Entwickeln von HiPSC-abgeleiteten serumfreien Embryoidkörpern zur Vernehmung von 3-D-Stammzellkulturen unter Verwendung physiologisch relevanter Assays

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls für die 3D-humanen iPSC-serumfreien Embryoidkörper ist es, ein In-vitro-System bereitzustellen, das der frühen kortikalen Entwicklung des Menschen nahe kommt und für die Wirkstoffforschung verwendet werden kann. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Stammzellen zu beantworten, z. B. wie Neuronen aus iPSCs hervorgehen und funktionelle Netzwerke in 3D-Gewebe bilden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, Aspekte der kortikalen Entwicklung in einer Schale aus menschlichem Gewebe zu modellieren, das die Genetik kranker Individuen enthält, so dass das System als zellbasierte Plattform für das Wirkstoffscreening dient, die skalierbar ist und zur Untersuchung vieler verschiedener neurobiologischer Erkrankungen verwendet werden kann.

Obwohl diese Methode Aufschluss über neurobiologische oder neurologische Entwicklungsstörungen geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf solche, die sich auf Modelle der Neuroimmunfunktion oder neuronaler Informationen konzentrieren. Beginnen Sie für dieses Protokoll mit der Etablierung fötaler Zellen. Um diese Kultur zu etablieren, werden 600.000 fötale Zellen in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit 300 Millilitern Medium pro Vertiefung platteiert.

Nachdem Sie die fötalen Zellen 48 Stunden lang kultiviert haben, ersetzen Sie das Medium. Inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang, während Sie die Stammzellen vorbereiten. Tauen Sie die Stammzellen in einem 37 Grad heißen Wasserbad auf.

Nach dem Auftauen werden die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt und das Röhrchen auf fünf Milliliter mit Kulturmedium gefüllt, das tropfenweise hinzugefügt wird. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen vier Minuten lang vorsichtig, aspirieren den Überstand und suspendieren das Pellet vorsichtig wieder in einem Milliliter Stammzellmedium mit ROCK-Inhibitor. Nach der Quantifizierung der Zelldichte werden 300.000 Stammzellen auf die Feeder-Zellen aufgesetzt.

Wachsen und erweitern Sie dann die Kulturen, selektieren Sie in regelmäßigen Abständen nach gesunden Zellen, nachdem Sie sie expandiert und die Zellen zur Sicherung eingefroren haben. Züchten Sie die Stammzellkolonien auf Standardplatten, bis sie eine Konfluenz von 50 % bis 70 % erreichen. Verwenden Sie dann eine milde enzymatische Behandlung und eine sanfte Verreibung mit der Ein-Milliliter-Pipettenspitze, um die hiPSCs für die Differenzierung der Neurovorläuferzellen zu ernten.

Zentrifugieren Sie die Suspension vorsichtig, saugen Sie den Überstand an und suspendieren Sie das Pellet erneut in fünf Millilitern humanem iPSC-Medium. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in eine mit 0,1 % Gelatine beschichtete Fünf-Zentimeter-Zellkulturschale und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang. Übertragen Sie nach einer Stunde die nicht anhaftenden Zellen in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Spülen Sie die Platte dann vorsichtig mit drei Millilitern Medium aus und geben Sie sie in dieselbe Tube. Wiederholen Sie anschließend den Resuspensionsschritt mit sanfter Zentrifugation, bestimmen Sie dann die Zelldichte und plättieren Sie die Zellen in eine 96-Well-V-Bodenplatte mit geringer Adhäsion bei 9.000 Zellen pro Well. Drehen Sie nun die Platte drei Minuten lang und beginnen Sie mit der Kultivierung der Zellen.

In den nächsten 14 Tagen wird jeden zweiten Tag ein halbes Medium durch ein frisches, differenzierendes Medium ersetzt. Bereiten Sie nach zweiwöchiger Kultivierung der Zellen Sechs-Well-Platten mit 40-Mikron-Zellkultureinsätzen und einem Milliliter DM1-Medium vor. Inkubieren Sie diese Platten mindestens vier Stunden lang, bevor Sie die kultivierten Zellen hinzufügen.

Sammeln Sie anschließend mit einer 200-Mikroliter-Weithalspipettenspitze zwei Wochen alte Zellaggregate im Wert von etwa 20 Mikrolitern Medium. Übertragen Sie vier bis sechs Zuschlagstoffe mit minimaler Lösung auf jeden Einsatz, entfernen Sie den Überschuss. Während dieses Schritts ist es wichtig, schnell und mit ruhiger Hand zu arbeiten, während Sie das Medium aus der Umgebung von SFEBs entfernen, können Sie sehen, dass sich die SFEBs aufgrund der Oberflächenspannung über die Lösung bewegen.

Es ist in Ordnung, sie nach dem Entfernen des Mediums neu zu positionieren. Sobald alle Aggregate auf die Inserts geladen sind, wechseln Sie das Medium auf einen Milliliter DM2 und kultivieren Sie die Zellen jeden zweiten Tag weiter. Ersetzen Sie drei Viertel des Mediums durch frisches Medium.

