In-vitro- Biolumineszenz-Assay zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen zu charakterisieren

Das übergeordnete Ziel dieses in vitro Biolumineszenz-Assays ist es, die Auswirkungen verschiedener zirkadianer Disruptoren und Enhancer aus der Umwelt auf den zellulären zirkadianen Rhythmus von Brustepithelzellen aus Brustdrüsen im normalen oder erkrankten Zustand zu bestimmen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Umweltgesundheit zu beantworten, z. B. ob Umweltfaktoren, einschließlich chemischer Verbindungen, den zellulären zirkadianen Rhythmus beeinflussen. Der Hauptvorteil dieses Assays besteht also darin, dass er leicht an eine Vielzahl von Zelltypen angepasst werden kann, so dass wir nach Umweltmodulatoren von zirkadianen Uhren in verschiedenen Organen suchen können.

Brian Estrella, ein Doktorand in unserem Labor, demonstriert mir das Verfahren. Das humane PER2-Promotorfragment wird aus einem angepassten Vektor gewonnen, der humanes PER2P an der Stelle zwischen SecI und HindIII in der multiplen Klonierungsregion enthält. Um das humane PER2P-Fragment aus dem Vektor herauszuschneiden, mischen Sie Folgendes in einem DNA/RNA- und Nukleotid-freien Mikrozentrifugenröhrchen, 2,5 Mikroliter Restriktionsenzympuffer, 10 Mikroliter Vektor, einen Mikroliter SacI-Restriktionsenzym, einen Mikroliter HindIII-Restriktionsenzym und Reinstwasser zu 25 Mikrolitern.

In einem Heizblock bei 37 Grad Celsius 90 Minuten inkubieren. Wenn der Restriktionsverdau abgeschlossen ist, führen Sie das gesamte Volumen der Reaktion auf einem 0,7%Agarose-Gel durch, das 0001%Ethidiumbromid enthält, um menschliches PER2P vom Vektor zu trennen. Schneiden Sie ein Stück Agarose-Gel, das eine Fluoreszenzbande bei 941 Basenpaaren enthält, reinigen Sie die humanen PER2P-Fragmente aus dem Gel und quantifizieren Sie die DNA, wie im Textprotokoll beschrieben.

Der nächste Schritt besteht darin, humanes PER2P in einen Vektor mit destabilisierter Feuerfluss-Luziferase zu klonen. Linearisieren Sie ein Mikrogramm des Vektors durch Restriktionsverdau mit SacI und HindIII, wie zuvor gezeigt. Führen Sie das gesamte Volumen der Reaktion auf einem Gel durch, das Ethidiumbromid enthält, und reinigen und quantifizieren Sie dann die Vektor-DNA wie zuvor.

Um humanes PER2P in den linearisierten Vektor zu ligieren, mischen Sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig zwei Mikroliter T4-DNA-Ligase-Reaktionspuffer, 3,26 Mikroliter humanes PER2P, einen Mikroliter linearisierten Vektor und Wasser auf 20 Mikroliter. Dann einen Mikroliter T4-DNA-Ligase hinzufügen, vorsichtig mischen und über Nacht bei 16 Grad Celsius in einem Thermocycler inkubieren. Am nächsten Tag kühlen Sie den ligierten Vektor auf Eis.

Stellen Sie vor der Umwandlung ein Wasserbad auf 42 Grad Celsius ein, erwärmen Sie das SOC-Medium auf Raumtemperatur und erwärmen Sie die LB-Agarplatten im 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Tauen Sie zwei Fläschchen mit kompetenten E.coli-Zellen auf Eis auf. Um die Umwandlung zu starten, geben Sie sechs Mikroliter ligierten Vektor in ein Röhrchen mit chemisch kompetenten E.coli und drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um, um es zu mischen.

Als Negativkontrolle geben Sie einen Mikroliter leeren Vektor in ein anderes Röhrchen mit chemisch kompetenten E.coli und inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang auf Eis. Nach 30 Minuten im 42 Grad Celsius warmen Wasserbad 30 Sekunden lang ohne Schütteln einen Hitzeschock durchführen und dann die Schläuche wieder auf Eis legen. Geben Sie 250 Mikroliter SOC-Medium in jedes Röhrchen und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln bei 200 U/min.

