Name: In-vitro- Polymerisation von F-Aktin auf frühen Endosomen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Erfahren Sie die In-vitro-Rekonstitution von F-Aktin-Polymerisation auf frühen Endosomen. Diese mikroskopiebasierte Methode mit HeLa-Zellen ermöglicht biochemische Manipulationen zur Untersuchung von Aktin-Dynamik.

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Von der Swiss National Science Foundation unterstützt wurde; Das Schweizer Sinergia-Programm; die polnisch-schweizerischen Forschungsprogramm (PSPB-094/2010); die NFS in der chemischen Biologie; und LipidX von der Schweizer SystemsX.ch Initiative, durch den Schweizerischen Nationalfonds (, J. G.) ausgewertet. O. M. wurde durch eine EMBO langfristige Fellowship (ALTF-516-2012) unterstützt.

1. Lösungen und Vorbereitungen Hinweis: alle Puffer und Lösungen sollten bereit sein, in bidestilliertem (Dd) H 2 O. Da die Hydratation Zustand von Saccharose variiert, die Endkonzentration aller Saccharose-Lösungen muss ermittelt werden mit einem Refraktometer.
<ol><li>Prepare Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung ohne zweiwertigen kationen (PBS-): 137 mM NAKI, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4 und 6,5 mM Na 2 HPO 4. Den pH-Wert 7,4 einstellen. Sterilisieren durch Autoklavieren (1 Zyklus bei 121 ° C für 15 min) und bei Raumtemperatur lagern.</li>
	<li>300 mM Imidazol-Stammlösung vorbereiten: 0,204 g Imidazol in 10 mL DdH 2 O.Adjust der pH-Wert 7,4 bei 4 ° C mit HCl. Filter-Sterilisieren mit 0,22 μm pore Größe Filter und Lagerung bei 4 ° c</li>
	<li>Vorbereiten Homogenisierung Puffer (HB; vorbereiten ca. 100 mL): 250 mM Saccharose in 3 mM Imidazol. Anpassen des pH-Werts 7,4 bei 4 ° C mit einem pH-Meter. Filter-Sterilisieren mit einem 0,22 μm Pore Größe Filter und Lagerung bei 4 ° C. Ergänzung der HB kurz vor Gebrauch mit einem Cocktail von Protease-Inhibitoren bei Endkonzentrationen entspricht 10 mM Leupeptin, 1 mM Pepstatin A und 10 ng/mL Aprotinin.</li>
	<li>Für Schritt Floating Farbverläufe, vorbereiten, 62 %, 39 % und 35 % Saccharose-Lösungen in 3 mM Imidazol, pH 7,4, wie unten beschrieben. Genau zu bestimmen, die Endkonzentration aller Saccharose-Lösungen mit einem Refraktometer.
	<ol><li>Vorbereiten 100 mL 62 % Saccharoselösung in 3 mM Imidazol, pH 7.4. Auflösen von DdH 2 O 80,4 g Saccharose einrühren vorgewärmt, 35 ° C. Fügen Sie 1 mL 300 mM Imidazol-Stammlösung und Füllung zu 100 mL mit DdH 2 O. anpassen den pH-Wert 7,4 bei 4 ° c Filter-Sterilisieren mit 0,22 μm Pore Größe Filter und Speicher bei 4 ° c</li>
		<li>Bereiten 100 mL 35 % Saccharoselösung in 3 mM Imidazol, pH 7.4. Auflösen von 40,6 g Saccharose in DdH 2 O. Add 1 mL 300 mM Imidazol-Stammlösung rühren und füllen bis 100 mL mit DdH 2 O. anpassen den pH-Wert 7,4 4 ° C. Filter Sterilisieren mit 0,22 μm pore Größe Filter und Lagerung bei 4 ° c</li>
		<li>Bereiten 39 % Saccharose in 3 mM Imidazol, pH 7,4 50 mL. Verdünnen Sie die 62 % Saccharose-Lösung mit 35 % Saccharoselösung. Shop bei 4 ° c</li>
	</ol></li> <li>3 g Paraformaldehyd (PFA) durch Rühren in 100 mL PBS-pre-warmed bis 60 ° C unter Zugabe von 1 M NaOH tropfenweise auflösen; den endgültige pH-Wert 7,4 mit NaOH einstellen. Filter-Sterilisieren mit einem 0,22-μm-Pore-Größe-Filter und Lagerung bei-20 ° c 
	Achtung: 3 % PFA ist eine toxische Reagenzien.</li>
	<li>Bereiten Sie 1 M KCl-Stammlösung. 3,73 g KCl durch Rühren in 50 mL DdH 2 O. Filter-sterilisieren Sie einen 0,22-μm Pore Größe Filter verwenden und bei Raumtemperatur lagern.</li>
	<li>Vorbereiten 50 X konzentrierte Stammlösung mit 0,625 M Hepes bei pH 7,0 und 75 mM MgOAc 2 in DdH 2 O. Aliquot und Speicher bei-20 ° c</li>
	Eindeckmedium <li>vorbereiten. Durch Rühren 2,4 g Poly(vinyl alcohol) M w ~ 31.000 (PVA) mit 6 g Glycerin mischen. 6 mL DdH 2 O und lassen für mindestens 2 h bei Raumtemperatur. Fügen Sie 12 mL 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5) und Hitze auf etwa 53 ° C mit gelegentlichen rühren, bis die PVA aufgelöst hat.</li>
