Name: Leben-Zelle Messung der Geruchsstoff Rezeptor Aktivierung mit einem Echtzeit-cAMP-Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Lernen Sie die Echtzeit-cAMP-Assay-Methode zur Messung von Geruchsstoff-Rezeptor-Aktivierung in lebenden Zellen. Diese Technik ermöglicht effizientes Screening von Rezeptor-Ligand-Paaren.

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Die Arbeit wurde von der chinesischen National Science Foundation (31070972), Wissenschaft und Technologie Kommission der Shanghai Municipality (16ZR1418300), das Programm für Innovative Forschung Team des Shanghai Municipal Education Commission, Shanghai östlichen unterstützt. Scholar Program (J50201) und das nationale Grundlagenforschung Programm von China (2012CB910401).

1. Culturing und Wartung von Hana3A Zellen <ol><li>pflegen Zellen in 10 mL minimale wesentliche Medium (MEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 100 µg/mL Penicillin-Streptomycin und 1,25 µg/mL Amphotericin B in einem 100-mm Zelle Kulturschale in einem 37 ° C Zelle Kultur Inkubator mit 5 % CO 2. Mit jeder anderen Passage hinzufügen 1 µg/mL Puromycin Aufrechterhaltung beständigen Transfection Plasmide (siehe Einleitung). 
	Hinweis: Führen Sie alle Schritte mit Zellkultur in einer Klasse II biologischen Sicherheitsschrank, steriles Umfeld zu gewährleisten.</li>
	<li>Subkultur in einem Verhältnis von 10-20 % in 100 mm Gerichte alle 2-3 Tage.</li>
</ol> 2. Galvanischen Zellen zur Transfektion <ol><li>beobachten die Hana3A Zellen unter dem Phasenkontrast-Mikroskop Zellviabilität sicherzustellen und Zusammenfluss schätzen.</li>
	<li>Aspirieren Sie alle Mittel aus der Zelle Kulturschale.</li>
	<li>Zellen durch Hinzufügen von 10 mL von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf den Teller, wirbeln die Schüssel und Absaugen der PBS waschen.</li>
	<li>Add 3 mL 0,05 % Trypsin-Ethylen Diamin Tetraacetic Säure (EDTA) auf den Teller. Mischung für 1 Minute oder bis alle Zellen flott sind. 
	Hinweis: Beachten Sie den Fortschritt der Zellen von der Unterseite der Platte unter dem Mikroskop nach Bedarf abnehmen.</li>
	<li>Inaktivierung Trypsin durch Zugabe von 5 mL MEM mit 10 % FBS und Pipette rauf und runter zu brechen, Brocken von Handy-Messe 
	Hinweis: Für die Beschichtung vor Transfektion, sollte das verwendete Medium nicht Antibiotika enthalten. Zugabe von Antibiotika kann die Transfektion Effizienz verringern.</li>
	<li>Übertragung eine entsprechende Menge an Zellen zu einem 15-mLl-Schlauch abhängig von der Anzahl der Platten zu transfiziert werden. Für jede 96-Well-Platte, Platte 2 x 10 6 Zellen oder ca. 1/5 der 100 % konfluierende 100 mm Platte geben eine Zellzahl von 2 x 10 4 Zellen pro Brunnen oder eine Dichte von ca. 15-30 % Zusammenfluss pro Bohrloch. Röhren bei 200 X g für 5 min Zentrifugieren und aspirieren den Überstand ohne zu stören die Zelle Pellet. 
	Hinweis: Berechnen Sie die richtige Menge an Zellen auf 96-Well-Platten zu vermeiden, Verwilderung oder undergrowing Zellen vor Stimulation vernickelt werden.</li>
	<li>Hinzufügen eine entsprechende Menge an MEM mit 10 % FBS in der 15 mL tube und pipette rauf und runter zu brechen, Brocken der Zelle Masse. Für jede 96-Well-Platte Aufschwemmen der Zellen mit 6 mL MEM mit 10 % FBS. 
	Hinweis: Achten Sie darauf, Luftblasen in das Rohr zu erzeugen.</li>
	<li>Die suspendierten Zellen hinzufügen in einen Stausee. Mit einer Mehrkanal-Pipette, pipette 50 µL Zellen auf jedem Bohrloch einer 96-Well-Platte. Inkubation über Nacht bei 37 ° C mit 5 % CO 2.</li>
</ol> 3. Transfektion von Plasmiden <ol><li>vor Transfektion, beobachten die vergoldeten Zellen gewährleisten einen ordnungsgemäße Zusammenfluss von ca. 30-50 % pro Bohrloch unter dem Phasenkontrast-Mikroskop und zurück in den Inkubator.</li>
	<li>Vorbereitung im Vorfeld der Rho-Tags OR Konstrukt 11 , 21 , 22 , 28, baut der Zubehör-Faktor (RTP1S 22 , 36 und M3R 23), und die Biosensor-Variante 29 , 30 von Miniprep konstruieren. Die DNA-Konzentration von einem Spektrophotometer zu quantifizieren und Plasmid-DNA-Konzentrationen (z.B. zu 100 ng/µL) mit destilliertem Wasser nach Bedarf anpassen.</li>
	<li>Vorbereitung der Transfektion Mischungen <ol><li>bereiten eine Plasmid Transfektion Mischung in 500 µL MEM für jede 96-Well-Platte gemäß Tabelle 1. 
		Hinweis: Wenn verschiedene Regionen in äußerster Randlage auf der gleichen 96-Well-Platte getestet werden, das Volumen der Transfektion Mischung und die Höhe der Plasmid DNA hinzugefügt muss angepasst werden in Abhängigkeit von Anzahl der transfizierten Bohrungen mit einem bestimmten OR.</li>
		<li>Vorbereiten einer Transfektion Mischung in einem Rohr mit 18 µL der Lipid-vermittelte Transfektion Reagenz in 500 µL MEM.</li>
	</ol></li> <li>Mischen die Plasmid-Mischung mit der Transfektion Mischung von Pipettieren rauf und runter. Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min.</li>
