Eine optimierte Hämagglutination Inhibition (HI) Assay, Influenza-spezifischen Antikörper-Titer zu quantifizieren
1. Dezember 2017
Die vorgestellten Protokolle wird beschrieben, wie einen Hämagglutination Inhibition Assay Quantifizierung des Influenza-spezifischen Antikörper-Titer von Serumproben von Grippe-Impfstoff Empfängern durchführen. Der erste Test bestimmt optimale virale Antigen-Konzentrationen durch Hämagglutination. Die zweite Probe quantifiziert Influenza-spezifischen Antikörper-Titer Hämagglutination Inhibition.
Das übergeordnete Ziel dieses Hämagglutinationshemmtests besteht darin, die Antikörpertiter gegen bestimmte Viren von Interesse zu messen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Impfstoffforschung zu beantworten, insbesondere hinsichtlich der durch Impfstoffe vermittelten Immunität und Schutzwirkung in verschiedenen Populationen sowie in unterschiedlichen Alters- und Patientengruppen. Die wichtigsten Vorteile dieser Technik sind ihre Genauigkeit und die Möglichkeit, die Titer neutralisierender Antikörper schnell zu bestimmen.
Obwohl diese Methode Einblicke in humane Antikörpertiter ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere Systeme anwenden, beispielsweise auf Antikörpertiter für Mäuseserum oder auch Kulturüberstände. Beginnen Sie damit, 96-Well-Mikrotiterplatten mit den entsprechenden experimentellen Angaben zu beschriften. Drehen Sie dann die Platte in vertikale Ausrichtung und geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 25 µL PBS in jedes Loch, mit Ausnahme des ersten Lochs der unteren hinteren Titrierreihe.
Geben Sie 50 Mikroliter der frisch hergestellten Antigenlösung der gewünschten Probe in die erste Vertiefung der Rücktitrationsreihe, gefolgt von der Zugabe von 25 Mikrolitern RDE-behandelter Serumproben in die ersten Vertiefungen der oberen zehn Reihen. Geben Sie 25 Mikroliter des entsprechenden Antiserums in die erste Vertiefung der 11. Reihe als positive Kontrolle. Übertragen Sie anschließend 25 Mikroliter aus der ersten Vertiefung jeder Reihe in die jeweils folgenden Vertiefungen, um serielle Verdünnungen im Verhältnis 1:2 durchzuführen.
Pipettieren Sie bei jedem Verdünnungsschritt 10 bis 15 Mal auf und ab und entsorgen Sie die letzten 25 Mikroliter aus den letzten Vertiefungen. Fügen Sie anschließend 25 Mikroliter der Antigenlösung in jede Vertiefung der Reihen eins bis elf und jeweils nur 25 Mikroliter PBS in jede Vertiefung der Rücktitrationsreihe hinzu. Klopfen Sie die Platte vorsichtig 10 Mal auf allen vier Seiten, um sie zu mischen.
Anschließend die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur abdecken. Am Ende der Inkubation 50 Mikroliter rote Blutkörperchen-Lösung in jedes Loch geben und die Platte durch erneutes Klopfen mischen. Danach die Platte erneut abdecken und die roten Blutkörperchen gemäß der verwendeten Spezies wie in der Tabelle angegeben inkubieren.
Nachdem die roten Blutkörperchen in die Platte gegeben wurden, ist die für die verwendete Blutart geeignete Inkubationszeit einzuhalten. Eine zu kurze oder zu lange Inkubation führt zu einer falschen Interpretation der Ergebnisse. Am Ende der Inkubation wird die Hämagglutination bewertet, indem die Platte 25 Sekunden lang um 90 Grad gekippt wird, und die Ergebnisse für jedes Loch werden, während die Platte noch gekippt ist, auf einem ausgedruckten Schema der 96-Loch-Platte markiert.
In diesem Experiment wurde die durch den Impfstoff induzierte Antikörperantwort bei 26 gesunden Probanden untersucht, die vor der 24 2015 Influenzasaison einen inaktivierten, trivalenten Influenza-Impfstoff erhielten, der Influenza A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 und B/Massachusetts/O2/2012 enthielt. Es wurde eine kreuzreaktive Immunantwort gegen die Virusstämme A/H3N2/Switzerland/2013 und A/H3N2/Texas/2012 beobachtet, wobei die geometrischen mittleren Hämagglutinationshemmtiter und die induzierte Seroprotektion gegen Influenza A/H3N2/Switzerland/2013 im Vergleich zu Influenza A/H3N2/Texas/2012 signifikant niedriger waren. Nach der Impfung stiegen die Antikörpertiter gegen beide Stämme an, obwohl der Stamm A/H3N2/Switzerland/2013 nicht im Impfstoff enthalten war.