	<li>Klären die Lösung durch Zentrifugation bei 5.000 X g für 20 min bei Raumtemperatur. Erfassen den Überstand und Hinzufügen von 2,5 % (w/V) 1,4 - Diazabicyclo-[2.2.2] Oktan (DABCO) Immunofluoreszenz bei Fluoreszenz-Erkennung zu verhindern. Wirbel für ca. 30 s, aufzulösen. Aliquoten in 1,5 mL-Kunststoff-Rohre und bei-20 ° c</li>
</ol> 2. Zellkultur <ol><li>Kultur HeLa-Zellen in Dulbecco &#39; s Modified Eagle Medium ergänzt mit 10 % fetalen Kälberserum, 10 % nicht-essentiellen Aminosäuren, 10 % L-Glutamin und 1 % Penicillin-Streptomycin. Pflegen sie bei 37 ° C in einem 5 % CO 2 Inkubator.</li>
	<li>Transfect Zellen 24 h vor dem Experiment mit GFP-RAB5 10, mit kommerziellen Transfection Reagens laut Hersteller &#39; Anweisungen s.</li>
	<li>Im Bedarfsfall bereiten Endosomal Brüche und Zytosol von Zellen eines Proteins von Interesse (z.B. Verwendung von RNAi oder CRISPR/Cas9) und/oder eine Wildtyp oder mutierte Form des Proteins des Interesses überexprimierenden erschöpft.</li>
</ol> 3. Endosomal Bruchteil Vorbereitung Hinweis: dieses Protokoll beschreibt die direkte Vorbereitung der subzellularen Brüche mit Endosomen und anderen leichten Membranen. Bei Bedarf können gereinigtes Endosom Fraktionen auch gebrauchte 11 sein. Bereiten Sie 2 Petrischalen (10 cm Außendurchmesser; 57 cm 2) konfluierende Zellen GFP-RAB5 als Ausgangsmaterial zum Ausdruck zu bringen. Die Gesamtzahl der konfluierende HeLa-Zellen in 2 Petrischalen entspricht etwa 2,5 x 10 7 Zellen. Wenn nötig, die Endosomen auch zubereitet werden aus den Zellen eines Proteins von Interesse (z.B. Verwendung von RNAi oder CRISPR/Cas9) und/oder überexprimiert eine Wildtyp oder mutierte Form des Proteins des Interesses, immer Ausdruck GFP-RAB5 erschöpft.
 Vorsicht: sollten alle Schritte des Protokolls Fraktionierung auf Ice durchgeführt werden
<ol><li>Die Petrischalen auf eine nasse Metallplatte in eine flache Eiskübel und waschen Sie die Zellen zweimal mit 5 mL eiskaltem PBS-.</li>
	<li>Entfernen Sie alle PBS - aus dem letzten Waschen und 3 mL eiskaltem PBS-pro Schale. Zellen sollten nicht während der Behandlung trocken: bei Bedarf legen Sie den Eiskübel auf eine rockende Plattform, die Zellen mit Flüssigkeit ausreichend abdeckt.</li>
	<li>Mechanisch entfernen die Zellen mit PBS-Puffer aus die Petrischalen mit einem flexiblem Polizisten (d. h. hausgemachte Zelle Schaber). Kratzen Sie die Zellen aus der Gerichte zuerst in einer schnellen, kreisförmigen Bewegung um die Außenseite der Schale, gefolgt von einer Abwärtsbewegung in der Mitte der Schale. Schaben sanft zu &#34; Blätter &#34; der angeschlossenen Zellen. Sanft zu übertragen die Zellen mit einer Kunststoff Pasteurpipette mit einer weiten Öffnung, eine 15 mL konische Polypropylen Rohr auf Ice</li>
	<li>Zentrifuge für 5 min bei 175 X g und 4 ° C.</li>
	<li>Sanft entfernen den überstand (SN) und 1-3 mL HB zum Pellet. Mit einer Kunststoff Pasteurpipette mit einer weiten Öffnung sanft nach oben und unten einmal um die Zellen zu Aufschwemmen pipette.</li>
	<li>Zentrifuge für ca. 7-10 min bei 1.355 x g und 4 ° C. sanft entfernen die SN.</li>
	<li>Zelle Homogenisierung führen. 
	Hinweis: Bedingungen sollen sanft damit die Plasmamembranen der Zellen gebrochen sind, aber die Endosomen intakt bleiben.
	<ol><li>Hinzufügen eines bekannten Volumens von HB mit Protease-Inhibitoren auf jede Zelle Pellet (ca. 100 μl pro Zelle Pellet). Pipette mit einer Mikropipette 1.000 µL, sanft nach oben und unten, bis die Zellen Nukleinsäuretablette sind. Tue nicht Luftblasen einzuführen.</li>
		<li>Vorbereitung eine 1-mL Tuberkulin-Spritze mit einer 22G Nadel vorher gespült mit HB und frei von Luft oder Luftblasen.</li>
		<li>Füllen Sie die Spritze mit der Zellsuspension relativ langsam (damit keine Luftblasen), legen Sie die abgeschrägte Spitze der Nadel an der Wand des Rohres und vertreiben die Zellsuspension schnell auf die Plasmamembranen der angeschlossenen Zellen zu scheren.</li>
		<li>Nehmen Sie eine kleine aliquoten Homogenat (ca. 3 µL) und in 50 µL HB auf einen Objektträger zu verdünnen. Mischen und mit einem Glas Deckgläschen abdecken. Homogenat unter dem Phasenkontrast-Mikroskop verfügt über einen 20 X oder 40 X Objektiv zu inspizieren. 