	<li>Die Reaktion zu stoppen, durch Zugabe von 5 mL MEM mit 10 % FBS.</li>
	<li>Erstreckt sich eine dicke Schicht von sterilen Papiertüchern in der Zelle-Kultur-Haube. Nehmen Sie eine 96-Well-Platte mit Zellen aus dem Inkubator. Sanft und immer wieder die Platte umgedreht auf den Haufen von Papiertuch antippen, so dass das Medium vom Küchenpapier vollständig absorbiert wird. 
	Hinweis: Mit Nachdruck oder abrupt Tippen Sie nicht die Platte wie man Zellen verlieren könnte.</li>
	<li>50 µL der kombinierten Transfektion Mischung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte zu übertragen und über Nacht inkubieren 18-24 h bei 37 ° C mit 5 % CO 2. 
	Hinweis: Ein Mal geschafft Transfektion und Stimulation Zeitplan sollte die Messung vorausgehen, wenn mehr als eine 96-Well-Platte werden in einem einzigen Experiment getestet, um alle Platten nach Transfektion gleichzeitig und Belichtungszeit Reiz gemessen haben.</li>
</ol> 4. Stimulation und Messung oder Aktivität unter Verwendung der Real-Time-cAMP-Test <ol><li>beobachten die transfizierten Zellen unter dem Phasenkontrast-Mikroskop zu gewährleisten einen ordnungsgemäße Zusammenfluss von 50-80 % pro Bohrloch und zurück in den Inkubator.</li>
	<li>Bereiten die Stimulation Medium durch Zugabe von 10 mM Hydroxyethyl Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES) und 5 mM Glukose zu Hank &#39; s ausgewogen Salz Lösung (HBSS).</li>
	<li>Tauen die Echtzeit-cAMP Assay Substrat Reagenz Aliquote auf Eis. Substrat-Reagenz bei-80 ° C bei 55 µL pro Röhre in PCR Röhren aufbewahren. 1 Tube pro Platte verwenden.</li>
	<li>Bereiten Sie 2 % Gleichgewichtherstellung Lösung durch Mischen von 55 µL des Reagenz Substrat und 2750 µL HBSS/HEPES/Glukoselösung.</li>
	<li>Erstreckt sich eine dicke Schicht von Papierhandtüchern auf der Bank. Sanft und immer wieder die Platte umgedreht auf das Papiertuch antippen, so dass die Transfektion Medium vom Küchenpapier vollständig absorbiert wird.</li>
	<li>Waschen die Zellen von 50 µL HBSS/HEPES/Glukoselösung in jede Vertiefung pipettieren.</li>
	<li>Sanft und immer wieder zu erschließen, die HBSS/HEPES/Glukose-Lösung aus der 96-Well-Platte.</li>
	<li>Pipette 25 µL 2 % Gleichgewichtherstellung Lösung zu jedem gut und Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln für 2 h.</li>
	<li>Vorbereitung im Vorfeld 1 M Geruchsstoff Stammlösungen in DMSO und Store bei-20 ° C bis verwendet.</li>
	<li>Vor dem Ende der Inkubationszeit Verdünnen der Geruchsstoff Stammlösungen arbeiten Konzentrationen in HBSS/HEPES/Glucose Stimulation Medium. 
	Hinweis: Die Konzentrationen von der Geruchsstoff Verdünnungen in diesem Schritt vorbereitet sollte verdoppelt, um die korrekte Endkonzentrationen in jede Vertiefung ergeben.</li>
	<li>Mit einem Chemilumineszenz Platte Leser und vor Zugabe der Geruchsstoff, messen die basalen Lumineszenz der Platte 2 Mal hintereinander mit einer Rate von 1000 ms pro gut 34.</li>
	<li>Schnell die Platte aus dem Teller Leser zu entfernen und fügen 25 µL Geruchsstoff Verdünnungen in jede Vertiefung und kontinuierliche Lumineszenz Messung alle Brunnen für 20 Zyklen sofort starten innerhalb von 30 min. 
	Hinweis: Pipette vorsichtig zur Vermeidung einer Kontamination benachbarter Brunnen, bei Verwendung von verschiedenen Riechstoffen und/oder unterschiedliche Konzentrationen der gleichen Geruchsstoffe in der gleichen Platte.</li>
</ol> 5. Analyse der Daten <ol><li>exportieren Sie die Daten aus der Chemilumineszenz-Platte-Reader-Software.</li>
	<li>Calculate normalisiert OR Antwort für jeden Zeitpunkt mit Hilfe der Formel 
	(Lumineszenz N &#8211; Lumineszenz basale) / (Lumineszenz höchste &#8211; Lumineszenz basale) wo N = Lumineszenz-Wert eines bestimmten gut; basale = durchschnittliche Lumineszenz-Wert der beiden basalen Lumineszenz-Werte; höchste = höchsten Lumineszenz-Wert einer Platte oder eine Reihe von Platten. 
	Hinweis: Je nach Zweck des Experiments, alternative grafische Darstellungen angenommen werden können. Zum Beispiel für screening-Tests (siehe Abbildung 1) und zur Erzeugung von Konzentration-Wirkungs-Kurven, die Lumineszenz-Wert eines Brunnens zu einem gewünschten Zeitpunkt während der kinetischen Messung, z. B. den maximalen Wert oder die Endwert, verwendet werden.</li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Genaue Messung eine OR-Aktivierung nach Exposition gegenüber einem bestimmten Geruchsstoff ist der erste Schritt bei der Entschlüsselung der Codierung der Geruchsinformation. Die Experimente gezeigt, die ein Beispiel wie man über ein in-vitro- identifizieren kann, die in dieser Studie OR Expressionssystems, reaktionsschnelle ORs unter dem menschlichen OR Repertoire für die duftende Chemie-und anschließend Charakterisierung des Rezeptors Pharmakologie mit verschiedenen Konzentrationen der Chemikalie. Unsere Ergeb...

