Name: Ein einheitlicher methodischer Rahmen für die vestibuläre Schwannomforschung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Erfahren Sie die Verarbeitung von menschlichen Vestibularis-Schwannom-Proben für Primärzellkulturen und Tumorsekretanalysen. Diese minimal-invasive Methode ermöglicht die Testung therapeutischer Kandidaten direkt an kultivierten Zellen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Institute of Deafness und andere Kommunikationsstörungen Zuschüsse R01DC015824 (KMS) und T32DC00038 (unterstützt JES und SD), die Abteilung für Verteidigung gewähren W81XWH-14-1-0091 (KMS), die Bertarelli Foundation (KMS) , Die Nancy Sayles Day Foundation (KMS), das Lauer Tinnitus Research Center (KMS) und die Barnes Foundation (KMS).

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<li>Torres-Martin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+in+vestibular+schwannomas+shows+critical+deregulation+of+microRNAs+and+upregulation+in+those+included+in+chromosomal+region+14q32%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32.</a> PLoS One. 8 (6), e65868(2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Manuskript beschreibt einen einheitlichen methodischen Rahmen für die VS-Forschung und skizziert die gleichzeitige Verarbeitung von menschlichen VS- und GAN-Proben für nachgeschaltete Forschungsanwendungen. Da die VS-Forschung das Alter der Präzisionsmedizin betritt, wird die Vorbereitung der gleichen Probe in Formen, die in der Lage sind, zahlreiche Forschungsfragen zu beantworten, die Entdeckung molekularer, zellularer, genetischer und proteomischer Erkenntnisse, die für einzelne Patienten spezifisch sind, ermö...

Vestibuläre Schwannome (VSs) sind die häufigsten Neubildungen des Cerebellopontin-Winkels, diagnostiziert in 1 bei jedem 100.000 Individuen. Obwohl nicht-metastatisch, diese Tumoren stark beeinflussen die Lebensqualität eines Patienten 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Betroffene Personen leben gewöhnlich mit Hörverlust, Tinnitus und einem Gefühl der akustischen Fülle. Die Symptome werden zunehmend schwächenden, wenn der Tumor wächst, was Balanceprobleme, Gesichtslähmung und Beeinträchtigung anderer Hirnnervenfunktionen verursacht. Lebensbedrohliche Komplikationen durch Hirnstammkompression können ebenfalls auftreten 7 . Management-Optionen für VS sind im Wesentlichen auf wachsames Warten auf statische Tumoren und stereotaktische Strahlentherapie oder chirurgische Resektion für wachsende Tumoren beschränkt <sUp class = &quot;xref&quot;&gt; 8. Die chirurgische Entfernung dieser Tumore in forschungsbezogenen Krankenhäusern bietet die Möglichkeit, frisches Tumorgewebe zu erwerben und zu analysieren, das während der Patientenchirurgie gesammelt wurde. Ein spezifischer chirurgischer Ansatz für VS, die translabyrinthische Resektion, kann sogar den Zugang zu wertvollem menschlichem sensorischen Epithel aus dem Innenohr und der Perilymph Weil VSs aus einem peripheren Sinnesnerv ( dh dem Vestibularis) entstehen, ist es wichtig, VS-assoziierte Beobachtungen mit denen zu vergleichen, die von einem geeigneten Kontrollnerv abgeleitet sind, wie dem menschlichen Nervenvenen (GAN). Gesunde GANs werden regelmäßig bei Parotidektomien oder Halsdissektionen geopfert und können als robuste Modelle für eine gesunde Schwann-Zellphysiologie verwendet werden 9 . Da es keine FDA-zugelassenen Medikamente für die Behandlung oder Prävention von sporadischen VS gibt, ist es zwingend erforderlich, dass Forscher die zugrunde liegenden molekularen Mecha aufklärenNismen der Krankheit, um therapeutische Ziele zu identifizieren. Proteine, die gezeigt haben, dass sie eine Rolle bei der VS-Pathogenese spielen, umfassen Merlin, vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), Cyclooxygenase 2 (COX-2), Kernfaktor Kappa B (NF- &amp; kgr; B), Tumornekrosefaktor alpha (TNF-alpha) , Epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) und verwandte Signalmoleküle 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Jüngste Fortschritte haben erweitert und verbesserte Protokolle für die Sammlung, Verarbeitung, Kultur und nachgelagerte Untersuchung von primären menschlichen vestibulären Schwannomen und gesunden Nervengeweben 18 , 19 . Allerdings sind die meisten bestehenden Protokolle entworfen, um die Vorbereitung unterzubringenVon solchen Geweben für eine einzige nachgeschaltete Forschungsapplikation ( dh Zellkultur allein). Dieser Artikel stellt einen einheitlichen methodischen Rahmen für die gleichzeitige Verarbeitung einer einzelnen primären menschlichen VS- oder GAN-Probe für mehrere nachgeschaltete Anwendungen dar: Zelltypspezifische Kultur, Proteinextraktion, RNA-Konservierung, Tumorsekretionsansammlung und Gewebefixierung. Diese Arbeit beschreibt auch die chirurgische Sammlung und Verarbeitung von menschlicher Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) und Perilymph während der translabyrinthischen VS-Resektion, da diese eng verwandten Gewebe als wichtige Quellen für Biomarker für VS dienen können. Schließlich stellt dieses Protokoll Schritte für die virale Transduktion von primären menschlichen VS-Zellen in Kultur als eine neuartige Anwendung dieses Gewebes für die Verwendung in der Gentherapie vor.