		Hinweis: Unter optimalen Bedingungen, die meisten Zellen sind gebrochen, aber Kerne, die als dunkelgrau erscheinen und Runde Strukturen, sind nicht ( Abbildung 1).</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 3.7.3 und 3.7.4 bis die meisten Zellen sind gebrochen; in der Regel 3-6 wechselvollen Striche durch die Nadel notwendig sind. Halten Sie eine kleine aliquoten (10-30 µL) von Homogenat zur Proteinbestimmung.</li>
	</ol></li> <li>Zentrifuge Homogenat für 7 min bei 1.355 x g und 4 ° c 
	Hinweis: nach der Zentrifugierung, das Pellet (definiert als die nuklearen Pellet; NP) enthält die Kerne und der Überstand (definiert als die postnukleare überstand; PNS) enthält die Zellflüssigkeit und die Organellen auf Homogenisierung und frei schwebend veröffentlicht.</li>
	<li>Sammeln sorgfältig die PNS. Halten Sie kleine aliquoten (10-30 µL) des PNS und NP zur Proteinbestimmung und entsorgen Sie die NP.</li>
	<li>Einstellen der PNS 40,6 % Saccharose durch das Verdünnen der 62 % Saccharose-Lösung mit PNS 1:1.1 Verhältnis von PNS:62 % Saccharose. Mischen Sie sanft aber gründlich, ohne Luftblasen zu erstellen. Überprüfen Sie die Saccharose-Konzentration mit dem Refraktometer.</li>
	<li>Ort der PNS bei 40,6 % Saccharose am unteren Rand eine Ultrazentrifugation Rohr. Sorgfältig mit 2,5 mL 35 % Saccharoselösung überlagern und füllen die Zentrifugenröhrchen mit HB. 
	Hinweis: Die Saccharose-Lösungen sollten geschichtet werden, so dass Schnittstellen deutlich sichtbar sind.</li>
	<li>Ultrazentrifuge Gradienten für 1 h bei ̴165, 000 X g und 4 ° c</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die weiße Schicht von Lipiden auf den Farbverlauf. Sammeln Sie als nächstes die Schnittstelle mit Endosomen zwischen HB und 35 % Saccharose, mit einer 200 μL Mikropipette mit Cut Spitze. 
	Hinweis: Die Endosomal Brüche können direkt in die in-vitro- Actin Polymerisierung Assay verwendet werden oder kann regelmÄÑig auf dem Eis, Blitz in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 gelagert ° C.</li>
	<li>Bestimmen die Proteinkonzentration der PNS und Endosomal Brüche. 
	Hinweis: Diese Konzentration sollte mindestens 100 µg/mL. Ca. 2,5 x 10 7 Zellen in 2 Petrischalen gewachsen sind notwendig, um ein PNS mit mindestens 100 µg/mL zu erhalten (siehe Hinweis oben).</li>
</ol> 4. Zytosol Vorbereitung Hinweis: bereiten Sie 2 Petrischalen (10 cm Durchmesser; 57 cm 2) konfluierende HeLa-Zellen als Ausgangsmaterial. Bei Bedarf kann die Zellflüssigkeit auch aus Zellen eines Proteins von Interesse (z.B. Verwendung von RNAi oder CRISPR/Cas9) und/oder überexprimiert ein Wildtyp oder die mutierte Form des Proteins des Interesses erschöpft vorbereitet werden. Für das Endosom Fraktionierung Protokoll sollten alle Schritte durchgeführt werden, auf Ice
<ol><li>Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.8.</li>
	<li>Legen Sie die PNS in ein Zentrifugenröhrchen und Ultrazentrifugen für 45 min bei ̴250, 000 X g und 4 ° c</li>
	<li>Sorgfältig entfernen Sie die weiße Schicht an der Spitze und die SN (Zytosol Bruch) zu sammeln, ohne störende Microsome Pellet. Halten Sie ein Aliquot der Zellflüssigkeit Fraktion zur Proteinbestimmung. 
	Hinweis: Die Zellflüssigkeit kann direkt in die in-vitro- Actin Polymerisierung Assay verwendet werden oder kann regelmÄÑig auf dem Eis, Blitz in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 gelagert ° C.</li>
	<li>Bestimmen die Konzentration des Proteins von dem Zytosol. 
	Hinweis: Es sollte mindestens 3 mg/mL.</li>
</ol> 5. Measuring Endosom-abhängige Aktin-Polymerisation In Vitro Assay Hinweis: Endosom-abhängige Aktin-Polymerisation kann mit zwei alternative Vorgehensweisen durchgeführt werden. Bei dem ersten Ansatz werden die Materialien gemischt in einem Reagenzglas, fixiert, und auf einem Deckgläschen übertragen und analysiert. Im zweiten Ansatz, der hier beschrieben wird kann der Test direkt in der bildgebenden Kammer durchgeführt werden und können behoben und analysiert werden ohne mechanische Störung ( Abbildung 2). In diesem zweiten Ansatz die Assay-Mischung ist nicht aus einem Reagenzglas auf einem Deckgläschen übertragen und somit bleibt unbeirrt, verringert die Gefahr von F-Aktin-Netzwerken wird physisch während der Übertragung gestört. Darüber hinaus ist der zweite Ansatz kompatibel mit einer Zeitraffer-Analyse der F-Aktin-Polymerisation. Es sei darauf hingewiesen, dass kein Unterschied in der Analyse von F-Aktin-Polymerisation mit beiden Ansätzen beobachtet wurde. 
