Sektion Mammary Gland Ganze Mounts für Läsion Identifizierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, qualitativ hochwertige gefärbte Schnitte aus ganzem montiertem Brustgewebe der Maus für die Identifizierung von Läsionen auf mikroskopischer Ebene zu erzeugen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Zusammenhang mit der Beurteilung der Brustdrüsen zu beantworten, wie z. B. die histopathologische Identifizierung von Läsionstypen, die grob in ganzen Mammahügeln identifiziert wurden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Wahrscheinlichkeit erhöht, Läsionen zu identifizieren, die in den Brustdrüsen vorhanden sein können, wenn ganze montierte Gewebe verwendet werden.

Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir ganze Mount-Phänotypen mit histopathologischen Berichten für Formalin-Fits, H- und E-Färbungen kontralateraler Drüsen von denselben Tieren verglichen. Wir sahen eine Diskrepanz in den Diagnosen, mehr Läsionen waren bei ganzen Reittieren zu sehen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da die gesamten Schritte zum Entfernen und Einbetten der Halterung entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens sind.

Die Drüse ist wegen ihrer dünnen, brüchigen Natur empfindlich. Nach der Vorbereitung ganzer Mount-Memory-Proben und der Analyse des Gewebes auf Anomalien gemäß dem Textprotokoll entfernen Sie die Deckgläser und das Einbettmedium, indem Sie die Objektträger in ein mit Xylol gefülltes Glasfärbegefäß tauchen. Über Nacht oder länger inkubieren.

Übertragen Sie die Objektträger in frisches Xylol und weichen Sie die Proben sechs Stunden lang ein. Anschließend werden die Proben wieder in frisches Xylol umgefüllt und über Nacht eingeweicht. Halten Sie dann mit einer behandschuhten Hand den Objektträger fest und verwenden Sie eine Pinzette, um das Deckglas vorsichtig in einem Stück zu entfernen.

Es kann Schwankungen in der Leichtigkeit des Entfernens des Deckglases geben, abhängig von der Dicke des Eindeckmediums und der Zeit, seit das gesamte Deckglas abdeckbar war. Daher ist es zwingend erforderlich, dass der Objektträger in Xylol verbleibt, bis sich das Deckglas leicht lösen lässt. Sobald das Deckglas entfernt ist, verwenden Sie eine scharfe Einweg-Rasierklinge, um die Probe zu entfernen, indem Sie die Klinge in einer einzigen Bewegung über den Objektträger schieben.

Tauchen Sie das Speicherpad dann schnell in eine mit Xylol gefüllte Petrischale aus Glas, um sicherzustellen, dass das Gewebe nicht an der Luft trocknet. Verwende ein Rasiermesser, um größere Taschentücher in zwei Hälften zu schneiden. Um Gewebeschäden zu minimieren, greifen Sie dann mit einer stumpfen Pinzette mit gezackter Spitze den Rand des Fettpolsters und legen Sie die Hälften mit der rechten Seite nach oben in zwei separate beschriftete Kassetten, die der Gewebegröße entsprechen.

Legen Sie die Kassette bis zu zwei Stunden lang in einen Behälter mit Xylol, bevor Sie sie in den Tissue-Prozessor geben. Laden Sie dann die maximale Anzahl an Kassetten von Hand in den Tissue-Prozessor. Programmieren Sie vor dem Start den Prozessor für die Gewebeverarbeitung.

Um den Vorgang zu automatisieren, wählen Sie die Station, die Temperatur und das Vakuum aus. Automatisieren Sie den Prozessor so, dass er die Kassetten 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in Xylol einweicht, gefolgt von einem zweiten Einweichen in frischem Xylol unter den gleichen Bedingungen. Automatisieren Sie dann den Prozessor, um die Kassetten aus der Xylollösung zu entfernen, und übertragen Sie das Gewebe in eine Kammer innerhalb des Prozessors, die eine Eins-zu-Eins-Mischung aus Xylol und geschmolzenem Paraffin enthält, die 30 Minuten lang auf 60 Grad Celsius eingestellt ist.

Wenn alle Schritte abgeschlossen sind, wählen Sie OK oder Beginnen Sie mit dem Fortfahren. Legen Sie die Kassetten in den Fäkalientank eines 58 Grad Celsius heißen Paraffinbades, bis Sie bereit sind, sie in die Form zu legen. Entfernen Sie die Kassettenabdeckungen, um die beste Formgröße für die Taschentücher zu ermitteln.

Geben Sie drei bis vier Millimeter geschmolzenes Paraffin aus dem Ausguss in die Form und richten Sie dann das Gewebe in dem geschmolzenen Paraffin so aus, dass die gesamte Oberfläche der Brusthalterung, die an den Boden des Glasobjektträgers und den Boden der Kassette angrenzt, in der Form nach oben zeigt. Übertragen Sie die Form auf eine Kühlplatte und stellen Sie das Tuch schnell nach Bedarf so ein, dass es parallel zum Formboden ist. Setzen Sie die beschriftete Kassette mit einer Pinzette fest auf die Form.

