Ein einheitlicher methodischer Rahmen für die vestibuläre Schwannomforschung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine vom Operationssaal erhaltene humane Vestibularisschwannomprobe für die Primärzellkultur und die Sammlung von Tumorsekretionen aufzubereiten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Vestibularisschwannomforschung zu beantworten, beispielsweise wie eine primäre humane Tumorprobe, die für mehrere biomolekulare Assays vorgesehen ist, am besten entgegengenommen, gelagert und verarbeitet werden sollte. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine minimal invasive Kulturmethode nutzt, um primäre humane Vestibularisschwannomzellen zu vermehren.

Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zur Therapie des Vestibularisschwannoms, da aussichtsreiche therapeutische Kandidaten direkt an kultivierten Zellen getestet werden können. Beginnen Sie damit, den Behälter mit der frisch gewonnenen Vestibularisschwannom- oder Großohrnervprobe vom Eis, das für den Transport aus dem Operationssaal verwendet wurde, in eine laminare Flusswerkbank im Labor zu überführen. Übertragen Sie die Probe mit sterilen Pinzetten vorsichtig in die erste von drei 1,5-Milliliter-Röhrchen, die jeweils mit 1,4 Milliliter einer äußeren PBS gefüllt sind.

Schließen Sie jedes Röhrchen, sobald es die Probe enthält, und schütteln Sie es vorsichtig, um zu waschen. Geben Sie die Probe in eine trockene Petrischale mit 60 Millimeter Durchmesser und entfernen Sie mit einer Pinzette das gesamte abgestorbene Gewebe in Bereichen mit ausgeprägten Blutgefäßen. Teilen Sie die Probe mit einer Pinzette oder einer Skalpellklinge in separate Stücke für die RNA-Konservierung, Proteinextraktion, Sekretionsgewinnung, Fixierung und Zellkultur auf.

Überführen Sie das für die Zellkultur bestimmte Gewebestück in eine neue 60-Millimeter-Kulturschale, die fünf bis acht Milliliter kaltes, ergänztes DMEM F12-Medium enthält. Legen Sie das für die Sammlung von Sekreten bestimmte Stück Vestibularisschwannom oder großer Halsnerv in ein leeres 1,5-Milliliter-Röhrchen. Beginnen Sie damit, 500 Mikroliter DMEM, das nicht mit FBS ergänzt ist, in zwei 1,5-Milliliter-Röhrchen pipettieren.

Das erste Röhrchen wird zur Sammlung der Tumorsekretionen verwendet, das zweite dient als passende Kontrolle. Stellen Sie eines der Röhrchen mit DMEM auf eine kalibrierte digitale Waage. Tariert die Waage, geben Sie das für die Sekretionssammlung vorgesehene Gewebestück in das Röhrchen und wiegen Sie es.

Notieren Sie das Ergebnis, das das Gewicht des Gewebes allein darstellt. Unter einer laminaren Luftströmungshaube passen Sie das Volumen von DMEM im Reagenzglas auf 100 Mikroliter pro 10 Milligramm der Probe an. Stellen Sie das Reagenzglas mit der Gewebeprobe und der dazugehörigen Kontrolle in den Inkubator.

Mindestens 72 Stunden inkubieren, um biologisch nutzbare Mengen an Tumor- oder Nervensekretionen zu sammeln. Nach einer Inkubation von 72 Stunden das sekretionshaltige Medium mit einer Ein-Milliliter-Pipette vom Probematerial entfernen. Um wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen zu vermeiden, das Medium entsprechend der geplanten nachgeschalteten Analyse in neue Röhrchen portionieren.

Lagern Sie das ursprüngliche Gewebestück, Sekrete und das Kontroll-DMEM bis zur Initiierung nachgeschalteter Anwendungen in einem minus 80 Grad Celsius kalten Gefrierschrank. Beginnen Sie das Kultivierungsverfahren, indem Sie mit einer Pinzette in jeder Hand das Vestibularisschwannom-Gewebe in etwa ein Kubikmillimeter große Stücke zerlegen. Saugen Sie anschließend das Medium und die Tumorstücke mit einer 10 Millimeter-Serologischen Pipette ab und überführen Sie den gesamten Inhalt in ein 15 Milliliter-Konischgefäß.

Zentrifugieren Sie drei Minuten bei 1000G und 25 Grad Celsius. Während der Zentrifugation bereiten Sie das Disintegrationsmedium vor, indem Sie 4,7 Milliliter ergänztes DMEM F12-Medium mit 250 Mikrolitern Kollagenase und 50 Mikrolitern Hyaluronidase in einer 60-Millimeter-Kulturschale kombinieren. Nach der Zentrifugation bilden die Tumorstücke ein Pellet am Boden des kegelförmigen Röhrchens.