Der Geruchssinn spielt eine wichtige Rolle in der Tiere überleben, da sie verlassen sich auf ihre olfaktorischen Fähigkeiten erhalten Nahrung, Raubtiere und Gefahr zu vermeiden, Arten zu unterscheiden, und wählen Mate1,2. Die Realisierung dieser Funktionen hängt von der Duftstoff-Rezeptoren (ORs), die individuell an die ciliary Oberfläche des olfaktorischen sensorischen Neuronen (Korrelationsmöglichkeiten) befindet sich in der olfaktorischen Epithel (OE) ausgedrückt werden. Regionen in äußerster Randlage bilden die größte Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-Superfamilie mit ungefähr 400 und 1200 verschiedene OR Gene im menschlichen und Maus, bzw.3,4,5. Regionen in äußerster Randlage aktiviert durch Geruchsstoffe führen zu erhöhten intrazellulären cAMP-Spiegel über die sequentielle Aktivierung des olfaktorischen G-Protein (GOlf) und Typ III Adenylyl Cyclase (ACIII). Die daraus resultierende erhöhte intrazelluläre cAMP könnte funktionieren als zweiter Bote, der Nucleotide-gated Kanal auf der Zelloberfläche öffnet, Auslösung Zustrom von kationen einschließlich Ca2 + und Aktionspotentiale, und letztlich zu initiieren Neuro-Potenzial Übertragungs- und olfaktorischen Wahrnehmung. Der Prozess der Erkennung und Unterscheidung eine große Anzahl von Riechstoffen von Regionen in äußerster Randlage gilt als der erste Schritt der olfaktorischen Wahrnehmung6,7.
Da Buck und Axel8 zuerst erfolgreich Geruchsstoff Rezeptoren geklont und den Mechanismus der olfaktorischen Wahrnehmung von Regionen in äußerster Randlage initiiert erläutert, wurde Deorphanization der OR-Familie einer der Hotspots in diesem Bereich. Verschiedenen in Vivo, Ex Vivo und in Vitro Methoden, OR Aktivierung zu messen gewesen gemeldeten9,10,11,12. Eine traditionelle Methode, Ca2 + Bildgebung von einzelligen RT-PCR auf Korrelationsmöglichkeiten gefolgt ermöglicht die Identifizierung der verschiedenen Regionen in äußerster Randlage aliphatischen Geruchsstoffe13,14,15. In jüngerer Zeit, das Aufkommen der großen Transkriptom-Analysen förderte die Entwicklung des mehr Hochdurchsatz- in-Vivo -Methoden. Der Kentucky-Test identifiziert Eugenol und Muscone-reagierende Maus ORs mit dem Einsatz der S100a5-TauGFP-Reporter Maus Belastung und Microarray Analyse9. Basierend auf den Rückgang der OR-mRNA-Niveaus nach Geruchsstoff Exposition, beschäftigt die Traum-Technologie ein transkriptomischen Konzept zur Bestimmung des OR Aktivierung Profile in beide Wirbeltiere und nicht-Wirbeltier-Arten-16. In ähnlicher Weise angesichts der Phosphorylierung des S6 in neuronalen Aktivierungen, die Matsunami Gruppe sequenzierten mRNAs aus phosphorylierten Ribosom Immunperoxidase, reaktionsschnelle ORs12zu identifizieren. Schließlich berichtet Feinstein Gruppe super Sniffer-Mäuse, die als Plattform, um Geruch Codierung in Vivo, bekannt als die MouSensor-Technologie-17Studie dienen könnten.
Im Bereich in-vitro- macht die Herausforderung der Kultivierung Korrelationsmöglichkeiten heterologen Expressionssystem, die imitiert, OR funktionelle Expression in Vivo eine ideale Lösung für große Screening von wohlriechenden Chemikalien für Regionen in äußerster Randlage führen. Jedoch da kultivierten Zelllinien nicht olfaktorische Herkunft unterscheiden sich von einheimischen Korrelationsmöglichkeiten oder Proteine werden in dem endoplasmatischen Retikulum und nicht in der Lage, um die Plasmamembran Verkehr beibehalten, was in OR Abbau und Verlust von Rezeptor-Funktion18 , 19. um dieses Problem zu lösen, umfangreiche Werke vorgenommen wurden, OR funktionelle Expression auf der Zellmembran in heterologen Zelllinien zu replizieren. Krautwurst Et Al. zuerst die ersten 20 Aminosäuren von Rhodopsin (Rho-Tag) an die N-terminale OR Protein und dies förderte die Zelloberfläche Ausdruck von einigen ORs in menschlichen embryonalen Niere (HEK) Zellen20. Durch eine serielle Analyse der Genanalyse Ausdruck (Salbei) Bibliothek aus einzelnen Korrelationsmöglichkeiten Saito Et Al. zuerst geklont, die Rezeptor-der Transport von Protein (RTP) Familienmitglieder, RTP1 und RTP2 und der Rezeptor Ausdruck Enhancer Protein 1 (REEP1), das or Menschenhandel an der Zellmembran erleichtert und verbessert Duftstoff-vermittelten Reaktionen der ORs in HEK293T Zellen 21. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen, Matsunami Gruppe erfolgreich etabliert die Hana3A-Zell-Linie mit RTP1 und RTP2, REEP1 sowie GαOlf in HEK293T stabil transfiziert und vorübergehend mit Rho-Tags ORs für effiziente oder funktionale transfiziert Ausdruck. Nachfolgende Studien zeigte (1) eine kürzere Form der RTP1, RTP1S, die stärker zu fördern oder funktionieren als das ursprüngliche RTP1 Protein und (2) der Typ 3 Muskarin Acetylcholin-Rezeptor (M3R), die OR-Aktivität über Hemmung der β-arrestin-2 verbessern könnte Rekrutierung, beide auf der heterologen Expressionssystem experimentelle Optimierung eingeführt wurden Ausgabe22,23.
Verschiedene Nachweismethoden wurden zur Aktivierung des Rezeptors in heterologen Systemen zu quantifizieren. Die sekretierten plazentare alkalische Phosphatase (SEAP) Assay arbeitet mit einem Reporter Enzym transcriptionally geregelt cAMP Response-Elemente (CREs), so dass es eine attraktive Option für die Beurteilung der OR-Aktivierung. Die Fluoreszenz wird leicht in einer Probe des Kulturmediums nach der Inkubation mit SEAP Erkennung Reagenz24erkannt. Mit dieser Methode charakterisiert die Funktionen der Regionen in äußerster Randlage sowie eine sekundäre Klasse chemosensorische Rezeptoren, ausgedrückt in der OE-die Spur Amin-assoziierte Rezeptoren (TAARs) wurden25,26,27. Eine weitere gängige Methode, die Luciferase Assay verwendet ein Glühwürmchen Luciferase Reporter-gen unter der Kontrolle des cAMP Response-Element (CRE). Messung der Lumineszenz von Luciferase Produktion erzeugt stellt eine effiziente und robuste Möglichkeit zur Quantifizierung OR Aktivierung10,11,28.
Echtzeit-cAMP Assays haben auch verbreitet in dynamisch die Überwachungsfunktion der heterologen oder endogene GPCRs. Ein Beispiel für solche erweiterten Tests nutzt eine genetisch codierte Biosensor-Variante, die eine cAMP-bindende Domäne verschmolzen zu einer mutierten Form der Luciferase besitzt. Wenn Lager bindet, führt die Konformationsänderung zur Aktivierung der Luciferase, Lumineszenz von denen dann mit einem Chemilumineszenz Leser29,30gemessen werden kann. Die Echtzeit-cAMP Technologie ist geeignet für die de-Verwaisung des menschlichen Geruchsstoff Rezeptoren in HEK293 und NxG 108CC15 Zellen berichtet wordenArsch = "Xref" > 31,32,33, wie sowie in die HEK293T abgeleitet Hana3A34,35Zellen. Die Krautwurst-Gruppe auch beschrieben im Detail die Echtzeit-cAMP-Technologie, um für Bi-direktionale groß angelegte oder Screening Ansätze32,33geeignet.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der OR-Aktivierung mit einem Echtzeit-cAMP-Assay in Hana3A Zellen. In diesem Protokoll wird die Lumineszenz von Pre äquilibriert lebenden Zellen für 30 min. nach der Behandlung mit bestimmten flüchtige Verbindungen, die eine effiziente und genaue Analyse der OR-Aktivierung, die weniger anfällig sind, kinetisch gemessen. Artefakte, die in der zellulären Umgebung mit längerer Zeit und Geruch-induzierte Zelle Toxizitäten auftreten. Diese Echtzeit-Messung ermöglicht eine großangelegte Screening von Regionen in äußerster Randlage und Liganden sowie Charakterisierung von spezifischen OR-Ligand Paaren von Interesse. Mit dieser Methode haben wir erfolgreich OR5AN1 als Rezeptor für den Moschus zusammengesetzten Muscone durch eine Abschirmung gegen 379 menschlichen ORs durchführen und anschließend bestätigen das positive Screening-Ergebnis.