Das virale Hämagglutinin weist ein artabhängiges Potenzial für die Hämaggglutination von Erythrozyten auf. Von Interesse ist, dass Kaninchenblut mit Influenza B keine ordnungsgemäße Hämaggglutination zeigt, während Truthahnblut ein Potenzial für Hämaggglutination mit hohen Titern und geringer Kreuzreaktivität besitzt. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von drei Stunden abgeschlossen werden.
Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das Serum mit RDE zu behandeln, um unspezifische Inhibitoren und unspezifische Bindungen während der Hämagglutination des Virus zu inaktivieren. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie ELISA durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Rolle einzelner pathogen-spezifischer Immunglobuline zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der viralen Immunologie den Weg, um das Verständnis der vaccinebezogenen Immunität bei gesunden und immunsupprimierten Patienten in verschiedenen Altersgruppen weiter zu vertiefen.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen Hämagglutinationshemmtest durchführt, um Influenzastamm-spezifische Antikörpertiter im großen Maßstab zu quantifizieren. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit viralen Antigenen, Tierblut und menschlichen Serumproben äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit im BSL2-Labor getroffen werden sollten, während Sie dieses Verfahren durchführen.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt Protokolle zur Durchführung eines Hämagglutinationshemmungstests zur Quantifizierung influenza-spezifischer Antikörpertiter aus Serumproben vor. Die Methode ist entscheidend für das Verständnis der impfvermittelten Immunität in verschiedenen Populationen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Impfstoffkunde
- Immunologie
- Serologie
Hintergrund
- Der Hämagglutinationshemmtest misst die Antikörperantwort gegen Influenza.
- Er liefert Erkenntnisse zur Impfstoffwirksamkeit und Bevölkerungsimmunität.
- Diese Methode kann auf verschiedene Probenarten angewandt werden, einschließlich humanem und murinem Serum.
- Das Verständnis der Antikörpertiter ist entscheidend zur Bewertung der Impfstoffleistung.
Zweck der Studie
- Quantifizierung von influenzaspezifischen Antikörpertitern bei Impfstoffempfängern.
- Beurteilung der immunologischen Reaktion in verschiedenen Bevölkerungsgruppen.
- Bereitstellung einer schnellen und genauen Methode zur Bestimmung der Titer.
Verwendete Methoden
- Beschriftung von 96-Well-Mikrotiterplatten mit experimentellen Angaben.
- Verwendung einer Mehrkanalpipette, um PBS zu den Vertiefungen hinzuzufügen.
- Durchführung der Hämaggglutination zur Bestimmung optimaler viraler Antigenkonzentrationen.
- Durchführung der Hämaggglutinationshemmung zur Quantifizierung von Antikörpertitern.
Hauptergebnisse
- Der Test quantifiziert Antikörpertiter gegen Influenza genau.
- Er weist die Anwesenheit neutralisierender Antikörper in Serumproben nach.
- Die Ergebnisse können die Entwicklung von Impfstoffen und Strategien im Bereich der öffentlichen Gesundheit unterstützen.
- Die Methode ist an verschiedene Probenarten und Populationen anpassbar.
Schlussfolgerungen
- Der Hämagglutinationshemmtest ist ein zuverlässiges Verfahren zur Messung von Immunantworten.
- Diese Technik verbessert das Verständnis der durch Impfstoffe induzierten Immunität.
- Zukünftige Anwendungen könnten sich auf andere Virusinfektionen und Bevölkerungsgruppen erstrecken.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Eine genaue Quantifizierung von influenzaspezifischen Antikörpertitern ist entscheidend zur Bewertung der impfstoffinduzierten Immunität und zur Unterstützung immunologischer Beurteilungen in der präklinischen und klinischen Entwicklung. Der Hämagglutinationshemmtest (HI-Test) bietet ein standardisiertes, schnelles Verfahren zur Messung neutralisierender Antikörperantworten in unterschiedlichen Populationen und unterstützt datengestützte Go/No-Go-Entscheidungen beim Ausbau der Impfstoffentwicklung. Durch die Möglichkeit, kreuzstammreagierende Effekte zu analysieren und erythrozytäre Komponenten speziesabhängig zu optimieren, erhöht dieser Test die Vorhersagesicherheit in translationalen immunologischen Studien.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht vaccinevermittelte Immunantworten durch Quantifizierung strukturspezifischer Antikörpertiter und unterstützt die mechanistische Risikominimierung antigenetischer Zielstrukturen.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Hämagglutinin als einem zentralen Influenza-Antigen durch Hemmung der viralen Agglutination.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Standardisiert Antigenkonzentrationen mittels Hämagglutinations-(HA-)Titration und gewährleistet reproduzierbare Eingaben für nachgeschaltete HI-Screenings.