Hinweis: Verwendung schneiden Tipps im gesamten Protokoll.
<ol><li>In einem Reagenzglas <ol><li>sanft Mischung eiskalte gereinigten GFP-RAB5 Endosomen (Schritt 3) mit Zytosol (Schritt 4) in einem Verhältnis von 01:10 (Proteinkonzentration) in eine eiskalte 1,5 mL konische Röhrchen. 
		Hinweis: Ein typisches Experiment erfolgt mit ca. 40-50 µL.</li>
		<li>Stellen Sie das eiskalte Reaktionsgemisch zu Endkonzentrationen von 125 mM KCl (mit 1 M KCl Vorratslösung), 12,5 mM Hepes und 1,5 mM MgOAc 2 (mit den 50 x Stammlösung). Passen Sie dann die Mischung mit Protease-Inhibitoren, Endkonzentrationen von 10 mM Leupeptin, 1 mM Pepstatin A und 10 ng/mL Aprotinin. Vorsichtig mischen aller Komponenten.</li>
		<li>Legen Sie das Reagenzglas mit der Reaktionsmischung bei 37 ° C, ohne Zittern, und die gewünschte Zeit inkubieren. 
		Hinweis: In der Regel dauert es ca. 3 min, Aktin-Polymerisation Endosomen und 30 min für die Bildung eines umfassenden Netzwerks erkennen.</li>
		<li>Zum gewünschten Zeitpunkt (z.B. 3 min oder 30 min), die Reaktion zu stoppen, indem man das Reagenzglas auf Eis und fügen Sie 1/10 (Vol:vol) der vorgekühlte 3 % PFA Lösung.</li>
		<li>0.3:10 (Vol:vol) von 200 Einheiten/mL (~6.6 μM) Phalloidin konjugiert, rot-Orange Färbung der polymerisierte Actin Fleck hinzufügen.</li>
		<li>Ort 12 μL der Mischung auf 12 μL PVA Eindeckmedium auf einem Mikro Objektträger. Setzen Sie ein 18 x 18 mm 2 Coverslipon Glasplatte.</li>
		<li>Analyse die Probe mit der konfokalen Mikroskopie.</li>
	</ol></li> <li>In der bildgebenden Kammer <ol><li>um mikroskopische Bildgebung Kammern, verwenden Plasma Reiniger für 1 min zu einem Deckgläschen rund 18 mm Durchmesser und rund 35 mm Durchmesser Petrischale, ausgestattet mit einem 20 mm Glasboden reinigen (0,16 0,19 mm).</li>
		<li>Inkubieren Sie die gereinigten Oberflächen mit 1 % β-Casein für 20 min, Proteinbindung, das Glas zu minimieren. Waschen zweimal mit 3 mM Imidazol.</li>
		<li>Add Endosom und Zytosol, in der gleichen Mischung wie in den Schritten 5.1.1 und 5.1.2, in eine vorgekühlte 1,5 mL Teströhrchen assay und ergänzen die Assay-Mischung mit 0,1 μg/μL Rhodamin-Aktin.</li>
		<li>Einstellen der endgültigen Brechungsindex des Gemisches auf 1,375 (26,5 % Saccharose) mit 39 % Saccharoselösung. 
		Hinweis: In der Regel wird das gleiche Volumen hinzugefügt; Dies muss jedoch werden empirisch nachjustiert, abhängig von der Saccharose-Konzentration von der gesammelten Bruch, anhand einer Refractometer, da die Saccharose-Konzentration von Experiment zu Experiment leicht ändern kann.</li>
		<li>Legen Sie die Mischung auf die vorbehandelte 35-mm-Schale (Schritt 5.2.1) und bedecken Sie es mit der vorbehandelten 18 mm Deckglas (Schritt 5.2.1).</li>
		<li>Legen Sie die Kammer bei 37 ° C ohne schütteln.</li>
		<li>Analyse der Probe mittels konfokale Fluoreszenzmikroskopie.</li>
	</ol></li></ol> 6. Bild-AcFassung und Analyse von Aktin Netzwerk <ol><li>Bildaufnahme <ol><li>erwerben die Bilder auf einem inversen Scan confocal Mikroskop. 
		Hinweis: Erwerb Bildeinstellungen wurden für eine invertierte Scan confocal Mikroskop mit einem 63 X 1,25 NA Öl Ziel optimiert. Passen Sie die Leistung des Lasers (in der Regel ca. 50 %), ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen.</li>
	</ol></li> <li>Quantifizierung des Aktin-Netzwerks <ol><li>fluoreszierenden Mikrographen zu analysieren. Die Opensource-Software CellProfiler (v2.1.1) 12 verwenden, um die Menge an Aktin pro Endosom messen (alternative Software kann verwendet werden).