<table><tbody><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>GloSensor cAMP Reagenz</td><td>Promega</td><td>E1290</td><td></td></tr><tr><td>pGloSensor-20F cAMP Plasmid</td><td>Promega</td><td>E1171</td><td></td></tr><tr><td>Hana3A-Zellen</td><td></td><td></td><td>auf Anfrage bei Autoren erhältlich</td></tr><tr><td>HBSS, ohne Calcium oder Magnesium</td><td>GIBCO</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>M3R Plasmid</td><td></td><td></td>, <td>kloniert in einen Säugetier-Expressionsvektor wie pCI</td></tr><tr><td>MEM, mit EBSS und L-Glutamin</td><td>Hyclone</td><td>SH30024</td><td></td></tr><tr><td>Muscone</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200528</td><td></td></tr><tr><td>Moschus-Tibeten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S359165 OR-Plasmide</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>, <td>die mit einem Rho-Tag in einen Säugetier-Expressionsvektor wie pCI PBS kloniert</td></tr><tr><td>wurden, ohne Calcium oder Magnesium</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Hyklon</td><td></td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid-Miniprep-Kit</td><td>Tiangen</td><td>DP103-03</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>RTP1S-Plasmid</td><td></td><td></td><td>, kloniert in einen Säugetier-Expressionsvektor wie pCI</td></tr>, <tr><td>Trypsin-EDTA,</td><td>Hyklon</td> SH30236 0,2-ml-PCR-Röhrchen<td></td><td></td></tr>, <tr><td></td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen</td><td>, Eppendorf-Röhrchen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml, 17 mm x 120 mm, konisches Röhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>8-Well- und/oder 12-Well-Mehrkanalpipettierer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Weißzellkulturplatte mit flachem Boden</td><td>Greiner</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm Zellkulturschale</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>biologische Sicherheitswerkbank der Klasse II mit laminarer Strömung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur-Inkubator mit 5 % CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge, mit schwingendem Schaufelrotor für konische 15-ml-Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infinite F200 Plattenleser</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phasenkontrastmikroskop mit x10 und x20 Objektiven</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Reagenzreservoire für die Mehrkanalverteilung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriles Papiertuch</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

