Leben-Zelle Messung der Geruchsstoff Rezeptor Aktivierung mit einem Echtzeit-cAMP-Assay

Das übergeordnete Ziel dieses zyklischen Echtzeit-AMP-Assays mit hohem Durchsatz ist es, Odorstoffe gegen Odorantenrezeptoren zu screenen und umgekehrt. Da Mäuse für die Untersuchung der Funktion von Geruchsrezeptoren nützlich sind, ermöglicht sie ein großflächiges Screening sowohl der Geruchsrezeptoren als auch der Liganden sowie pharmakologische Kartellierungen eines Rezeptor-Liganden-Paares von Interesse. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die Aktivierung von Odorant zu Rezeptor effizient und zuverlässig beurteilen können.

Heterologes Odorant-to-Rezeptor-Expressionssystem unter Verwendung lebender Zellen. Beginnen Sie mit der Beobachtung von Hana3A-Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop, um die Lebensfähigkeit der Zellen sicherzustellen und die Konfluenz abzuschätzen. Saugen Sie dann das gesamte Medium aus der Zellkulturschale ab.

Und waschen Sie die Zellen, indem Sie 10 Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung auf den Teller geben, die Schale schwenken und das PBS aspirieren. Als nächstes gibst du die drei Milliliter 0,5%Trypsin-EDTA auf den Teller. Lassen Sie das Trypsin eine Minute lang auf den Zellen oder bis alle Zellen über Wasser sind.

Inaktivieren Sie das Trypsin, indem Sie 5 Milliliter MEM mit 10% FBS hinzufügen und auf und ab pipettieren, um Teile der Zellmasse aufzubrechen. Nach Durchführung einer Zellzählung werden 2x10 Zellen auf die 6. Zellen pro 96-Well-Platte übertragen, um in ein 15-Milliliter-Röhrchen transfiziert zu werden. Es ist wichtig, dass Sie die richtige Anzahl der zu präparierenden Zellen auf einer 96-Well-Platte berechnen, um ein Über- oder Unterwachsen der Zellen vor der Stimulation zu vermeiden.

Die Röhrchen werden fünf Minuten lang bei 200-fachem G zentrifugiert. Und dann aspirieren Sie den Überstand, ohne die Zellpalette zu stören. Geben Sie sechs Milliliter Medium ohne Antibiotika für jede 96-Well-Platte hinzu und pipettieren Sie auf und ab, ohne Luftblasen zu bilden, um Teile der Zellmasse aufzubrechen.

Übertragen Sie die suspendierten Zellen in ein Reservoir. Pipettieren Sie mit einer Mehrkanalpipette 50 Mikroliter Zellen in jede Vertiefung der 96-Well-Platten. Über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid inkubieren.

Beobachten Sie die plattierten Zellen vor der Transfektion unter einem Phasenkontrastmikroskop, um einen korrekten Zusammenfluss von etwa 30 bis 50 % pro Vertiefung sicherzustellen, und kehren Sie dann in den Inkubator zurück. Folgen Sie der Zeile mit dem Tag odorant-to-receptor-Konstrukt, den Konstrukten des akzessorischen Faktors und dem Konstrukt der zyklischen AMP-Biosensorvariante. Bereiten Sie dann eine Plasma-Transfektionsmischung in 500 Mikrolitern MEM für jede 96-Well-Platte vor.

Bereiten Sie als Nächstes eine Transfektionsmischung vor, die 18 Mikroliter lipidvermitteltes Transfektionsreagenz in 500 Mikrolitern MEM enthält. Mischen Sie das Transfektionsgemisch mit dem Plasmagemisch, indem Sie es auf und ab pipettieren. Anschließend 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Nach der Inkubation stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 5 Milliliter MEM mit 10 % FBS zur Transfektionsmischung hinzufügen. Verteilen Sie anschließend eine dicke Schicht steriler Papiertücher in der Zellkulturhaube. Nehmen Sie eine 96-Well-Platte mit Zellen aus dem Inkubator.

