigersinn drehen, kombiniert mit dem Grobvorschubrad, bis eine vollständige Schnittfläche oder eine repräsentative Schnittfläche des Blocks erhalten wird. Übertragen Sie dann den Gewebeschnitt von Hand in ein warmes Wasserbad, bevor Sie ihn mit einem sauberen Objektträger aufnehmen. Stellen Sie die Objektträger auf eine Trocknungsstation, um überschüssiges Wasser zu entfernen.Danach die Gewebeschnitte über Nacht bei 37 Grad Celsius lagern. Nach dem Entnehmen der Objektträger aus dem 37 Grad Celsius-Brutschrank bei Raumtemperatur lagern, bis sie zur Färbung bereitstehen. Für die automatisierte Färbung im Hauptmenü H und E aus den Färbeoptionen auswählen, um die Objektträger zu färben.Die Entparaffinierung, Färbung und Dehydratisierung werden alle am automatisierten Färbeapparat durchgeführt. Verwenden Sie Eindeckmedium und ein Deckglas, um die Schnitte einzudecken. Um die ideale Dicke des Brustgewebes zu bestimmen, wurden Vier-Mikrometer- und Sechs-Mikrometer-Schnitte hergestellt.Die vier Mikrometer dicken Schnitte ergaben optimale Ergebnisse, bei denen epitheliale und stromale Bereiche sowie die entsprechenden Zelltypen leicht unterschieden werden konnten. Diese Abbildungen zeigen histologische Schnitte normaler Drüsen. Beide Drüsen weisen kanalartige Strukturen auf, die von einer dichten und homogenen, reich an Adipozyten bestehenden Zellpopulation umgeben sind.Jedes Kanälchen ist von einer einzigen Schicht einfacher kubischer Epithelzellen ausgekleidet und wird durch eine zweite Schicht basaler Zellen aufrechterhalten. Die kontralateralen Ganzpräparate wiesen einen Bereich erhöhter Trübung auf, der die Kanäle der Speicheldrüsen betraf. Es war jedoch unklar, ob die Trübung auf eine hyperplastische, entzündliche oder neoplastische Veränderung zurückzuführen war.Hier sind kontralaterale Ganzpräparate dargestellt. Diese Schnitte wurden aufgrund der erhöhten Anzahl von Lymphozyten um ein großes Blutgefäß im Bereich der Brustdrüsensektion als perivaskuläre Entzündung diagnostiziert. Bei diesen Proben war die lobuläre Architektur der Brustdrüse erhalten, jedoch durch eine erhöhte Zahl und Größe normaler Alveolen sowie Gangsysteme infolge einer lobulären alveolären Hyperplasie vergrößert.Vergrößerte Läppchen enthielten eine erhöhte Anzahl von Alveolen und Gangstrukturen, die von gut differenzierten, oft vakuolisierten Epithelzellen ausgekleidet waren und Lumen bildeten, die proteinhaltige Flüssigkeit enthielten. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist zu beachten, dass das Gewebe durch das Xylol empfindlich ist und leicht brechen kann, wodurch die Probe zerstört wird. Hochwertige Fotos von Ganzpräparaten mithilfe eines Flachbettscanners werden empfohlen, bevor diese Methode angewendet wird.Dies ist eine Gelegenheit für das Fachgebiet der toxikologischen Pathologie, sich hin zur Ganzpräparat-Bewertung für die chemische Screening-Untersuchung zu entwickeln. Wenn also Läsionen auf dieser Ebene identifiziert werden, können nun hochwertige Schnitte zur histopathologischen Diagnose angefertigt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Brustdrüsen-Ganzpräparate zur Identifizierung von Läsionen entnimmt, einbettet und schneidet.Vergessen Sie nicht, dass beim Arbeiten mit Xylol Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Laborkitteln und Handschuhen getroffen werden sollten und die Arbeit unter einer Abzugshaube durchgeführt werden muss.

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Forschung

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