leben-zelle messung der geruchsstoff rezeptor aktivierung mit einem echtzeit-camp-assay

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Die enorme Größe der Säugetier-Geruchsstoff Rezeptor (OR) Familien Schwierigkeiten, ihre Verwandten Liganden unter zahlreichen flüchtigen Chemikalien zu finden. Um effizient und präzise ORs deorphanize, kombinieren wir die Verwendung einer heterologen Zelllinie Säugetier-ORs und ein genetisch veränderter Biosensor-Plasmid Lager Produktion flussabwärts von OR Aktivierung in Echtzeit zu messen zum Ausdruck bringen. Dieser Test kann auf Bildschirm Geruchsstoffe gegen ORs und umgekehrtverwendet werden. Duftstoff-Rezeptor-positiven Interaktionen von den Bildschirmen können anschließend durch Tests mit verschiedenen Konzentrationen von Geruch, Generierung von Konzentration-Wirkungs-Kurven bestätigt werden. Hier haben wir diese Methode durchführen eine Hochdurchsatz-Screening eine duftende Substanz gegen eine menschliche OR-Bibliothek in Hana3A Zellen exprimiert und bestätigt, dass der Rezeptor reagiert positiv cognate Rezeptor für die Verbindung von Interesse ist. Wir fanden diese Hochdurchsatz-Erkennungsmethode effizient und zuverlässig bei der Beurteilung der OR-Aktivierung und unsere Daten liefern ein Beispiel für den möglichen Einsatz in OR funktionelle Studien.