Klopfen Sie die Platte vorsichtig und wiederholt kopfüber auf den Stapel Papiertücher, so dass das Medium vollständig vom Papiertuch absorbiert wird. Übertragen Sie 50 Mikroliter der kombinierten Transfektionsmischung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte und inkubieren Sie sie über Nacht 18 bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Sie können die Transfektion kontrollieren und der Stimulationsplan sollte auf dem Instrument für mehr als eine 96-Well-Platte bestehen bleiben, die in einem Experiment getestet wird, so dass alle Platten nach demselben Transfektions- und Distillations-Expositionsintervall gespiegelt werden.

Beobachten Sie die transfizierten Zellen vor der Stimulation unter einem Phasenkontrastmikroskop, um eine korrekte Konfluenz von 50 bis 80 % pro Vertiefung zu gewährleisten, bevor Sie in den Inkubator zurückkehren. Bereiten Sie dann das Stimulationsmedium vor, indem Sie 10 millimolare Haufen und fünf millimolare Glukose zu Hanks' ausgewogener Salzlösung hinzufügen. Auftauen von 55 Mikrolitern Alloquats von zyklischen Echtzeit-AMP-Assay-Substratreagenzien auf Eis.

Bereiten Sie eine 2%ige Abrationslösung her, indem Sie 55 Mikroliter des Substratreagenzes und 2.750 Mikroliter Stimulationsmedium mischen. Nachdem Sie eine dicke Schicht Papiertücher auf der Bank ausgebreitet haben, klopfen Sie die Platte vorsichtig und wiederholt kopfüber auf die Papiertücher, so dass das Transfektionsmedium von den Papiertüchern absorbiert wird. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 50 Mikroliter Stimulationsmedium in jede Vertiefung pipettieren.

Klopfen Sie das Stimulationsmedium sanft und wiederholt aus der 96-Well-Platte ab. Pipettieren Sie 25 Mikroliter 2%ige Äquilibrationslösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Vor Ablauf der Inkubationszeit aufgetaute Odorstoff-Stammlösungen auf Arbeitskonzentration und Stimulationsmedium verdünnen.

Verwenden Sie vor der Zugabe von Odorierungsmitteln einen Chemilumineszenzplatten-Reader, um den basalen Lumineszenzgrad der Platte zu messen. Nehmen Sie die Platte schnell aus dem Plattenleser und geben Sie 25 Mikroliter der Odoriermittelverdünnungen in jede Vertiefung. Starten Sie dann sofort die kontinuierliche Lumineszenzmessung aller Wells für 20 Zyklen innerhalb von 30 Minuten.

379 einzigartige humane Geruchsrezeptoren wurden mit dem zyklischen Echtzeit-AMP-Assay gegen 30 mikromolare Muskone gescreent. Farbige Blöcke entlang der X-Achse zeigen verschiedene menschliche Geruchsrezeptorfamilien an. Die Y-Achse stellt die normalisierte Lumineszenz 30 Minuten nach der Zugabe des Odoriermittels dar, wenn die Reaktion das Maximum für die Positivkontrolle erreichte.

Das Ansprechverhalten von OR5AN1 wird angezeigt. Diese Abbildung zeigt Echtzeitmessungen der OR5AN1-Aktivierung durch verschiedene Konzentrationen von Muskel und das Ergebnis einer geruchsfreien Negativkontrolle. Der Pfeil zeigt den Zeitpunkt der Oderantenzugabe an.

Hier ist eine Konzentrationsreaktionskurve von OR5AN1 gegen Muscon 30 Minuten nach Zugabe von Oderant dargestellt. Die hier beschriebene Technik dauert insgesamt drei Tage, beginnend mit einer Lagerplatte mit Kulturstufen am ersten Tag. Einmal gemeistert, kann der Prozess am letzten Tag für jede 96-Well-Platte in drei Stunden abgeschlossen werden, wenn er richtig durchgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Aktivierung von Oderantenrezeptoren mit einem zyklischen AMP-Assay steuern können, um die Ergebnisse zu nutzen.