Pipettieren Sie den Überstand vorsichtig ab und entsorgen Sie ihn. Geben Sie anschließend zwei Milliliter frisch hergestelltes, Enzym enthaltendes Disintegrationsmedium auf das Tumorgewebe. Pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um das Gewebe aufzulösen, und überführen Sie es dann in die 60-Millimeter-Kulturschale.

Stellen Sie die Kulturschale 18 Stunden lang in den Inkubator. Am nächsten Tag erwärmen Sie das DMEM F12-Medium, das mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt wurde, in einem Wasserbad mit 37 Grad Celsius. Entfernen Sie die Schale mit der Vestibularisschwannomkultur aus dem Inkubator und bringen Sie sie in die Flusshaube. Aspirieren Sie mit einer 22-Gauge-Nadel, die an eine sechs Milliliter große Spritze angebracht ist, das Kulturmedium und überführen Sie es in ein neues 15-Milliliter-Konischgefäß.

Zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 1000G und 37 °C. Verwenden Sie in der Zwischenzeit sterile Pinzette, um die erforderliche Anzahl an mit Polydelycin und Laminin beschichteten Glasdeckgläsern in eine 24-Loch-Kulturplatte zu legen. Aus einem Tumorwürfel mit einem Kubikzentimeter können 24 bis 32 Kulturlöcher beimpft werden; daher ist es bei den meisten kleineren Tumoren angemessen, die Kultur für acht bis 16 Löcher zu planen.

Nach der Zentrifugation das Überstand entfernen und das verbleibende Zellpräparat in dem vorgewärmten Medium resuspendieren, sodass pro geplante Vertiefung ein Milliliter Zellsuspension vorliegt. Mit einer fünf Milliliter umfassenden serologischen Pipette zwei Milliliter Zellsuspension aufsaugen und jeweils einen Milliliter in eine Vertiefung der 24-Loch-Platte geben. Fahren Sie fort, das Tumorzellen enthaltende Medium aufzusaugen und abzugeben, wobei jeweils in Zwei-Milliliter-Schritten aufgesaugt wird, von denen ein Milliliter in jede geplante Vertiefung abgegeben wird, bis die Tumorzellsuspension gleichmäßig auf alle vorbereiteten Vertiefungen verteilt ist.

Stellen Sie die 24-Well-Platte über Nacht in den 37 Grad Celsius warmen Inkubator. Überprüfen Sie die Platte am nächsten Tag; wenn am Boden der Wells erheblicher Zelltrümmer bemerkt werden, wechseln Sie das Medium in jedem Well vorsichtig durch frisches, supplementiertes DMEM F12-Kulturmedium, wobei darauf geachtet werden muss, dass die anhaftenden Zellen nicht abgelöst werden. Falls keine Trümmer vorhanden sind, stellen Sie die Platte zurück in den Inkubator und wechseln das Medium erstmals am fünften Tag und danach alle drei Tage.

Dieses Hellfeldbild veranschaulicht das typische Organisationsmuster von Vestibularisschwannomzellen in Kultur. Diese immunfluoreszenten Aufnahmen einer primären humanen Vestibularisschwannomkultur wurden 48 Stunden nach der Exposition gegenüber GFP-exprimierendem ink 80, dargestellt in Grün, angefertigt. Die rote Fluoreszenz stammt von der Phalloidin-F-Aktin-Immunfärbung, die das Cytoskelett anfärbt, und die blaue Fluoreszenz ist DAPI, das den Zellkern anfärbt.

Der Ausschnitt ist ein Bild mit höherer Vergrößerung eines Bereichs des Bildes mit niedrigerer Vergrößerung. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die Zeitpunkte schriftlich festzuhalten, zu denen die Sekretionsprobe und die Kulturprobe in den Inkubator gegeben wurden, um sicherzustellen, dass spätere Schritte nach den korrekten Inkubationszeiträumen durchgeführt werden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie virale Transduktion, Fixierung, Immunfluoreszenz, Behandlung mit Wirkstoffen und RNA-Extraktion durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise wie unterschiedliche Viren in Zellen exprimiert werden oder wie sich die Genexpression nach einer Behandlung mit Wirkstoffen ändert.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet des Vestibularisschwannoms den Weg, um zu untersuchen, wie primäre humane Zellen auf verschiedene Medikamente bei lebenden Patienten reagieren, die einer Operation unterzogen wurden.