		<ol><li>Ermitteln Sie zuerst Endosomen als das primäre Objekt mit der GFP-RAB5-Signal. Dann die F-Aktin verbunden mit individuellen Endosomen mit der Ausbreitung der Aktin-Signals zu quantifizieren (rot-Orange Farbstoff konjugiert Phalloidin) als sekundäre Objekt.</li>
			<li>Durchschnittliche und normalisieren die Nummer des zugehörigen Materials für jedes Objekt in der Kontrollbedingung.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Aktin spielt eine entscheidende Rolle im Endosom Membran Dynamik4,14. Wir berichteten bereits, dass Aktin Nukleation und Polymerisation auf frühen Endosomen auftreten bilden kleine F-Aktin Patches oder Netzwerke. Diese F-Aktin-Netzwerke sind absolut erforderlich für Membrantransport über frühen Endosomen den Abbau Weg. Eingriffe bei jedem Schritt dieses Prozesses Keimbildung und Polymerisation verhindert Endosom Reifung und somit nachgelagerten Transport zur spät...

In höheren Eukaryoten Zellen sind Proteine und Lipide in frühen Endosomen verinnerlicht wo sortieren auftritt. Einige Proteine und Lipide, die dazu bestimmt sind, bespielt werden, werden in röhrenförmigen Regionen von den frühen Endosomen aufgenommen und dann transportiert die Plasmamembran oder die Trans-Golgi-Netzwerk (TGN)1,2. Im Gegensatz dazu sind andere Proteine und Lipide selektiv in Regionen von den frühen Endosomen verpackt, die ein multivesicular Erscheinungsbild aufweisen. Diese Regionen zu erweitern und nach Loslösung von frühen Endosomal Membranen, schließlich Reifen in freien Endosomal Träger Vesikel oder multivesicular Einrichtungen (ECV/MVBs), die verantwortlich sind für die Güterbeförderung in Richtung späten Endosomen1, 2.
Aktin spielt eine entscheidende Rolle in dem Umbau Membranverfahren Endosomal Sortierkapazität und Endosom Biogenese zugeordnet. Protein sortieren auf den recycling Bahnen um die Plasmamembran oder die TGN richtet sich nach der komplexen Retromer und die damit verbundenen Proteine. Diese Sortierung Maschinen scheint die Bildung von recycling Tubuli über Wechselwirkungen von komplexen, Retromer mit der Wespe und Narbe homolog (WASH) komplexen und verzweigten Aktin3,4,5 gekoppelt werden . Im Gegensatz dazu Moleküle bestimmt für Abbau, besonders Signalisierung Rezeptoren aktiviert, die Endosomal Sortierung komplexe erforderlich für Transport (ESCRT)2,6in Intraluminal Vesikel (ILVs) sortiert sind, 7. Während die mögliche Rolle von Actin in der ESCRT-abhängige Sortiervorgang nicht bekannt ist, spielt F-Aktin eine wichtige Rolle in der Biogenese der ECV/MVBs und Transport über frühen Endosomen. Vor allem fanden wir, dass annexin A2 bindet Cholesterin angereicherte Regionen der frühen Endosom und zusammen mit spire1, nucleates F-Aktin-Polymerisation. Die Bildung der verzweigten Aktin-Netzwerks auf Endosomen beobachtet erfordert die verzweigte Aktivität des Proteins Aktin-bezogene (ARP) 2/3 Komplex, sowie der ERM-Protein-Moesin und die Aktin-bindende Protein Cortactin8,9.
Hier beschreiben wir einen Mikroskopie-basierte in-vitro- Assay, der Keimbildung und Polymerisation von F-Aktin auf frühen Endosomal Membranen in den Reagenzgläsern wiederherstellt. Dieser Test hat früher zu untersuchen, die Rolle von annexin A2 in F-Aktin Nukleation und Moesin und Cortactin bei der Bildung der Endosomal Aktin Netze8,9. Mit diesem Protokoll in Vitro werden die komplexen Abfolge von Reaktionen auf Endosomen während Aktin-Polymerisation der biochemischen und molekularen Analyse der sequentielle Schritte des Prozesses, einschließlich Aktin Nukleation, lineare zugänglicher Polymerisation, Verzweigung und Vernetzung.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Acros Organics</td><td>196770010</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>AppliChem</td><td>A1042</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Acros Organics</td><td>424370025</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiunacetat-Tetrahydrat</td><td>Fluka</td><td>63047</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A2948</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10125</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fluka</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Merck Millipore</td><td>107687</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Roche</td><td>11017101001</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Roche</td><td>10253286001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Roche</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehide</td><td>Polysciences. Inc</td><td>380</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Phalloidin</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Aktin Rhodamin</td><td>Zytoskelett. Inc</td><td>APHR-A</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>Poly(vinylalkohol), Mw ~31 000</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2522</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Casein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>Filter 0,22 &mu; m</td><td>Millex</td><td>SL6V033RS</td><td></td></tr><tr><td>Runde 10 cm Schalen für die Zellkultur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoff-Pasteurpipette</td><td>Assistent</td><td>569/3 