Einfache Handhabung von Architekturen in Protein-basierte Hydrogele für Zelle Kultur Anwendungen

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, makroporöse Hydrogele mit unterschiedlichen Porengrößen für Zellkulturanwendungen herzustellen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der 3D-Zellkultur zu beantworten, wie z. B. die prinzipielle Machbarkeit eines neuartigen Hydrogelmaterials für 3D-Zellkulturanwendungen. Der Hauptvorteil dieser Methodik besteht darin, dass sie eine Reihe von Techniken bietet, um ein neuartiges Material zu optimieren und an die Anforderungen verschiedener Zelltypen anzupassen.

Verdünnen Sie zunächst ein Milligramm des RGD-Peptids oder ein gleichwertiges Zelladhäsionspeptid in 100 Mikrolitern sterilem Wasser, um die Lösung von 10 Milligramm pro Milliliter zu erhalten. Entfernen Sie als Nächstes den Boden einer 96-Well-Platte und ersetzen Sie sie durch Plastikfolie zum Entfernen. Mischen Sie 100 Mikroliter BSA-Stammlösung und 100 Mikroliter THPC-Stammlösung in der 96-Well-Platte, um 200 Mikroliter des Hydrogels zu erhalten.

Mischen Sie die Komponenten, indem Sie sie mindestens fünfmal auf und ab pipettieren, um ein gleichmäßiges Hydrogel nach der Polymerisation zu gewährleisten. Stellen Sie die 96-Well-Platte etwa 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf, bis alle Hydrogele ordnungsgemäß polymerisiert sind. Entfernen Sie nach der Polymerisation vorsichtig und langsam die Plastikfolie vom Boden der Platte.

Drücken Sie die Hydrogele mit einem kleinen Stich aus der 96-Well-Platte und überführen Sie sie in 1,5-Milliliter-Röhrchen mit sterilem PBS pH 7,4. Lagern Sie die Hydrogele in phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei vier Grad Celsius bis zu mehreren Monaten. Um die Hydrogele gefriertrocknen zu lassen, füllen Sie zunächst 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 500 Mikrolitern sterilem entionisiertem Wasser und entfernen Sie die Kappen.

Übertragen Sie die Hydrogele mit einer Pinzette in die 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen. Wickeln Sie die 1,5-Milliliter-Röhrchen fest mit Paraffinfolie ein, wobei Sie für jedes Fläschchen mindestens drei Schichten verwenden. Stechen Sie mit einer Nadel kleine Löcher in die Folie, um die Gasabgabe aus den Schläuchen zu ermöglichen.

Um sicherzustellen, dass das Wasser und das Hydrogel vollständig gefrieren, stellen Sie das Fläschchen fünf Minuten lang in flüssige Stickstofflösung. Unmittelbar nach der Entnahme aus dem flüssigen Stickstoff die Fläschchen in den Gefriertrockner überführen, um ein Auftauen des Materials zu verhindern. Als alternativer Gefrierschritt können Sie die Fläschchen über Nacht bei minus 20 Grad Celsius halten, um die Hydrogele langsam einzufrieren.

Unmittelbar nach der Entnahme aus minus 20 Grad Celsius die Fläschchen in den Gefriertrockner überführen, um ein Auftauen des Materials zu verhindern. Nach 24 Stunden und der vollständigen Verdunstung des Wassers in und um das Hydrogel tauen Sie das Material auf, indem Sie es aus dem Gefriertrockner nehmen. Für die Partikelauslaugung mischen Sie die Bestandteile des Hydrogels wie zuvor.

Nach dem Mischen sofort Natriumchlorid hinzufügen, bis die Sättigung eintritt. Salz hinzufügen, bis Salzkristalle in der Lösung als weißer Niederschlag zu sehen sind. Die Porengrößen können verändert werden, indem die Salzkristalle vor der Verwendung gemahlen werden.

Übertragen Sie die 96-Well-Platte in einen Schüttler und schütteln Sie, bis die Polymerisation stattfindet. Nach ca. 10 Minuten nimmst du die Hydrogele wie zuvor von der Platte. Inkubieren Sie die Hydrogele mindestens 24 Stunden lang bei Raumtemperatur in sterilem Wasser auf einem Rotator, um das gesamte Salz aus der Hydrogel-Vorlage zu eluieren.

Lagern Sie die Hydrogele bis zu mehreren Monaten bei vier Grad Celsius in PBS. Für eine schonende Bildung bereiten Sie Hydrogele wie beschrieben vor. Entfernen Sie dann ein Hydrogel mit einer Zange aus der Lösung.

Entfernen Sie das überschüssige Wasser mit stark saugfähigem Papier und legen Sie es auf einen Block Trockeneis. Frieren Sie das Hydrogel 30 Sekunden lang ein und nehmen Sie es vorsichtig aus dem Block. Beschädigen Sie das Hydrogel nicht.