Geben Sie zusätzliches geschmolzenes Paraffin in einer kontinuierlichen Bewegung in die Form, um die gesamte Kassette zu bedecken. Bewegen Sie die Form von der Warmplatte auf eine Kaltplatte, um die Fixierung in genau der Position zu fördern, die für das Schneiden gewählt wurde. Wenn der Paraffinblock vollständig erstarrt ist, trennen Sie den Block von der Form.

Und lagern Sie es bei Raumtemperatur, bis es zum Schneiden bereit ist. Vor dem Schneiden inkubieren Sie die Paraffinblöcke eine Stunde lang bei minus 20 Grad Celsius. Bereiten Sie dann das Mikrotom vor, indem Sie das Wasserbad mit frischem destilliertem Wasser einschalten und die Temperatur auf 42 bis 45 Grad Celsius einstellen.

Setzen Sie dann eine frische flache Klinge auf das Mikrotom und stellen Sie sie auf vier Mikrometer ein. Führen Sie den Block mit dem Wachs zur Klinge und ausgerichtet zur vertikalen Ebene in das Mikrotom ein. Befeuchten Sie dann ein Stück Mullpad mit kaltem Wasser und legen Sie es für einige Minuten auf den Block.

Schneiden Sie den Block, indem Sie das große Rad im Uhrzeigersinn in Kombination mit dem nach Kurs vorgeschobenen Rad drehen, bis eine volle Fläche oder ein repräsentativer Abschnitt des Blocks entsteht. Übertragen Sie dann den Gewebeschnitt mit der Hand in ein warmes Wasserbad, bevor Sie ihn mit einem sauberen Objektträger aufnehmen. Legen Sie die Objektträger auf eine Trockenhalterung, um überschüssiges Wasser zu entfernen.

Anschließend lagern Sie die Gewebeschnitte bei 37 Grad Celsius über Nacht. Nachdem Sie die Objektträger aus dem 37 Grad Celsius heißen Inkubator genommen haben, lagern Sie sie bei Raumtemperatur, bis sie zum Färben bereit sind. Für die automatische Färbung wählen Sie H und E aus den Färbeoptionen im Hauptmenü, um die Objektträger zu färben.

Entparaffinierung, Färbung und Dehydrierung werden auf dem automatisierten Färbegerät durchgeführt. Verwenden Sie ein Montagemedium und ein Deckglas, um die Abschnitte zu montieren. Um die ideale Dicke des Brustgewebes zu bestimmen, wurden vier Mikrometer und sechs Mikrometer Schnitte angefertigt.

Die Vier-Mikrometer-Schnitte lieferten optimale Ergebnisse, bei denen Epithel- und Stromabereiche und entsprechende Zelltypen leicht unterschieden werden konnten. Diese Zahlen stellen histologische Schnitte normaler Drüsen dar. Beide Drüsen weisen duktale Strukturen auf, die von einer robusten und homogenen adipozytenreichen Population umgeben sind.

Jeder Gang ist mit einer einzigen Schicht einfacher quaderförmiger Epithelzellen ausgekleidet und wird von einer zweiten Schicht aus Basalzellen aufrechterhalten. Die kontralateralen ganzen Halterungen enthielten einen Bereich mit erhöhter Opazität, der die Gänge der Gedächtnisdrüsen betraf. Es war jedoch unklar, ob die Trübung von einer hyperplastischen, entzündlichen oder neoplastischen Veränderung herrührte.

Hier sind kontralaterale ganze Montierungen zu sehen. Diese Abschnitte wurden als perivaskuläre Entzündung diagnostiziert, da die Anzahl der Lymphozyten um ein großes Blutgefäß im Bereich der Brustdrüsen erhöht war. In diesen Proben wurde die lobuläre Architektur der Brustdrüse beibehalten, aber durch eine erhöhte Anzahl und Größe der normalen Alveolen und Gänge für eine lobuläre Alveolenhyperplasie vergrößert.

Vergrößerte Läppchen enthielten eine erhöhte Anzahl von Alveolen und Gängen, die von gut differenzierten, oft vakuolisierten Epithelzellen ausgekleidet waren, die Lumen bildeten, die proteinöse Flüssigkeit enthielten. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass das Gewebe durch das Xylol zerbrechlich ist und leicht brechen kann, wodurch Ihre Probe zerstört wird. Es wird empfohlen, qualitativ hochwertige Fotos von ganzen Passepartouts mit einem Flachbettscanner zu erstellen, bevor Sie diese Methode ausprobieren.

Dies ist eine Gelegenheit für das Gebiet der toxikologischen Pathologie, sich in Richtung der Gesamtbewertung für das chemische Screening zu bewegen. Wenn also Läsionen auf dieser Ebene identifiziert werden, können nun qualitativ hochwertige Schnitte für die histopathologische Diagnose erstellt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ganze Brusthalterungen zur Identifizierung von Läsionen entfernt, einbettet und durchtrennt.

Vergessen Sie nicht, dass bei der Arbeit mit Xylol Vorsichtsmaßnahmen wie Laborkittel und Handschuhe getragen werden sollten und die Arbeit unter einer Haube stattfinden sollte.