<table><tbody><tr><td>BioCoat Poly-D-Lysin/Laminin 12 mm #1 Deutsches Glasdeckglas</td><td>Corning</td><td>354087</td><td>Oder bereiten Sie Deckgläser mit Corning Laminin (CB-40232) und Cultrex Poly-L-Lysin (3438-100-01) vor...</td></tr> <tr><td>CELLSTAR 15 mL Zentrifugenröhrchen, konischer Boden, Graduierung, steril</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188161</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 50 mL Zentrifugenröhrchen, konischer Boden, Graduierung, steril</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Zellkulturschale, 60 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase aus Clostridium histolyticum, steril gefiltert</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>Costar 24 Well Clear TC-treated Multiple Well Platten, steril</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, Pyruvat, kein Glutamin, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 Pinzette, Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td>Autoklav vor dem Gebrauch</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette, Standardspitze, Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Autoklav vor dem Gebrauch</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, qualifiziert, USDA-zugelassene Regionen, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437-028</td><td>Aliquot in 50 mL Röhrchen und Lagerung in -20°; C Gefrierschrank</td></tr><tr><td>Hyaluronidase aus Rinderhoden, Typ I-S, lyophilisiertes Pulver</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP Spritzenfiltereinheit, 0,22 &Mikro; m, Polyethersulfon, 33 mm, steril</td><td>EMD-Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, Reagenzqualität, kristallines</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Vor der Verwendung: Festlegung von Standardarbeitsanweisungen auf der Grundlage der online verfügbaren Protokolle</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>Autoklav vor der Verwendung</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml), 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP Phosphatase-Inhibitor-Tabletten</td><td>Roche</td><td>04906845001</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protease-Inhibitor-Tabletten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten und Pipettenspitzen, 5/10/25 mL</td><td></td><td>Variabler</td><td></td></tr><tr><td>variabler Homogenisierungsstößel aus Kunststoff für 1,5/2,0 mL Mikroröhrchen</td><td>E& K Scientific</td><td>EK-10539</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide Nadeln, 27 G x 1 1/2 Zoll</td><td>BD</td><td>301629</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Puffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-115</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater (RNA-Stabilisierungslösung)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen, Polypropylen, 0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363719</td><td>Autoklav vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen, Polypropylen, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td>Autoklav vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Kochsalzlösung - 0,9% Natriumchlorid-Injektion, bakteriostatisch, 20 mL</td><td>Hospira</td><td>0409-1966-05</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklingen - #15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Schuknecht Saugrohr 24 Gauge</td><td>Bausch + Lomb</td><td>N1698 42</td><td>Nützlich für den chirurgischen Zugang (zusätzlich zu den üblichen otologischen chirurgischen Instrumenten) und z. B. ein blauer chirurgischer Marker</td></tr><tr><td>Probenbehälter, ODER steril, 4OZ</td><td>Medline</td><td>DYND30331H</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000-C Stereomikroskop</td><td>Zeiss</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>Spritze/Nadel-Kombination, Luer-Lok-Spitze, 5 mL, 22 g x 1 in.</td><td>BD</td><td>309630</td><td></td></tr><tr><td>Nur Tuberkulin-Spritze, Slip-Spitze, 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>nur Tuberkulin-Spritze, Slip-Tip, 3 mL</td><td>BD</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschall-Homogenisator, Serie 4710, CV18-Sonde</td><td>Cole-Parmer</td><td>CP25013</td><td></td></tr></tbody></table>