Als nächstes verteilen Sie gleichmäßig 10 bis 50 Mikroliter jeder transformierten E.coli-Reaktion auf der Oberfläche einer LB-Agarplatte. Legen Sie die Platten über Nacht kopfüber in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Am nächsten Tag entnehmen Sie mit einer sterilisierten Impfschlaufe drei bis sechs weiße Kolonien aus jeder Platte und geben Sie jede Kolonie in ein Kulturröhrchen ab, das vier Milliliter LB-Kulturmedium mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin enthält.

Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie über Nacht bei 200 U/min. Für die DNA-Extraktion werden jeweils zwei Milliliter von vier Millilitern kultivierter E.coli verwendet. Nach Überprüfung der Insertion, wie im Textprotokoll beschrieben, amplifizieren Sie die ausgewählten E.coli, indem Sie die übrig gebliebenen zwei Milliliter kultivierter E.coli in 200 Milliliter LB-Kulturmedium mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin geben und bei 37 Grad Celsius inkubieren und über Nacht bei 200 U/min schütteln.

Die Plasma-DNA wird dann mit einem endotoxinfreien Plasmid-Maxiprep-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Nach der Quantifizierung der Plasma-DNA aliquotieren und bei minus 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung lagern. Die Brustepithelzellen, die mit dem konstruierten zirkadianen Vektor transfiziert werden sollen, werden mit einem Wachstumsmedium für Brustepithelzellen kultiviert, das das Basalmedium des Brustepithels, Wachstumszusätze und Choleratoxin enthält.

Um die Zellen zu dissoziieren, inkubieren Sie etwa 20 Minuten lang mit 10 Millilitern Trypsin-EDTA und neutralisieren Sie dann das Trypsin durch Zugabe von 10 Millilitern Trypsin-Neutralisationslösung. Übertragen Sie die Zellen in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie das Gericht mit 10 Millilitern gepufferter Kochsalzlösung aus und geben Sie die Spülung in das 50-Milliliter-Röhrchen.

Schleudern Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 1.500 U/min. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie drei Milliliter MEGM hinzu, um die Zellen zu resuspendieren. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämazytometer unter einem inversen Mikroskop.

Nach Berechnung der Konzentration der Einzelzellsuspension wird die Aussaat zweimal 10 bis die fünften Zellen gleichmäßig pro 35-Millimeter-Kulturschale mit MEGM aussäen. Schwenken Sie die Platten gründlich, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in jeder Platte zu erhalten. Züchten Sie die Zellen im Zellkultur-Inkubator auf 20 bis 30 % Konfluenz.

Am nächsten Tag erwärmen Sie das reduzierte Serummedium in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad und das Transfektionsreagenz 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Bringen Sie die Plasma-DNA auf Raumtemperatur. Verdünnen Sie die Plasma-DNA auf 30 Nanogramm pro Mikroliter mit endotoxinfreiem Tris-EDTA-Puffer und bewahren Sie sie bei Raumtemperatur auf.

Bereiten Sie jede Plasmidtransfektionsmischung in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor. Zuerst fügen Sie 63,6 Mikroliter warmes reduziertes Serummedium hinzu. Fügen Sie dann 33,4 % Mikroliter Plasma-DNA hinzu und mischen Sie sie vorsichtig durch Pipettieren.

Geben Sie zum Schluss drei Mikroliter Transfektionsreagenz direkt in die Mitte des Röhrchens, ohne die Wand zu berühren. Vorsichtig durch Pipettieren mischen und 30 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahren. Lassen Sie die gesamte Plasma-Transfektionsmischung direkt auf die Mittelfläche des Mediums in der Platte fallen und mischen Sie sie vorsichtig durch Schütteln der Schale.