Kratzen Sie es vorsichtig mit einem Spachtel vom Block ab. Füllen Sie das Hydrogel in eine 1,5-Milliliter-Tube und trocknen Sie es über Nacht bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie eine Rhodamin-B-Stammlösung sowie serielle Verdünnungen vor, wie im Textprotokoll beschrieben.

Nehmen Sie das Hydrogel aus der gelagerten Lösung und geben Sie es in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter 0,01 Milligramm pro Milliliter Rhodamin-B-Lösung. Färben Sie das Hydrogel über Nacht in Rhodamin B-Lösung bei Raumtemperatur. Übertragen Sie am nächsten Tag das Hydrogel, das sichtbar gemacht werden soll, auf 10 Milliliter PBS und waschen Sie es mindestens drei Stunden lang.

Schneide mit einer Klinge kleine Scheiben aus dem Hydrogel heraus. Übertragen Sie dann das Hydrogel auf einen mikroskopisch kleinen Objektträger mit acht Vertiefungen und bedecken Sie ihn mit PBS. Visualisieren Sie das Hydrogel mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop bei einer Wellenlänge von 514 Nanometern.

Sterilfiltrieren Sie alle Stammlösungen mit einem 0,45-Mikron-Filter. Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Hydrogels und fügen Sie das Zelladhäsionspeptid vor der Hydrogelpolymerisation hinzu. Nachdem Sie die Komponenten gemischt haben, pipettieren Sie die Mischung sofort in einen mikroskopisch kleinen Objektträger mit acht Vertiefungen, bis der Boden vollständig bedeckt ist.

Übertragen Sie die Zellen in ein vorgewärmtes steriles DMEM-Zellkulturmedium, das mit fötalem Rinderserum, Penicillin-Streptomycin und nichtessentieller Aminosäurelösung ergänzt wird. Nachdem Sie die Zellen mit einer Neubauer-Zählkammer gezählt haben, pipettieren Sie vorsichtig 200 Mikroliter der gewünschten Anzahl von Zellen auf die Hydrogeloberfläche. Decken Sie den mikroskopisch kleinen Objektträger mit acht Vertiefungen mit einem Deckel ab und geben Sie ihn in einen Inkubator.

Nach mindestens vier Stunden Zellanheftung waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 Mikrolitern steriler Zellkultur-PBS. Als nächstes fixieren Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern 3,7% Formaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur und waschen Sie sie zweimal mit PBS. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern 0,1 % Triton X für fünf Minuten, bevor Sie sie noch zweimal mit PBS waschen.

Färben Sie die Zellen mit Toluidin-Rhodamin, indem Sie fünf Mikroliter methanolische Brühe mit 195 Mikrolitern PBS mischen und den Zellen bei Raumtemperatur zusetzen. Färben Sie die Zellen 20 Minuten lang im Dunkeln, bevor Sie sie zweimal mit PBS waschen. Untersuchen Sie die Adhäsionseigenschaften der Zellen mit einem konfokalen Mikroskop bei 514 Nanometern.

Analysieren Sie die Eigenschaften des Hydrogels, wie im Textprotokoll beschrieben. Wie hier gezeigt, haben die polymerisierten und gefärbten Hydrogele keine ausgeprägten Architekturen. Nach der Gefriertrocknung der Hydrogele bei unterschiedlichen Temperaturen kann die durchschnittliche Größe der Poren innerhalb des Hydrogels auf bis zu 60 Mikrometer ausgedehnt werden.

Durch die Salzlaugung entstehen gleichmäßige Netzwerke mit Porengrößen von etwa 10 Mikrometern. Die Größe kann weiter angepasst werden, indem Salzkristalle vor der Verwendung gemahlen werden. Die Anwendung eines Gradientengefrieransatzes auf einem Trockeneisblock führt zur Bildung von Kanälen mit einem Durchmesser von etwa 20 Mikrometern und einer Länge von mehreren hundert Mikrometern.

Vor der Funktionalisierung mit der zelladhäsiven Einheit können die Zellen nicht an der Oberfläche des Hydrogels haften und weisen eine runde Morphologie auf. Erst nachdem sie das Material mit dem Zelladhäsionspeptid versorgt haben, finden die Zellen fokale Adhäsionspunkte, die eine korrekte Adhäsion der Zelle auf ein Material ermöglichen. Dies ist entscheidend für den Einsatz neuartiger Materialien in 3D-Zellkulturanwendungen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Architektur eines Hydrogels mit einfachen Methoden manipulieren können. Diese Methode kann für die meisten neuartigen Hydrogelsysteme angewendet werden, um mehr über die Verwendung in der Zellkultur zu erfahren und die Architektur des Hydrogels je nach Verwendungszweck zu optimieren.