Muscone ist die wichtigste aromatische Komponente aus natürlichen Moschus. Aktuelle Studien identifizierten OR5AN1 als menschliche Rezeptor für Muscone und andere makrozyklische Moschus-Verbindungen basierend auf Homologie auf die Maus oder MOR215-1, von Muscone eine geschlechtergerechte Glomeruli im Verhalten der Mäuse37,38geklont. Durch screening der menschlichen OR Repertoire, unsere Gruppe und der Touhara-Gruppe auch identifiz...

Charakterisierung der Funktion der Geruchsstoff Rezeptoren dient einen unverzichtbaren Bestandteil in der Deorphanization-Prozess. Wir beschreiben eine Methode zur Messung der Aktivierung des Duftstoff-Rezeptoren in Echtzeit über einen cAMP-Assay.

Leben-Zelle Messung der Geruchsstoff Rezeptor Aktivierung mit einem Echtzeit-cAMP-Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Echtzeit-Hochdurchsatz-cAMP-Assays besteht darin, Duftstoffe gegen Duftstoffrezeptoren und umgekehrt zu testen. Mäuse eignen sich gut zur Untersuchung der Funktion von Duftstoffrezeptoren, da sie umfangreichere Tests sowohl der Duftstoffrezeptoren als auch der Liganden ermöglichen und zudem pharmakologische Charakterisierungen spezifischer Rezeptor-Ligand-Paare erlauben. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass wir die Aktivierung von Rezeptoren durch Duftstoffe effizient und zuverlässig bewerten können.Heterologes Odorant-zu-Rezeptor-Expressionsystem unter Verwendung lebender Zellen. Beginnen Sie damit, Hana3A-Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop zu beobachten, um die Zellviabilität sicherzustellen und die Konfluenz abzuschätzen. Danach saugen Sie das gesamte Medium aus der Zellkulturschale ab.Und waschen Sie die Zellen, indem Sie 10 Milliliter gepufferte Phosphatlösung auf die Platte geben, die Schale schwenken und die PBS absaugieren. Fügen Sie danach drei Milliliter 0,5 %igem Trypsin-EDTA auf die Platte hinzu. Lassen Sie das Trypsin eine Minute lang auf den Zellen oder bis alle Zellen schweben.Inaktivieren Sie die Trypsinlösung, indem Sie 5 Milliliter MEM mit 10 % FBS hinzufügen und mehrmals auf- und abpipettieren, um Zellklumpen aufzulösen. Nach der Bestimmung der Zellzahl übertragen Sie 2 × 10⁶ Zellen pro 96-Well-Platte, die transfiziert werden soll, in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Es ist wichtig, die korrekte Anzahl an Zellen zu berechnen, die auf die 96-Well-Platte ausgesät werden sollen, um ein Über- oder Unterwachsen der Zellen vor der Stimulation zu vermeiden.Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 200 × g für fünf Minuten. Danach pipettieren Sie den Überstand ab, ohne den Zellpellet zu stören. Geben Sie sechs Milliliter Medium ohne Antibiotika pro 96-Well-Platte hinzu und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, ohne Luftblasen zu erzeugen, um Klumpen der Zellmasse aufzulösen.Überführen Sie die suspendierten Zellen in ein Reservoir. Geben Sie mithilfe einer Mehrkanalpipette jeweils 50 Mikroliter Zellen in jede Vertiefung der 96-Loch-Platten. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.Vor der Transfektion die angesiedelten Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop überprüfen, um eine geeignete Konfluenz von etwa 30 bis 50 % pro Vertiefung sicherzustellen, und anschließend in den Inkubator zurückbringen. Befolgen Sie die Zeile, die mit Duftstoff-zu-Rezeptor-Konstrukt, den Hilfsfaktor-Konstrukten und der cAMP-Biosensor-Varianten-Konstrukt gekennzeichnet ist. Bereiten Sie dann eine Plasmatransfektionsmischung in 500 Mikroliter MEM für jede 96-Loch-Platte vor.Bereiten Sie anschließend ein Transfektionsgemisch mit 18 µL lipidvermitteltem Transfektionsreagenz in 500 µL MEM vor. Mischen Sie das Transfektionsgemisch durch Auf- und Abpipettieren mit dem Plasmagemisch. Inkubieren Sie dann 15 Minuten bei Raumtemperatur.Nach der Inkubation stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 5 Milliliter MEM mit 10 % FBS zur Transfektionsmischung hinzufügen. Danach breiten Sie eine dicke Schicht steriler Papiertücher im Zellkulturwerk aus. Nehmen Sie eine 96-Well-Platte mit Zellen aus dem Inkubator.Tippen Sie vorsichtig und wiederholt mit der umgedrehten Platte auf den Stapel aus Papiertüchern, sodass das Medium vollständig von den Papiertüchern aufgenommen wird. Geben Sie 50 Mikroliter der kombinierten Transfektionsmischung in jedes Loch der 96-Loch-Platte und inkubieren Sie über Nacht für 18 bis 24 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Sie können die Transfektion verwalten und der Stimulationszeitplan sollte am Gerät beibehalten werden, wenn mehr als eine 96-Loch-Platte in einem Experiment getestet wird, sodass alle Platten nach dem gleichen Transfektions- und Reagenzien-Expositionsintervall behandelt werden.Vor der Stimulation die transfizierten Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop beobachten, um eine angemessene Konfluenz von 50 bis 80 % pro Vertiefung sicherzustellen, bevor sie in den Inkubator zurückgebracht werden. Anschließend das Stimulationsmedium herstellen, indem 10 Millimolar HEPES und 5 Millimolar Glukose zu Hanks' abgeglichener Salzlösung hinzugefügt werden. 55 Mikroliter Aliquote des Substratreagenz für den Echtzeit-cAMP-Assay auf Eis auftauen.Stellen Sie eine 2 %ige äquivalente Abriebslösung her, indem Sie 55 Mikroliter des Substratreagenz und 2.750 Mikroliter Stimulationsmedium mischen. Nachdem Sie eine dicke Schicht Papiertücher auf der Arbeitsfläche ausgebreitet haben, klopfen Sie die Platte vorsichtig und wiederholt mit der Öffnung nach unten auf die Papiertücher, sodass das Transfektionsmedium von den Papiertüchern aufgenommen wird. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 50 Mikroliter Stimulationsmedium in jede Vertiefung pipettieren.Klopfen Sie das Stimulationsmedium vorsichtig und wiederholt aus der 96-Well-Platte aus. Pipettieren Sie 25 Mikroliter 2 % Ausgleichslösung in jedes Well und inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln. Vor Ende der Inkubationszeit verdünnen Sie die aufgetauten Geruchsstoff-Stammlösungen auf die Arbeitskonzentration sowie das Stimulationsmedium.Vor der Zugabe des Duftstoffs messen Sie mit einem Chemilumineszenz-Plattenreader das basale Lumineszenzniveau der Platte. Entfernen Sie die Platte schnell aus dem Plattenreader und geben Sie 25 Mikroliter der Duftstoffverdünnungen in jedes Loch. Starten Sie anschließend unmittelbar die kontinuierliche Lumineszenzmessung aller Löcher für 20 Zyklen innerhalb von 30 Minuten.379 einzigartige menschliche Geruchrezeptoren wurden gegen 30 Mikromolar Muskon unter Verwendung des Echtzeit-cAMP-Assays getestet. Farbige Blöcke entlang der X-Achse zeigen verschiedene menschliche Geruchrezeptorfamilien an. Die Y-Achse stellt die normalisierte Lumineszenz 30 Minuten nach Zugabe des Geruchsstoffes dar, wenn die Antwort für die positive Kontrolle ihr Maximum erreicht hatte.Die Reaktion von OR5AN1 ist angegeben. Diese Abbildung zeigt Echtzeitmessungen der Aktivierung von OR5AN1 durch verschiedene Konzentrationen von Muskon sowie das Ergebnis einer Kontrolle ohne Duftstoff. Der Pfeil zeigt den Zeitpunkt der Zugabe des Duftstoffs an.Hier ist eine Konzentrations-Wirkungs-Kurve von OR5AN1 gegenüber Muskon 30 Minuten nach Zugabe des Geruchsstoffes dargestellt. Die hier beschriebene Technik erstreckt sich insgesamt über drei Tage, beginnend mit einer Stammpfla­te mit Kulturstufen am ersten Tag. Wenn sie einmal beherrscht wird, kann die Prozedur am letzten Tag für jede 96-Loch-Platte innerhalb von drei Stunden abgeschlossen werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Aktivierung von Geruchssensoren mithilfe eines cAMP-Assays verwaltet und die Ergebnisse genutzt werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