ein einheitlicher methodischer rahmen für die vestibuläre schwannomforschung

A Unified Methodological Framework for Vestibular Schwannoma Research

Vestibuläre Schwannome sind die häufigsten Neubildungen des Cerebellopontinwinkels, was 6-8% Prozent aller intrakraniellen Wucherungen ausmacht. Obwohl diese Tumore einen sensorineuralen Hörverlust bei bis zu 95% der betroffenen Personen verursachen, bleiben die molekularen Mechanismen, die diesem Hörverlust zugrunde liegen, unklar. Dieser Artikel beschreibt die Schritte in unserem Labor, um die Sammlung und Verarbeitung von verschiedenen primären menschlichen Gewebe Proben für nachgeschaltete Forschungs-Anwendungen integral in die Studie der vestibulären Schwannome zu erleichtern. Speziell beschreibt diese Arbeit einen einheitlichen methodischen Rahmen für die Sammlung, Verarbeitung und Kultur von Schwann und Schwannomzellen aus chirurgischen Proben. Hierbei handelt es sich um parallele Verarbeitungsschritte, die für die aktuelle Forschung als wesentlich erachtet werden: die Sammlung von Tumor- und Nervensekreten, die Erhaltung der RNA und die Extraktion von Protein aus gesammelten Geweben, die Fixierung von Gewebe zur Vorbereitung von Abschnitten,D die Exposition von primären menschlichen Zellen zu Adeno-assoziierten Viren für die Anwendung auf Gentherapie. Darüber hinaus hebt diese Arbeit den translabyrinthischen chirurgischen Ansatz hervor, um diesen Tumor als eine einmalige Gelegenheit zu erhalten, menschliches sensorisches Epithel aus dem Innenohr und der Perilymph zu erhalten. Tipps zur Verbesserung der experimentellen Qualität werden zur Verfügung gestellt und häufige Fallstricke hervorgehoben.

Primäre menschliche VS-Zellen in Kultur, wie in Abschnitt 5 beschrieben, können als informative Modelle für krankheitsassoziierte Prozesse in vielen nachgeschalteten Forschungsanwendungen behandelt werden ( Abbildung 1 ). Gesunde Schwann-Zellen, die in Abschnitt 6 kultiviert wurden, liefern einen direkten und lehrreichen Vergleichspunkt. Wie im Folgenden beschrieben, sind umfangreiche Daten von VSs und GANs, die nach diesem einheitlichen methodischen Rahmen ...

Ziel dieses Protokolls ist es, die Erfassung und Verarbeitung von humanen chirurgischen Proben für mehrere nachgeschaltete Anwendungen im vestibulären Schwannom und Schwann Zellforschung zu skizzieren.

Ein einheitlicher methodischer Rahmen für die vestibuläre Schwannomforschung

Vestibular schwannomas are the most common neoplasms of the cerebellopontine angle, making up 6-8% percent of all intracranial growths. Though these ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine vom Operationssaal erhaltene humane Vestibularisschwannomprobe für die Primärzellkultur und die Sammlung von Tumorsekretionen aufzubereiten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Vestibularisschwannomforschung zu beantworten, beispielsweise wie eine primäre humane Tumorprobe, die für mehrere biomolekulare Assays vorgesehen ist, am besten entgegengenommen, gelagert und verarbeitet werden sollte. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine minimal invasive Kulturmethode nutzt, um primäre humane Vestibularisschwannomzellen zu vermehren.Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zur Therapie des Vestibularisschwannoms, da aussichtsreiche therapeutische Kandidaten direkt an kultivierten Zellen getestet werden können. Beginnen Sie damit, den Behälter mit der frisch gewonnenen Vestibularisschwannom- oder Großohrnervprobe vom Eis, das für den Transport aus dem Operationssaal verwendet wurde, in eine laminare Flusswerkbank im Labor zu überführen. Übertragen Sie die Probe mit sterilen Pinzetten vorsichtig in die erste von drei 1,5-Milliliter-Röhrchen, die jeweils mit 1,4 Milliliter einer äuß

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Es wird ein Verfahren beschrieben, um dreidimensionale vestibulo okulären Reflexe (3D VOR) beim Menschen mit Hilfe eines sechs Freiheitsgraden (6DF) Bewegungssimulator messen. Die Verstärkung und Versatz des 3D-Winkelstellung VOR stellen ein direktes Maß für die Qualität der Vestibularfunktion. Repräsentative Daten auf gesunden Probanden...

Dreidimensional Vestibuläre Ocular Reflex-Test mit Six Degrees of Freedom Bewegung Platform

Vestibuläre Schwannome (VSS) nicht-malignen Tumoren von Schwann-Zellen (SC) Ursprungs, mit Mutationen im NF2 Tumorsuppressor-Gen assoziiert ist. Wir berichten über einen reproduzierbaren, effizienten Protokoll für primäre humane VS Zellkultur, die für die molekulare und zelluläre experimentelle Manipulation und Analyse ermöglicht und rekapituliert die heterogene Natur der menschlichen Krankheit.

