Mittelmaßnahme Vorbereitung von Drosophila Embryoextrakte für Proteomversuche

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, einen einfachen und kostengünstigen Ansatz für die Entnahme von Drosophilie-Embryonen in mittlerem Maßstab zu bieten. Und die Herstellung von Proteinextrakten, die in nachgelagerten proteomischen Anwendungen wie der Massenspektrometrie zur Affinitätsreinigung verwendet werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Zellsignalisierung und Entwicklungsbiologie zu beantworten.

Zum Beispiel, wie spezifische Protein-Protein-Wechselwirkungen die Zellkommunikation während der Organismusentwicklung durchführen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es eine einfache und kostengünstige Methode ist, eine Drosophila-Embryolyse zu erzeugen. Diese können für Downstream-Anwendungen wie die Reinigung von Proteinaffinitäten verwendet werden.

Traditionell sammelten Forscher Drosophila-Embryonen in sehr großen Käfigen. Aber wir stellen ein benutzerfreundliches Verfahren vor, um Embryonen in mittelgroßen Käfigen zu sammeln, die leicht in jedem Labor aufgestellt werden können. Nachdem Sie Fünf-Liter-Behälter vorbereitet und 25 x 25 Zentimeter große Quadrate aus Nylonnetz gemäß dem Textprotokoll geschnitten haben, legen Sie das Netz über den Behälter und drücken Sie es mit dem Deckel nach unten.

Stellen Sie sicher, dass das Netz dicht ist und der Deckel nicht gekippt ist. Der Käfig ist nun bereit, mit Fliegen bevölkert zu werden. Nach der Vorbereitung von Ein-Liter-Plastikdosen und 18 x 18 Zentimeter großen Nylonnetzquadraten legen Sie das Netz über den oberen Rand des Glases und schrauben Sie den Deckel fest, um ihn festzuziehen.

Stellen Sie sicher, dass das Netz dicht und der Deckel nicht gekippt ist. Amplifizieren Die transgenen Fliegenlinien tragen das typisierte Protein von Interesse. Und füllen Sie die Flaschen alle zwei Tage um, bis sich 25 bis 30 Flaschen pro Fliegenschnur angesammelt haben.

Amplifizieren Sie einen Kontrollbestand auf ähnliche Weise. Als nächstes Apfelsaftplatten auf Zimmertemperatur erwärmen. Dann mit einem behandschuhten Finger etwas feuchte Hefepaste in der Mitte der Teller verteilen.

Einen etwa sechs Zentimeter großen Kreis für eine 15 Zentimeter große Platte machen. Und ein vier Zentimeter großer Kreis für eine 10 Zentimeter große Platte. Nachdem Sie die Fliegen betäubt und mit dem Netz nach unten in die vorbereiteten Käfige gebracht haben, decken Sie die Käfige mit Apfelsaftplatten ab.

Lassen Sie die Fliegen aufwachen. Drehen Sie dann die Käfige um und brüten Sie die Fliegen zwei bis drei Tage lang bei Raumtemperatur aus. Wechseln Sie die Platten zweimal täglich, indem Sie den Käfig auf den Kopf stellen und das Klebeband von der Platte abziehen, während Sie die Platte an den Käfig halten.

Klopfen Sie vorsichtig mit dem gesamten Käfig auf die Bank und tauschen Sie die alte Platte schnell gegen eine neue aus, wobei Sie versuchen, die Fliegen nicht entweichen zu lassen. Lassen Sie die Fliegen die Embryonen über Nacht oder für eine andere gewünschte Zeit auf frische Apfelsaftplatten legen. Am nächsten Morgen werden die Netzbehälter für die Embryonenentnahme markiert und gewogen.

Eine für jede verwendete Fliegenschnur. Bereiten Sie 1x Lysepuffer in einem 50-Milliliter-Röhrchen mit zuvor hergestellten Reagenzien vor, indem Sie 40 Milliliter Wasser zu 10 Millilitern 5x konzentriertem Lysepuffer in einem 50-Milliliter-Röhrchen hinzufügen. 50 Mikroliter eines molaren DVB-T in einer Endkonzentration von einem Millimolar zugeben.

Gut mischen und die Lösung auf zwei 50-Milliliter-Röhrchen verteilen. Geben Sie in eines der Röhrchen eine Proteasehemmer-Tablette. Und stellen Sie das Rohr 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einen Rotator.

Während sich die Tablette auflöst, beginnen Sie mit der Entnahme der Embryonen, indem Sie die Apfelsaftplatten auf den Käfigen mit den verwendeten Genotypen der Fliegenlinien markieren. Und tauschen Sie die Teller gegen frische aus. Füge so viel Wasser hinzu, dass jeder Apfelsaftteller bedeckt ist.

Lösen Sie dann mit einem weichen Pinsel die Embryonen vorsichtig von der Platte. Gießen Sie die Embryonen in den zuvor gewogenen und markierten Netzbehälter und lassen Sie das überschüssige Wasser ab. Tupfen Sie dann das Netz kurz auf Küchenpapier ab, um das überschüssige Wasser zu entfernen.