40569003</td><td></td></tr><tr><td>15-mL Polypropylen-Röhrchen</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Injektionsnadel 22G Schwarz 30mm</td><td>BD Microlance</td><td>300900</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Luer-Slip 1mL Spritzen ohne Nadel</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Mikroglas-Objektträger</td><td>Assistent</td><td>2406</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18 mm Glasdeckglas</td><td>Assistent</td><td>1000/1818</td><td></td></tr><tr><td>SW60 Zentrifugenröhrchen</td><td>Beckman-Schar</td><td>344062</td><td></td></tr><tr><td>TLS-55 Zentrifugenröhrchen</td><td>Beckman-Schar</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>200-&mu; L gelbe Spitze</td><td>Starlab</td><td>S1111-0706</td><td></td></tr><tr><td>1.000-&mu; L Blue Graduierte Spitze</td><td>Starlab</td><td>S1111-6801</td><td></td></tr><tr><td>1,5-ml-Reagenzglas</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C 311-04-051</td><td></td></tr><tr><td>Rundes Deckglas mit 18 mm Durchmesser</td><td>Assistent</td><td>1001/18</td><td></td></tr><tr><td>Runde Schale mit 35 mm Durchmesser und 20 mm Glasboden (0,16 - 0,19 mm)</td><td>In vitro Scientific</td><td>D35-20-1,5-N</td><td></td></tr><tr><td>Refraktometer</td><td>Carl Zeiss</td><td>79729</td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX80 Ultrazentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46900</td><td></td></tr><tr><td>Tisch-Ultrazentrifuge</td><td>Beckman-Schar</td><td>TL-100</td><td></td></tr><tr><td>SW60 Rotor</td><td>Beckman-Schar</td><td>335649</td><td></td></tr><tr><td>TLS-55</td><td>Rotor Beckman-Schar</td><td>346936</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskopie</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM-780</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD Transfektionsreagenz</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Proteinassay-Reagenz A</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0113</td><td></td></tr><tr><td>Proteinassay-Reagenz B</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0114</td><td></td></tr><tr><td>Proteinassay-Reagenz S</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0115</td><td></td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>Hausgemacht</td><td></td><td>Silikonkautschukstück von ca. 2 cm, in einem sehr spitzen Winkel geschnitten und an einer Metallstange befestigt oder mit einer Pinzette gehalten</td></tr><tr><td>Refraktometer</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0643</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pH-Messgerät 691</td><td>Metrohm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td></td><td></td><td>NIH, Bethesda MD</td></tr></tbody></table>

in-vitro- polymerisation von f-aktin auf frühen endosomen

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Viele frühen Endosom Funktionen, insbesondere Ladung Eiweiß Sortier- und Membran Verformung, kurz F-Aktin-Filamente kernhaltige auf Endosomal Membrane Flecken hängen. Wir haben festgestellt, einen Mikroskopie-basierte in-vitro- Assay, der Keimbildung und Polymerisation von F-Aktin auf frühen Endosomal Membranen in den Reagenzgläsern, wiederherstellt, wodurch dieser komplexen Abfolge von Reaktionen zu genetischen und biochemischen Manipulationen. Endosomal Fraktionen werden von float in Saccharose Steigungen aus Zellen, die mit dem Ausdruck der frühen Endosomal Protein GFP-RAB5 vorbereitet. Cytosolischen Brüche bereiten wir aus separaten Chargen von Zellen. Endosomal und cytosolischen Brüche können gespeichert werden in flüssigem Stickstoff eingefroren bei Bedarf. In dem Assay Endosomal und cytosolischen Brüche werden gemischt und die Mischung wird bei 37 ° C unter geeigneten Bedingungen (z. B. Ionenstärke, Verringerung der Umwelt) inkubiert. Zum gewünschten Zeitpunkt die Reaktionsmischung ist fest und die F-Aktin erschließt sich mit Phalloidin. Aktin Nukleation und Polymerisation werden dann durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Hier berichten wir, dass dieser Test verwendet werden, um die Rolle der Faktoren zu untersuchen, die entweder in Aktin Nukleation auf der Membran oder im nachfolgenden Dehnung, Verzweigungen oder Vernetzung von F-Aktin-Filamente beteiligt sind.

Um Einblicke in die Entstehung von F-Aktin-Patches auf frühen Endosom Membranen, folgten wir das Protokoll gemäß Abbildung 2. Kurz, Zellen wurden mit GFP-RAB5 transfiziert und dann frühen Endosomen von subzellulären Fraktionierung vorbereitet wurden. Diese gereinigten frühen Endosomen wurden mit Zytosol inkubiert, um Aktin sowie andere Faktoren, die möglicherweise in der Reaktion zur Verfügung zu stellen. Am Ende der Inkubationszeit war die Reaktion durch Fix...

Frühen Endosom Funktionen hängen F-Aktin-Polymerisation. Hier beschreiben wir einen Mikroskopie-basierte in-vitro- Assay, der Keimbildung und Polymerisation von F-Aktin auf frühen Endosomal Membranen in den Reagenzgläsern, wiederherstellt wodurch dieser komplexen Abfolge von Reaktionen zu biochemischen und genetischen Manipulationen.