Primäre Kultur der Menschen vestibuläre Schwannome

Zur Beurteilung der morphologischer Veränderungen der Hirnnerven wie Verlust der neuronalen wurde Strukturen oder Schwellung der Hirnnerven in Menière Krankheit (MD) oder bei gesunden Personen in Vivo, ein Protokoll der Bewertung entwickelt mittels Magnetresonanztomographie (MRT) . Zusätzliche MRT-basierte Bestätigung der MD wurde durchgeführt.

In Vivo Morphometrische Analyse der menschlichen Hirnnerven mittels Kernspintomographie in der Menière Krankheit Ohren und Normal hörende Ohren

Die Wahrnehmung der Schwerkraft wird gemeinhin durch die subjektive visuelle Vertikale in der Kopfaufrechtstellung bestimmt. Die zusätzliche Beurteilung an Kopfneigungen von 15° und 30° in der Walzenebene sorgt für einen erhöhten Informationsgehalt zur Erkennung einer beeinträchtigten Gravizeptivwahrnehmung.

Bewertung der statischen Gravizeptiven Wahrnehmung in der Rollebene mit dem subjektiven visuellen vertikalen Paradigma

Die Methodik untersuchte visuelle und vestibuläre Beiträge zur Blickstabilisierung während optokinetischer und Ganzkörperrotationen. Die Stimulation erfolgte durch visuelle, vestibuläre und visuovestibuläre Studien. Die Torsions-Augenbewegungsverstärkung und die Nystagmusfrequenzen dienten als Indikatoren für die subkortikale Weiterleitung sensorischer Bewegungsinformationen an die reflexive Hirnstammreaktion für jeden Versuch.

Verwendung von Eye-Tracking zur Beurteilung der relativen Bedeutung von visuellem und vestibulärem Input für die subkortikale Bewegungsverarbeitung in der Rollebene

We present a new dissection method to extract the vestibular ganglion and all five vestibular organs (utricle, saccule, and three cristae: lateral/horizontal, anterior, and posterior) as one whole-mount vestibular complex. Confocal imaging allows visualization of vestibular neuron cell bodies for quantification, as well as neuronal projections to the sensory...

Whole-Mount Dissection of the Vestibular Complex and Quantification of Vestibular Ganglion Neurons in Mice

Die Behandlung von isoliertem rezidivierendem Lungenkrebs in einem zuvor bestrahlten Bereich ist eine Herausforderung. Hier beschreiben wir eine endobronchiale Ultraschall (EBUS)-gesteuerte Cisplatin-Injektion zur Behandlung von Patienten mit lokalisiertem Lungenkrebsrezidiv in einem zuvor bestrahlten Feld.

Endobronchial intratumorale Injektion von Cisplatin zur Behandlung von isolierten Mediastinale Recurrence von Lungenkrebs Ultraschall-gesteuerte

Gut differenzierte neuroendokrine Tumoren overexpress Somatostatin-Rezeptoren, die für die diagnostische Bildgebung mit der radioaktiven Somatostatin-analog 68Ga-DOTATATE genutzt werden können. Dieses Protokoll beschreibt die enzymatische 68Ga-DOTATATE, Qualitätskontrolle, Patientenvorbereitung und anschließende PET/CT-Bildgebung. Strahlenschutz und Verengungen der Zeit wegen der kurzen Halbwertszeit von 68Ga werden berücksichtigt.

Ein praktischer Leitfaden für die Produktion und PET/CT-Bildgebung von 68Ga-DOTATATE für neuroendokrine Tumoren in der täglichen klinischen Praxis

Diese Arbeit setzt ein fortschrittliches Protokoll vor, um die Tumorbelastung durch den Nachweis von grünen Fluoreszenzprotein- und Biolumineszenzsignalen sowie die Integration quantitativer molekularer Detektionstechniken genau zu bewerten.

Studieren von dreifach negativem Brustkrebs mit orthotopischem Brustkrebsmodell

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Entstehung von orthotopischen Bauchspeicheldrüsentumoren und die schnelle Verdauung von frisch isolierten murinen Bauchspeicheldrüsentumoren. Nach der Verdauung können lebensfähige Immunzellpopulationen für weitere nachgelagerte Analysen verwendet werden, einschließlich der Ex-vivo-Stimulation von T-Zellen zur intrazellulären Zytokindetektion durch Durchflusszytometrie.

Generierung von orthotopischen Pankreastumoren und Ex-vivo-Charakterisierung der tumorinfiltrierenden T-Zell-Zytotoxizität

Erfahren Sie die Verarbeitung von menschlichen Vestibularis-Schwannom-Proben für Primärzellkulturen und Tumorsekretanalysen. Diese minimal-invasive Methode ermöglicht die Testung therapeutischer Kandidaten direkt an kultivierten Zellen.

Ein einheitlicher methodischer Rahmen für die vestibuläre Schwannomforschung

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