Methoden zur Extraktion von Endosymbionten aus der Whitefly Bemisia tabaci

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, Endosymbionten aus winzigen Insekten für weitere Experimente zu extrahieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Entomologie und der Makrobiologie zu beantworten, da die meisten Endosymbionten nicht in vitro kultiviert werden können. Es ist sehr wichtig, dass die Methode zeigt, dass ausreichende Mengen an Bakterien für weitere Experimente isoliert werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir bakterielle Endosymbionten der Weißen Fliege bequem isolieren können. Dies kann auch auf die Isolierung von Endosymbionten aus anderen Insekten wie Blattläusen, Zikaden und Thripsen angewendet werden. Sammeln Sie zunächst eine einzelne adulte Weiße Fliege und homogenisieren Sie sie in 30 Mikrolitern Lysepuffer

Inkubieren Sie das Homogenat eine Stunde lang bei 65 Grad Celsius. Dann 100 Grad Celsius für 10 Minuten. Bereiten Sie unter Verwendung von DNA der Weißen Fliege und mitochondialen Cytochromoxidase-1-Primern PCR-Reaktionen im Wert von 25 Mikrolitern unter Verwendung der folgenden Reagenzien vor.

Führen Sie dann die PCR-Reaktionen mit dem hier gezeigten Programm aus. Verwenden Sie als Nächstes ein DNA-Gel-Extraktionskit gemäß dem empfohlenen Protokoll, um das PCR-Produkt zu reinigen. Führen Sie dann eine Sequenzanalyse gemäß dem Textprotokoll durch.

Um spezifische Gene jedes Endosymbionten in der Weißen Fliege zu amplifizieren, führen Sie eine PCR an der DNA der Weißen Fliege durch. Gemäß einem zuvor veröffentlichten Protokoll wird die amplifizierte Probe einer Agarose-Gelelektrophorese und Sequenzierung unterzogen, um die Bakterienarten innerhalb der Weißen Fliege zu bestimmen und das spezifische Gen jedes Bakteriums zu identifizieren. Um das Bakteriom der Weißen Fliege zu sezieren und zu reinigen, geben Sie 100 Mikroliter 1x PBS-Lösung auf einen Objektträger.

Pflücken Sie dann die dritte oder vierte Nymphen aus Watteblättern. Und tauchen Sie sie in die PBS ein. Unter dem Mikroskop ziehst du mit feinen entomologischen Nadeln die Bakteriome aus dem Körper der Weißen Fliege.

Seien Sie vorsichtig, wenn Sie das Bakteriom isolieren, da es klein und zerbrechlich ist. Schneide vorsichtig ein Loch auf einer Seite der Nymphe und drücke leicht auf die andere Seite, um die Bakteriome herauszulassen. Montieren Sie dann einen 20-Mikroliter-Mikrolader auf eine 0,5- bis 10-Mikroliter-Pipette und extrahieren Sie das einzelne Bakteriom aus dem PBS in den Mikrolader.

Waschen Sie das Bakteriom, um die Kontamination mit anderen Geweben der Weißen Fliege zu beseitigen, indem Sie das Bakteriom in das PBS pipettieren und extrahieren. Wiederholen Sie den Waschgang dreimal. Es wird dringend empfohlen, den Waschgang zu wiederholen, um so viele Verunreinigungen wie möglich zu vermeiden.

Pipettieren Sie das gewaschene Bakteriom sofort in ein Zentrifugenröhrchen mit 60 Mikrolitern PBS. Spritzenvorsatz filtriert das zusammengesetzte Bakteriom durch eine fünf Mikrometer große Filtermembran. Wiederholen Sie die Filtration mehrmals, um die gemischte Flüssigkeit gründlich durch die Membran zu bewegen.

Um das Filtrat zu amplifizieren, bereiten Sie den Puffer D2 vor, der mit dem empfohlenen Protokoll für die Amplifikation genomischer DNA aus Blut oder Zellen mit einigen Modifikationen verwendet werden soll. Geben Sie direkt 1,5 Mikroliter Filtrat in ein Zentrifugenröhrchen, gefolgt von 1,5 Mikrolitern Puffer D2. Gut mischen und die Probe 10 Minuten auf Eis inkubieren. Fügen Sie dann 1,5 Mikroliter Stopplösung hinzu.

15 Mikroliter des Reaktionspuffers und einen Mikroliter DNA-Polymerase zugeben und vorsichtig mischen. Inkubieren Sie die Mischung 16 Stunden lang bei 30 Grad Celsius, gefolgt von 65 Grad Celsius für drei Minuten. Führen Sie die PCR direkt auf dem amplifizierten Filtrat mit speziellen Primern durch, die für Bakterien entwickelt wurden, um die Bakterienspezies zu bestätigen.

Führen Sie auch eine PCR durch, um zu bestätigen, ob eine Kontamination durch das Wirtsgenom vorliegt, indem Sie Primer für die Gene der Weißen Fliege Beta-Aktin und EF1 gemäß der zuvor veröffentlichten Methode verwenden. Führen Sie abschließend eine Metagenomsequenzierung gemäß dem Textprotokoll durch. In dieser Abbildung sind Baumwolle für die Aufzucht der Weißen Fliege und mehrere Entwicklungsstadien der Weißen Fliege dargestellt.

Darunter ein adultes Tier und erste, zweite und vierte Nymphen. Die FISH-Analyse der Endosymbionten Portiera und Hamiltonella innerhalb der vierten Instar-Nymphe von MEAM1 ist hier dargestellt. Es wird eine Überlappung der beiden Bakterien beobachtet, die beide auf die Bakteriozyten der Weißen Fliege beschränkt sind.

Hier sind die transmissionselektronenmikroskopischen Aufnahmen des Portiera-Endosymbionten der Weißen Fliege zu sehen, die darauf hindeuten, dass Portiera seine Zellwand verlieren könnte. Nach der Sequenzierung und Bereinigung der Kontaminationsdaten für Adapter und Duplikate wurde das vollständige Genom des obligaten Symbionten Portiera erfasst. Daraus ergibt sich ein zirkuläres Genom von 358.232 Basenpaaren.

Darüber hinaus wurde ein Entwurf des Genoms von Hamiltonella erhalten, der 138 Contigs umfasste, die auf der Grundlage von gepaarten Endbeziehungen zu 89 Gerüsten zusammengesetzt wurden. Sobald Sie diese Technik beherrschen, kann sie in 20 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Proben vor der Kontamination durch die Umweltbakterien zu schützen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Analysen wie die RA-Sequenz und das Massenbakteriom durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Genexpression und den Metabolismus von Endosymbionten zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern aus dem Bereich der Entomologie und Mikrobiologie den Weg, um die Funktion von Endosymbionten in Insekten oder Gliederfüßern zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Symbionten aus Insektenbakterien extrahiert

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einigen der Reagenzien gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden sollten.