In-vitro- Polymerisation von F-Aktin auf frühen Endosomen

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Das übergeordnete Ziel dieses auf Mikroskopie basierenden In-vitro-Assays besteht darin, die Aktinpolymerisation an Endosomen in vitro zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des Membrantransports und der Aktinbiologie zu beantworten, beispielsweise die Rolle von Aktin im sauren Transportweg. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, die Nukleationspolymerisation von F-Aktin an frühen endosomalen Membranen im Reagenzglas neu zu rekonstituieren.Dadurch wird diese komplexe Reaktionsreihe für meine chemischen Manipulationen zugänglich. Die Demonstration des Verfahrens erfolgt durch Jorge Larios und Olivia Muriel aus dem Labor. Beginnen Sie damit, Schalen mit Hela-Zellen auf eine feuchte Metallplatte in einem flachen Eisbehälter zu stellen.Und die Zellen zweimal mit je fünf Millilitern eiskalter PBS waschen. Nach dem Entfernen der PBS aus der letzten Waschung drei Milliliter eiskalte PBS pro Platte hinzufügen. Anschließend mit einem flexiblen Gummispachtel die Zellen durch schnelle kreisförmige Bewegungen entlang des Randes der Platte ablösen.Anschließend eine abwärts gerichtete Bewegung in der Mitte der Petrischale ausführen. Vorsichtig abkratzen, um Zellbeläge zu erhalten. Danach die Zellen mit einer Plastik-Pasteurpipette mit weiter Öffnung vorsichtig in 15-Milliliter-Kegelrohre aus Polypropylen auf Eis überführen.Zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 175 × g und 4 °C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und geben Sie ein bis drei Milliliter Homogenisierungspuffer zu den Pellets hinzu. Lösen Sie die Zellen unter Verwendung einer Plastik-Pasteurpipette mit großer Öffnung vorsichtig durch einmaliges Auf- und Abpipettieren wieder auf. Anschließend sieben bis zehn Minuten bei 1.355 × g und 4 °C zentrifugieren. Nach dem Entfernen des Überstandes ein bekanntes Volumen Puffer zur Homogenisierung mit Proteaseinhibitoren zu jedem Zellpellet hinzufügen und vorsichtig auf- und abpipettieren, ohne Luftblasen einzuschließen, bis die Zellen resuspendiert sind.Spülen Sie eine Ein-Milliliter-Tuberkulinspritze mit Homogenisierungspuffer aus und stellen Sie sicher, dass sie frei von Luft oder Blasen ist. Füllen Sie die Spritze anschließend langsam mit der Zellsuspension, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Halten Sie die Schrägkante der Nadel gegen die Wand des Röhrchens und spritzen Sie die Zellsuspension schnell aus, um die Plasmamembranen der anhaftenden Zellen abzuscheren.Danach eine kleine Aliquot aus jedem Homogenat entnehmen, in 50 Mikroliter Homogenisierungspuffer auf einem Objektträger verdünnen und mischen. Anschließend mit einem Deckglas bedecken, die Homogenate unter einem Phasenkontrastmikroskop mit einer 20- oder 40-fachen Objektivvergrößerung untersuchen. Unter optimalen Bedingungen sind die meisten Zellen aufgebrochen, aber die Kerne, die dunkelgrau erscheinen, sind rund und intakt.Wiederholen Sie den Schritt der Zellzerreißung, bis die meisten Zellen zerbrochen sind; normalerweise sind drei bis sechs Auf-und-ab-Bewegungen durch die Nadel erforderlich. Heben Sie eine kleine Portion jedes Homogenats zur Proteinbestimmung auf. Nach der Zentrifugation wie zuvor sammeln Sie vorsichtig das postnukleäre Überstand. Heben Sie kleine Aliquote jedes postnukleären Überstandes und jedes nukleären Pellets für die Proteinbestimmung auf und entsorgen Sie anschließend die nukleären Pellets. Stellen Sie die postnukleären Überstände auf 40,6 Prozent Saccharose ein, indem Sie den postnukleären Überstand mit einer 62-Prozent-Saccharoselösung im Verhältnis 1 zu 1,1 mischen. Mischen Sie vorsichtig, aber gründlich, ohne Luftblasen zu erzeugen.Überführen Sie die postnukleären Überstände in 40,6-prozentiger Saccharose in Ultrazentrifugenröhrchen. Überlagern Sie vorsichtig mit 2,5 Milliliter 35-prozentiger Saccharoselösung und füllen Sie das Zentrifugenröhrchen mit Homogenisierungspuffer. Führen Sie die Ultrazentrifugation der Gradienten für eine Stunde bei etwa 165.000 × g und 4 Grad Celsius durch.Nach der Ultrazentrifugation vorsichtig die weiße Lipidschicht auf der Oberseite der Gradienten entfernen. Anschließend mit einer 200-Mikroliter-Mikropipette mit abgeschnittenem Pipettenspitze die Schnittstelle sammeln, die sich zwischen dem Homogenisierungspuffer und 35 Prozent Saccharose befindet und die Endosomen enthält. Um das Cytosol zu gewinnen, das postnukleäre Supernatant mit einer Pipette in ein Ultrazentrifugenröhrchen überführen.Und Ultrazentrifugation für 45 Minuten bei etwa 250.000 × g und vier Grad Celsius. Danach vorsichtig die weiße Schicht an der Oberseite entfernen und das Überstandsfraction, die cytosolische Fraktion, sammeln, ohne das Mikrosomen-Pellet zu