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Hier zeigen wir ein Protokoll für die Durchführung Lebendzellfärbungen, die zur Geruchsrezeptoren auf der Oberfläche von Zellen HEK293T bequem nachgewiesen werden können. Darüber hinaus kann es auch zum Testen auf Oberflächenexpression von anderen Chemosensoren oder GPCRs verwendet werden.

Assaying Oberfläche Expression von Chemosensoren in heterologen Zellen

Dieses Video demonstriert das Protokoll zur Messung der Odorantrezeptoraktivierung in transfizierten Zellen mit einem zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP)-Biosensor und Lumineszenzdetektion. Die Methode wird angewendet, um Rezeptor-Liganden-Interaktionen und Signalwege in olfaktorischen Neuronen zu untersuchen.

Messung der Aktivierung von Geruchsrezeptoren mit einem zyklischen Echtzeit-Adenosinmonophosphat-Assay

Quelle: de March, C. A. et. al., Echtzeit-In-vitro-Überwachung der Aktivierung des Odorantrezeptors durch einen Odorant in der Dampfphase. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video demonstriert die Methode zur Überwachung der Echtzeitaktivierung von Geruchsrezeptoren in rekombinanten Säugetierzellen mittels Lumineszenzmessung. Die Bindung von Odorierungsstoffen löst die Aktivierung von G-Proteinen und die cAMP-Produktion aus und aktiviert Glosensorproteine, die bei der Substratbindung Lumineszenz abgeben...

Echtzeit-Überwachung der Aktivierung von Geruchsrezeptoren in rekombinanten Zellen

Persistent Aktivierung inhibierenden G-Protein-gekoppelten Rezeptoren führt Sensibilisierung von Adenylylcyclase-Signalisierung. Um die wesentlichen molekularen Signalwege zu identifizieren, sind nonbiased Ansätze notwendig, aber diese Strategie erfordert die Entwicklung einer skalierbaren zellbasierten Assay-cAMP-Sensibilisierung. Hier beschreiben wir eine Sensibilisierung Assay für Kleinmolekül-und siRNA-Screening.

Drug-induzierte Sensibilisierung der Adenylatzyklase: Assay Straffung und Miniaturisierung für Small Molecule-und siRNA-Screening-Anwendungen

Riechrezeptoraktivierungsmuster kodieren Geruch Identität, sondern der Mangel an veröffentlichten Daten zur Identifizierung Geruchsliganden für Säugetiergeruchsrezeptoren behindert die Entwicklung eines umfassenden Modells der Duftkodierung. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Hochdurchsatz-Identifizierung Geruchsrezeptorliganden und Quantifizierung der Rezeptoraktivierung zu erleichtern.

Hochdurchsatz-Analyse von Säugetiergeruchsrezeptoren: Die Messung der Rezeptoraktivierung über Luciferaseaktivität

Die Analyse der physiologischen Eigenschaften von olfaktorischen sensorischen Neuronen stößt immer noch an technische Grenzen. Hier erfassen wir sie durch perforierte Patch-Clamp in einer intakten Präparation des olfaktorischen Epithels bei gengesteuerten Mäusen. Diese Technik ermöglicht die Charakterisierung von Membraneigenschaften und Reaktionen auf spezifische Liganden von Neuronen, die definierte Geruchsrezeptoren exprimieren.

Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor

Dieses Protokoll analysiert Navigations Verhalten von Drosophila Larve in Reaktion auf die gleichzeitige optogenetische Stimulation der olfaktorischen Neuronen. 630 nm Wellenlänge wird verwendet, um einzelne olfaktorischen Neuronen mit dem Ausdruck einer rot-verschoben Kanal Rhodopsin zu aktivieren. Larval Bewegung gleichzeitig verfolgt, digital erfasst und mit individuell geschriebenen Software analysiert.

Tracking von Drosophila Larven Verhalten als Reaktion auf optogenetische Stimulation der olfaktorischen Neuronen

Physiologisch werden durch Geruchsstoff Moleküle in der Dampfphase eingeatmet Geruchsstoff Rezeptoren aktiviert. Jedoch verwenden die meisten in-vitro-Systeme Flüssigphase Geruchsstoff Stimulation. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, die erlaubt, in-vitro-Echtzeitüberwachung der Duftstoff-Rezeptor-Aktivierung bei Geruchsstoff Stimulation in der Dampfphase.

In-vitro-Überwachung der Duftstoff-Rezeptor-Aktivierung durch einen Geruchsstoff in der Dampfphase in Echtzeit

Das in dieser Studie vorgestellte Protokoll veranschaulicht die Wirksamkeit des cAMP Difference Detector In Situ  bei der Messung von cAMP durch zwei Methoden. Bei einer Methode wird ein 96-Well-Plattenablese-Spektralphotometer mit HEK-293-Zellen verwendet. Die andere Methode zeigt einzelne HASM-Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop.

Echtzeit-cAMP-Dynamik in lebenden Zellen mit dem fluoreszierenden cAMP-Differenzdetektor in situ

Olfaktorische Rezeptor-Neuronen (ORN) zu konvertieren Geruchs-Signale zunächst in einem Rezeptor Strom, wiederum löst Aktionspotentiale, die bis zur zweiten Ordnung Neuronen im Riechkolben gefördert werden. Hier beschreiben wir die Saugpipette Technik gleichzeitig aufzeichnen Duftstoff-induzierte Rezeptor-Strom-und Aktionspotentiale aus Maus ORN.

Odorant-induzierten Reaktionen aus olfaktorischen Rezeptor-Neuronen mit der Saugpipette Technik aufgenommen

Lernen Sie die Echtzeit-cAMP-Assay-Methode zur Messung von Geruchsstoff-Rezeptor-Aktivierung in lebenden Zellen. Diese Technik ermöglicht effizientes Screening von Rezeptor-Ligand-Paaren.

Leben-Zelle Messung der Geruchsstoff Rezeptor Aktivierung mit einem Echtzeit-cAMP-Assay

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