Lichtvermittelte reversible Modulation des mitogenaktivierten Proteinkinase-Pathways während der Zelldifferenzierung und Xenopus Embryonale Entwicklung

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, Licht zu verwenden, um den Mitogen-aktivierten Proteinkinase-Signalweg in intakten Zellen und in Xenopus-Embryonen zu kontrollieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Zell- und Entwicklungsbiologie zu beantworten, z. B. wie zeitliche Modulationen der Kinaseaktivität die Selbstbestimmung während der Zelldifferenzierung und der Embryonalentwicklung regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Mitogen-aktivierte Proteinkinase-Aktivität in intakten Zellen und in mehrzelligen Organismen, wie z.B. sich entwickelnden Embryonen, reversibel gesteuert werden kann.

Diese Methode kann Einblicke in die Signalkinetik während der Embryonalentwicklung von Xenopus geben. Es kann auch auf andere Modellsysteme wie Sokotra, Zebrafisch oder Maus angewendet werden. Heute wird ein Doktorand aus meinem Labor, Vishnu Krishnamurthy, das Verfahren demonstrieren.

Und Aurora Turgeon, ein Post-Star in meinem Labor, wird alle Verfahren demonstrieren, die mit Xenopus-Embryonen verbunden sind. Bauen Sie zunächst das Zellkulturgerät zusammen, indem Sie eine autoklavierte sterile PDMS-Kammer auf einen sterilen PLL-beschichteten Deckglas in einer 60-mm-Petrischale legen. Verwenden Sie anschließend 0,5 ml 0,25 % Trypsin, um pHK21-Zellen aus einer Vertiefung einer 6-Well-Gewebekulturplatte zu lösen.

Nachdem Sie die Zelldichte mit dem Hämozytometer gezählt haben, besiedeln Sie die Kammer mit 20.000 Zellen in 200 Mikrolitern Zellkulturmedium. 24 Stunden nach der Zellplattierung transfizieren Sie die Zellen mit 50 bis 100 Nanogramm CRY2-mCherry-Raf1 2A2CIBMG PCaA X-Plasmid gemäß dem Protokoll des Herstellers. Wechseln Sie das Medium drei Stunden nach der Transfektion auf 200 Mikroliter frisches Kulturmedium und lassen Sie die Zellen über Nacht erholen, indem Sie die Kultur in einem Inkubator mit 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid inkubieren.

Beginnen Sie am nächsten Tag mit der optogenetischen Induktion und Bildgebung, indem Sie zunächst das Zellkulturmedium durch 200 Mikroliter kohlendioxidunabhängiges Medium ersetzen. Richten Sie dann das Datenerfassungsprotokoll ein. Wählen Sie einen 488-Nonometer-Anregungs-FITC-Kanal für die optogenetische Stimulation und den 561-Nanometer-Anregungs-CRITC-Kanal, um die zelluläre Lokalisierung des mCherry-markierten Proteins zu verfolgen.

Messen Sie die Leistung des blauen Lichts, indem Sie einen Leistungsmesser in der Nähe des Objektivfensters platzieren. Eine Gesamtleistung von zwei Mikrowatt ist ausreichend, um eine CIBN CRY2-PHR-Assoziation zu induzieren. Richten Sie eine Zeitstempelerfassung mit dem Fünf-Sekunden-Intervall ein.

Und die Gesamterfassungszeit von zwei Minuten. Wenden Sie geeignetes Indexabgleichsmaterial auf das Zielfenster an. Stellen Sie die Zellkammer auf den Mikroskoptisch und verwenden Sie den Hellfeldmodus, um die Zellen auf der Deckglasoberfläche mit den Okularen zu fokussieren.

Bewegen Sie als Nächstes den Mikroskoptisch, um eine transfizierte Zelle unter grünem Licht zu lokalisieren. Nehmen Sie eine Reihe von Bildern mit Zeitstempel sowohl im FITC- als auch im CITC-Kanal auf. Das grundlegende Probenbild zeigt CIBNGPCAAX lokalisiert auf der Plasmamembran.

Dies ist ein Schnappschuss von CRY2 mCherry raf1 vor der Blaulichtsimulation, während dieses Bild einen Schnappschuss von CRY2 mCherry raf eins nach zehn Impulsen der Blaulichtstimulation zeigt. Stellen Sie das LED-Array her, indem Sie tonale blaue LEDs in zwei Steckplatinen einsetzen und mit Strombegrenzungswiderständen verbinden. Legen Sie die Steckbretter in eine Aluminiumbox.

Stecken Sie zwei Metalldrähte ein, um die Platinen mit der Stromversorgung zu verbinden. Stellen Sie sicher, dass die Länge des Drahtes ausreichend ist, wenn der Leuchtkasten in einem Kohlendioxid-Inkubator platziert wird. Platzieren Sie dann einen transparenten Lichtdiffusor, der als Abdeckung des Leuchtkastens dient.