stören. Beginnen Sie den Assay, indem Sie kalte, gereinigte GFP-umhüllte Endosomen vorsichtig mit Cytosol im Verhältnis von 1 zu 10 bezüglich der Protein-Konzentration in einem eiskalten konischen Reaktionsgefäß mit 1,5 mL mischen.Anschließend die Reaktionsmischung mit Kaliumchlorid-Stammlösung auf endgültige Konzentrationen von 125 Millimolar Kaliumchlorid, 12,5 Millimolar HEPES und 1,5 Millimolar Magnesiumacetat einstellen. Danach die Mischung mit Proteaseinhibitoren auf endgültige Konzentrationen von 10 Millimolar Leupeptin, 1 Millimolar Pepstatin A und 10 Nanogramm pro Milliliter Aprotinin anpassen.Stellen Sie das Reagenzglas mit der Reaktionsmischung bei 37 Grad Celsius ohne Schütteln und inkubieren Sie es für die gewünschte Zeit. Beenden Sie die Reaktion nach der Inkubationszeit, indem Sie das Reagenzglas auf Eis stellen und eine vorab gekühlte 3-prozentige PFA-Lösung im volumetrischen Verhältnis von 1 zu 10 hinzufügen. Geben Sie 200 Mikrogramm pro Milliliter Phalloidin, das mit einem rot-orangen Farbstoff konjugiert ist, im volumetrischen Verhältnis von 0,3 zu 10 hinzu, um das polymerisierte Aktin anzufärben.Pipettieren Sie 12 Mikroliter der Mischung auf 12 Mikroliter PVA-Einbettmedium auf einem mikroskopischen Glasobjektträger. Legen Sie einen 18 mal 18 Millimeter großen Glasdeckel darauf. Analysieren Sie anschließend die Probe mittels fluoreszenzbasierter konfokaler Mikroskopie.Beginnen Sie damit, die saubere Oberfläche mikroskopischer Bildgebungskammern für 20 Minuten auf Eis mit einprozentigem Beta-Casen zu inkubieren, um die Proteinanbindung an das Glas zu minimieren. Nach der Inkubation waschen Sie zweimal mit drei Millimolar Imidazol. Geben Sie das Rhodamin-Aktin in ein vorab gekühltes 1,5-Milliliter-Reaktionsgefäß, das die Endosomen- und Cytosol-Mischung für den Assay enthält, wie zuvor gezeigt. Stellen Sie den endgültigen Brechungsindex der Mischung durch Zugabe einer 39-prozentigen Saccharoselösung auf eine Endkonzentration von 26,5 Prozent auf 1,375 ein. Geben Sie die Mischung auf die vorbehandelte 35-Millimeter-Schale und bedecken Sie sie mit der vorbehandelten 18-Millimeter-Deckglas. Stellen Sie die Kammer wie zuvor für drei oder dreißig Minuten auf 37 Grad Celsius.Anschließend mittels fluoreszenzkonfokaler Mikroskopie analysieren und das Aktin-Netzwerk gemäß den Empfehlungen im schriftlichen Protokoll quantifizieren. Die folgenden Bilder zeigen frühe Endosomen, die aus Zellen gereinigt wurden, die GFP-RAB5 exprimieren und mit Cytosol als Aktinquelle inkubiert wurden. Die Ansatzmischung wurde fixiert, entnommen und auf einen mikroskopischen Objektträger gegeben, wobei f-Aktin mit Phalloidin, das an einen roten Fluorophor gekoppelt ist, sichtbar gemacht wurde.Der Aktin-Nukleations- und Polymerisationsprozess war schnell, da F-Aktin bereits nach einer Minute auf einigen Endosomen nachweisbar war. Diese kurzen Aktinstrukturen wuchsen innerhalb von 30 Minuten rasch in der Länge und wurden miteinander verknüpft und verzweigt, wodurch sich schließlich ein filamentöses Netzwerk bildete. Dies spiegelt vermutlich unausgeglichene Aktindynamik in vitro wider.Diese Bilder wurden aufgenommen, während der Assay mit gereinigtem, mit Rhodamin markiertem Aktin zusätzlich zum zellulären Zytoplasma in Glasbodenkammern durchgeführt wurde. Auf diese Weise konnten Strukturen direkt ohne jegliche Störung abgebildet werden. Wie hier zu sehen ist, wurden ähnliche Nukleations- und Polymerisationsraten beobachtet.In dem hier beschriebenen Assay initiieren frühe Endosomen selektiv die de novo-Aktinpolymerisierung. Da keine Aktinpolymerisierung nachweisbar ist, wenn entweder das Endosom oder das Cytosol fehlt, zeigen diese Beobachtungen, dass frühe Endosomen die intrinsische und spezifische Fähigkeit besitzen, die Aktinnukleation und -polymerisierung auszulösen.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass in vivo Bedingungen mit relativ geringer RAP5-Expression bevorzugt werden. Außerdem sind zelluläre Membranen relativ empfindlich und anfällig für biochemische oder chemische Schocks. Ebenso ist das Aktin-Netzwerk aus in-vitro-Experimenten äußerst empfindlich und sollte vorsichtig behandelt werden, um einen Kollaps oder Bruch zu vermeiden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Nukleationspolymerisation von F-Aktin an frühen endosomalen Membranen im Reagenzglas rekonstituiert. Mit dieser Technik werden Sie in der Lage sein, die Welt der Faktoren zu untersuchen, die entweder an der Aktin-Nukleation an der Membran oder an der anschließenden Verlängerung, Verzweigung oder Vernetzung von F-Aktin-Filamenten beteiligt sind.

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Research

Forschung

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Biochemistry

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