Um die Embryonen zu dechorionieren, füllen Sie eine sechs Zentimeter große Petrischale zur Hälfte mit 50% Bleichmittel. Bereiten Sie dann zwei größere Petrischalen mit Wasser vor. Tauchen Sie den Netzbehälter mit Embryonen 90 Sekunden lang in 50% Bleichmittel.

Klopfen Sie während der Inkubation ein paar Mal vorsichtig auf das Netz, um die Embryonen in der Bleichlösung zu suspendieren. Am Ende der Inkubation den Netzbehälter in jedem der beiden Schalen etwa 10 Sekunden lang mit Wasser waschen. Verwenden Sie dann 18,2 Megaohm Zentimeter Wasser in einer Spritzflasche, um den Netzbehälter einschließlich der Seiten und der Außenseite gründlich zu spülen.

Nach einer gründlichen Wäsche sollte kein Bleichmittelgeruch festgestellt werden. Tupfen Sie den Netzbehälter auf Küchenpapier ab. Wiegen Sie dann den Netzbehälter mit den Embryonen und ziehen Sie das Gewicht des leeren Behälters ab.

Notieren Sie das resultierende Gewicht der Embryonen. Zur Herstellung des Embryoextrakts geben Sie einen Milliliter Lysepuffer mit Proteaseinhibitoren in einen Dounce Glashomogenisator und halten Sie ihn auf Eis. Übertragen Sie dann die Embryonen aus dem Netzbehälter in den Homogenisator.

Verwenden Sie einen Milliliter Lysepuffer, um die verbleibenden Embryonen auf dem Netz abzuwaschen. Und fügen Sie die Embryonen und den Puffer zum Material im Homogenisator hinzu. Lassen Sie dann die Embryonen auf dem Boden des Homogenisators absetzen und saugen Sie den Überstand vorsichtig an.

Als nächstes fügen Sie dem Homogenisator Lysepuffer mit Proteaseinhibitoren hinzu, wobei Sie fünf bis sechs Milliliter Lysepuffer pro Gramm Embryonen anstreben. Führen Sie dann einen locker sitzenden Stößel ein, um die Embryonen mit vier bis sechs Strichen zu homogenisieren. Bei den ersten Schlägen wird es mehr Widerstand geben.

Versuchen Sie, den Stößel in einer kontinuierlichen Bewegung zu bewegen, um ein Verspritzen der Lösung zu vermeiden. Wechseln Sie dann zu einem dicht schließenden Stößel. Und homogenisieren Sie die Embryonen mit acht bis 10 Schlägen.

Inkubieren Sie das Homogenid 20 Minuten lang auf Eis. Anschließend wird das Homogenid in Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Und zentrifugieren Sie 15 Minuten lang bei 13.000 Grad G und vier Grad Celsius.

Vermeiden Sie die Pellets in der obersten Lipidschicht, und übertragen Sie die Überstände in frische Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Nach der Wiederholung der Zentrierung die Überstände mit einer Ein-Milliliter-Spitze vorsichtig auffangen. Und füllen Sie sie in gekühlte 10-Milliliter-Spritzen um, an denen 045-Mikrometer-Filter angebracht sind.

Schieben Sie die gesamte Lösung in beschriftete Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Frieren Sie die Proben in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Oder sofort für Proteinreinigungsexperimente verwenden.

Unter Verwendung des in diesem Video beschriebenen Protokolls wurden Lysate aus Drosophila-Embryonen hergestellt, die ubiquitär das EGFP-ERK-Protein exprimieren, unter Kontrolle des Arm-Odillo-Promotors. Die Expression des Proteins wurde durch Western Blotting für das Gesamt-ERK-Protein bestätigt, um gleichzeitig die Konzentrationen von endogenem und transgenem EGFP-ERK zu detektieren und bei 42 Kilodalton bzw. 69 Kilodalton zu migrieren. In der gelb-weißen Kontrolllinie wurde eine einzelne Bande nachgewiesen, die der nicht markierten endogenen ERK entspricht, was eine erfolgreiche Extraktion von ERK und EGFP-ERK aus Embryonen bestätigt.

Um zu testen, ob das Extraktionsprotokoll für die anschließende Aufreinigung von markierten Proteinen geeignet ist, wurden Extrakte aus der gelben weißen und der arm-EGFP-ERK-Fliege einer Affinitätsreinigung unter Verwendung von GFP-Agarose-Kügelchen unterzogen. Die Silberfärbung von Proben, die auf einem Gradienten SDS-PAGE durchgeführt werden, zeigt eine erfolgreiche Aufreinigung des Köderproteins EGFP-ERK. Neben EGFP-ERK enthielt die Versuchsroute weitere Banden, die in der Kontrollprobe nicht beobachtet wurden, was darauf hindeutet, dass bei der Aufreinigung potentielle ERK-interagierende Proteine wiedergefunden wurden.

Sobald die Embryonenentnahme und die Extraktionsschritte gemeistert sind, können sie in etwa zwei Stunden durchgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Extraktionsschritte auf Eis durchzuführen. Und Proteaseinhibitoren zu verwenden, um den Proteinabbau zu minimieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Käfige für Drosophila-Populationen auf mittlerer Ebene einrichtet. Und stellen Sie Ganzzellproteinextrakte aus Embryonen her.