Kalibrieren Sie abschließend die Ausgangsleistung jeder LED bei einem Bereich von Spannungseingängen. Verwenden Sie eine Leistung von null Milliwatt pro Quadratzentimeter für den 24-Stunden-PC12-Zelldifferenzierungsassay. Stellen Sie das LED-Array in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, der mit fünf Prozent Kohlendioxid angereichert ist.

Schließen Sie es über die Metalldrähte an die Stromversorgung an und stellen Sie die Leistung der LED auf null Punkt zwei Milliwatt pro Quadratzentimeter ein. Platzieren Sie die 12-Well-Platte mit den transfizierten PC12-Zellen auf dem Fenster des LED-Arrays. Richten Sie die Platte so aus, dass jede Vertiefung vollständig beleuchtet ist.

Tragen Sie eine kontinuierliche Lichtbeleuchtung für 24 Stunden auf. Um die differenzierten Zellen abzubilden, richten Sie die Datenerfassung mit einem einzelnen Snapshot ein. Verwenden Sie 200 Millisekunden sowohl für den GFP- als auch für den TexasRed-Kanal.

Nehmen Sie Bilder der transfizierten Zellen sowohl im GFP- als auch im TexasRed-Kanal auf und speichern Sie die Dateien für die Datenanalyse. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Herstellung von Nadeln für die RNA-Mikroinjektion, indem Sie Glaskapillaren mit einem Kapillarabzieher ziehen. Entfernen Sie die Geleehülle von den Embryonen, indem Sie sie 15 Minuten lang mit drei Prozent Cystein behandeln, das in 0,2 XMMR verdünnt ist.

Übertragen Sie die Embryonen auf drei Prozent Polysaccharose und null Komma fünf XMMR-Lösung für die Mikroinjektion. Injizieren Sie 500 Pikogramm in ein Nanogramm CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX-RNA in jeden Embryo. Kultivieren Sie dann die mikroinjizierten Embryonen in der Mikroinjektionslösung bei Raumtemperatur.

Wenn die Embryonen das Stadium der medialen Gastrula erreicht haben, übertragen Sie sie in eine 0,2-fache MMR-Lösung und kultivieren Sie sie bis zum gewünschten Entwicklungsstadium. Platzieren Sie dann die 12-Well-Platte auf dem selbstgebauten LED-Array für die Blaulichtbehandlung. Platzieren Sie einen Spiegel auf der 12-Well-Platte, um eine vollständige Blaulichtbeleuchtung der Embryonen zu gewährleisten.

Entnehmen Sie die Embryonen für die histologische, Western-Blot- oder Genexpressionsanalyse, nachdem Sie die gewünschte Zeit blauem Licht ausgesetzt waren. Dieses Bild zeigt Mehrkanal-Schnappschüsse von PC12-Zellen, die nach 24 Stunden Blaulichtstimulation bei null Punkt zwei Milliwatt pro Quadratzentimeter mit CRY2-2A-2CIBN transfiziert wurden. Sowohl die GFP- als auch die mCherry-Reporter sind zu sehen.

Kreise markieren differenzierte Zellen und Quadrate markieren undifferenzierte Zellen. Hier wurden die Zellen auf die gleiche Weise behandelt wie die im vorherigen Bild, nur dass keine Blaulichtstimulation verwendet wurde. Es ist keine Differenzierung zu erkennen.

Diese Zellen zeigen repräsentative Ergebnisse nach Transfektion mit raf1 GFPCaaX, einem konstitutiv aktiven raf1. Die Kreise und Rechtecke markieren differenzierte bzw. undifferenzierte Zellen. Dieses Histogramm zeigt die Differenzierungsverhältnisse von PC12-Zellen, die mit CA-Raf1 transfiziert, mit CRY2 mCherry raf1 und CIBN GFP Caax co-transfiziert und einzeln mit CRY2A 2CIBN transfiziert wurden.

Nur Zellen, die blauem Licht ausgesetzt waren, zeigten eine signifikante Differenzierung. Dieses Bild zeigt die Morphologie normaler Xenopus-Embryonen ohne MRNA-Injektion und ohne Lichtbehandlungen. Dieses Bild zeigt Embryonen, die mit CRY2 2A2CIBN MRNA injiziert und einer Blaulichtstimulation unterzogen wurden.

Die Aktivierung von raf1 durch die Behandlung von CRY2 2A2CIBN-injizierten Embryonen mit blauem Licht induziert ektopische schwanzähnliche Strukturen in der Kopfregion. Nach diesem Verfahren können weitere Fragen beantwortet werden, z.B. wie die stadienspezifische Aktivierung des Mitogen-aktivierten Proteinkinase-Signalwegs die Genexpression reguliert. Diese optogenetische Methode kann verallgemeinert werden, um andere Signalwege mit ähnlichen Aktivierungsmechanismen zu steuern.