Beginnen Sie nach 14-tägiger Kultivierung mit der Zugabe von DM3-Medium zu den Kulturen. Setzen Sie die Kultivierung für weitere 16 Tage fort, um die SFEBs wachsen zu lassen. Lösen Sie nun die SFEBs vorsichtig mit einer 200-Mikroliter-Weithalspipettenspitze vom Einsatz.

Übertragen Sie die SFEBs auf 12-Well-Platten, wobei vier bis acht pro Well geladen werden. Färben Sie sie dann als Umriss im Textprotokoll ein. Um die 12 Mulden und die acht Teller vorzubereiten, waschen Sie sie zuerst dreimal mit sterilem Wasser.

Waschen Sie sie dann einmal mit 75 % Ethanol und noch einmal mit 100 % Ethanol. Backen Sie die Platten dann vier bis fünf Stunden lang bei 50 Grad Celsius auf dem Kopf, um den Sterilisationsprozess abzuschließen. Geben Sie nach dem Backen 500 Mikroliter 0,2%ige PEI-Lösung in jede Vertiefung und lassen Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur stehen.

Aspirieren Sie dann das PEI und waschen Sie die Vertiefungen viermal mit dem sterilen destillierten Wasser und trocknen Sie sie über Nacht an der Luft. Bereiten Sie am nächsten Tag frisches Laminant in L15 Medium vor und geben Sie 10 Mikroliter in die Mitte jeder Vertiefung. Geben Sie dann destilliertes Wasser in die umliegenden Reservoirs, um eine Verdunstung zu verhindern, und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Achten Sie darauf, das Laminant in der Mitte der Elektroden zu strahlen, und achten Sie darauf, den Raum der Erdungselektroden nicht zu überschreiten, da bei Überschreitung dieses Raums Neuronen über die Erdungselektroden wachsen, was zu Rauschartefakten führt und die Wiedergabetreue der Aufnahme beeinträchtigt. Geben Sie nun einen vorbereiteten SFEB in jede Vertiefung, indem Sie ihn leicht mit einer Pipette mit breitem Durchmesser ansaugen. Geben Sie dann 200 Mikroliter DM2 in jede Vertiefung und kultivieren Sie die Platte über Nacht.

Um später die neuronale Aktivität aufzuzeichnen, legen Sie eine Platte in den Plattenlesegerät. Auf 37 Grad Celsius vorheizen. Verwenden Sie dann die Software, um 10 Minuten Aktivität aus jedem Brunnen aufzuzeichnen.

SFEB wird mit der beschriebenen Methode gezüchtet und liefert Gewebe mit morphologischen Eigenschaften, die einer sich früh entwickelnden kortikalen subventrikulären Zone ähneln, die mit ausgedehnten Tuj1-positiven Neuronen sowie Neurovorläufern gefüllt ist. Zahlreiche sich entwickelnde kortikale Rosetten wurden in den äußeren Schichten und in den inneren Schichten des Körpers beobachtet. Der äußere Rand des Körpers ähnelt einer sich entwickelnden kortikalen Platte, die postmitotische Neuronen enthält, was durch die Expression von Brn2, einem Marker für Neurovorläufer, und die am stärksten ventralisierten äußeren kortikalen Schichten unterstützt wird.

Die äußeren Schichten enthalten auch Reelin-positive Zellen, bei denen es sich um zufällige Gratzenzellen oder deren Vorläuferzellen handeln kann. Die Körper exprimierten auch Marker, die mit dem gemischten kodalen und medialen ganglionären Immenanten übereinstimmen. Basierend auf der Expression von gekochten TF2- und Nkx2.1-Markern.

Die kultivierten SFEBs ergeben sowohl bei CalR als auch bei CalB positive Interneuronen. Sowie VGLUT-positive exzitatorische Neuronen und Tbr1-positive glutamaterge neurale Vorläuferzellen. In Übereinstimmung mit anderen Berichten waren 61 % der Körperzellen VGLUT-positiv und 43 % Tbr1-positiv.

MEM-Aufnahmen, die von den Körpern gemacht werden, können über lange Zeiträume gemacht werden und die Aufzeichnungen zeigten die Entwicklung von kortikalen Netzwerkebenen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man SFEBs aus menschlichen iPSCs züchtet und den Neuralgehalt von sich strafend entwickelnden kortikalen Rosetten mit NSFEBs charakterisiert. und neurophysiologische Assays an reifenden SFEBs durchzuführen.

Im Allgemeinen könnten Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da es Zeit und Übung braucht, um das notwendige wissenschaftliche Feld für das Verhalten von iPSCs zu entwickeln und die iPSCs Neuronen in Kultur zu bringen. Die kultivierten Zellen sollten täglich überwacht werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Kalziumbildgebung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche medikamentösen Behandlungen die kortikalen Netzwerkschwingungen beeinflussen könnten.