Kultivieren Sie die Zellen in einem Kohlendioxid-Inkubator für weitere 48 bis 72 Stunden. 48 bis 72 Stunden nach der Transfektion, wenn die kultivierten Zellen zu etwa 70 % konfluierend sind, ersetzen Sie das Medium durch MEBM ohne Wachstumsfaktoren und kultivieren Sie die Zellen für weitere 24 Stunden. Nach 24 Stunden Hunger fügen Sie den Zellen ein Synchronisationsmittel in MEBM hinzu.

50% Pferdeserum wird in diesem Experiment als Synchronisationsmittel verwendet. Inkubieren Sie 1-1/2 Stunden in einem Kohlendioxid-Inkubator. Bereiten Sie das Aufnahmemedium vor.

Wenn die Behandlung mit dem Synchronisationsmittel abgeschlossen ist, waschen Sie die Zellen dreimal mit warmem D-PBS. Geben Sie dann zwei Milliliter frisch zubereitetes Aufnahmemedium hinzu, das Luciferin enthält. Verschließen Sie die Schale mit einem sterilisierten Deckglas mit Silikonfett, um eine Verdunstung zu verhindern.

Beschriften Sie das Gericht an der Seite. Stellen Sie die verschlossene Schale in den Sitz im Inneren des Luminometers und führen Sie die Datenerfassung und -analyse durch, wie im Textprotokoll beschrieben. In diesem in vitro-Modell zeigten unbehandelte transient transfizierte Zellen nach der Synchronisation mindestens zwei vollständige Zyklen der Lumineszenzsignalisierung.

Zellen, die der mutagenen NMU ausgesetzt waren, zeigten bei einer Konzentration von 0,5 Millimolaren einen gestörten zirkadianen Rhythmus, der sich in einem Verlust der Lumineszenzsignalgebung nach der Synchronisation widerspiegelte. Die Hemmung der Cert1-Aktivität mit X257 oder Cambinol störte den zirkadianen Rhythmus in ähnlicher Weise, indem sie den nachfolgenden zirkadianen Zyklus dämpfte. Wichtig ist, dass die Zugabe von chemopräventivem MSC zum Kulturmedium den durch 0,5 millimolare NMU gestörten Rhythmus wiederherstellte und die störenden Wirkungen der Cert1-Inhibitoren verhinderte.

In stabil transfizierten Zellen störten sowohl NMU- als auch Cert1-Inhibitoren den zirkadianen Rhythmus. MSC stellte den zirkadianen Rhythmus in Zellen wieder her, die mit NMU, X275 oder Cambinol vorbehandelt waren. Die Biolumineszenzintensität war höher, aber der Rhythmus wurde bei transient transfizierten im Vergleich zu stabil transfizierten Zellen für eine kürzere Zeit aufrechterhalten, aber die Gesamtergebnisse sind konsistent.

Der zelluläre zirkadiane Rhythmus kann mit der LumiCycle-Analysesoftware in zirkadianen Parametern wie Periode und Phase quantifiziert werden. Einmal gemeistert, ist diese Technik einfach, schnell und sicher. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig zu verfolgen, ob sich die Zellen vermehren, da die Transfektionseffizienz in sich nicht teilenden Zellen wie neuronalen Zellen sehr gering ist, in diesem Fall könnte eine Transfektionsmethode mit Virusabstand in Betracht gezogen werden.

Nach der Transfektion können andere Methoden wie die Behandlung mit verschiedenen Chemikalien oder genetische Veränderungen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. wie der zelluläre zirkadiane Rhythmus durch Umwelt- und genetische Faktoren beeinflusst wird. Dieser Assay kann verwendet werden, um die Auswirkungen eines gestörten zirkadianen Rhythmus auf die zelluläre Funktion zu untersuchen. Durch die Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen können wir bessere Interventionsstrategien für Menschen entwickeln, die aufgrund abnormaler Arbeitszeiten ein erhöhtes Brustkrebsrisiko haben.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den In-vitro-Biolumineszenz-Assay zur Bestimmung des zirkadianen Rhythmus in den interessierenden Zellen etablieren und validieren können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem UV-Strahler äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung eines UV-Schutzschildes getroffen werden sollten. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.