- Operativer Wert: Unterstützt Hochdurchsatz-Serum-Screenings unter Verwendung serieller Verdünnungen in Zweifachschritten im 96-Loch-Format und verbessert so die Skalierbarkeit des Assays.
- Wissenschaftlicher Wert: Minimiert Kreuzreaktivitäten durch empirische Auswahl tierischer roter Blutkörperchen (z. B. Meerschweinchen, Truthahn) und erhöht dadurch die Spezifität des Assays für Influenza B und heterologe Stämme.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Misst die impfstoffinduzierte Seroprotektion und geometrische Mittelwerte der Titer (GMTs) in gesunden Kohorten und liefert damit translative Biomarker der Immunogenität.
- Operationaler Wert: Ermöglicht den funktionsübergreifenden Vergleich immunologischer Reaktionen zwischen Altersgruppen und Patientenpopulationen anhand standardisierter Titer-Schwellenwerte.
- Wissenschaftlicher Wert: Erfasst kreuzreagive Immunantworten gegen Nicht-Impfstoff-Stämme (z. B. A/H3N2/Schweiz/2013) und unterstützt so die Entwicklung von Impfstoffen mit breitem Wirkungsspektrum.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der HI-Assay ist in den Immunogenizitäts-Arbeitsablauf von der frühen Entdeckung bis zur präklinischen Validierung integriert und liefert quantitative Antikörpervorgaben, die die Antigenauswahl, die Optimierung von Adjuvantien und Dosis-Wirkungs-Studien unterstützen.
- Entdeckungsbioanalytik: Unterstützt die Hypothesenprüfung der Impfstoffwirksamkeit durch Messung der funktionellen Antikörperinhibition der Hämaggliutination.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Titerergebnisse aus seriellen Verdünnungen und ermöglicht die zuverlässige Bewertung von Wirkstoffen oder Impfstoffkandidaten.
- Analysen: Erstellt Endpunkttiter und geometrische Mittelwerte, die einen statistischen Vergleich der Immunantworten zwischen experimentellen Gruppen erlauben.
- Translationale Forschung: Schafft einen Bezug zur präklinischen Kontinuität, indem die Immunogenität in Tiermodellen (z. B. Mauserum) vor menschlichen Studien bewertet wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine standardisierte Serologieplattform, die auf mehrere Influenzastämme und Impfstoffformate anwendbar ist.
Operationelle und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine vorhersagbare Sicherheit hinsichtlich der durch Impfstoffe induzierten Immunität, indem neutralisierende Antikörpertiter als Korrelat des Schutzes gemessen werden.
- Operationaler Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit des Assays durch standardisierte Antigenpräparation, RDE-behandeltes Serum und artenspezifische Inkubationszeiten von Erythrozyten sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem unzureichende Immunogenität frühzeitig erkannt wird, wodurch das biologische Risiko in späteren Entwicklungsstadien verringert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Impfstoffkandidaten basierend auf der Breite der Querreaktivität der Titer und den Seroprotektionsraten.
Durchführungsaspekte
- Setzt Fachkenntnisse in der Virologie und Serologie voraus, um virale Antigene zu handhaben, RDE-behandeltes Serum herzustellen und die Hämaggliutinations-Endpunkte zu interpretieren.
- Benötigt Zugang zu BSL-2-konformen Einrichtungen für die sichere Handhabung von Influenzaviren und menschlichen/tierischen Blutprodukten.
- Erfordert die Standardisierung der Erythrozytenquellen (z. B. Meerschweinchen, Truthahn, menschliches Typ O), um Kreuzreaktivitäten zu minimieren und artenspezifische Agglutination sicherzustellen.
- Benötigt präzise Zeitkontrollen während der Inkubation der Erythrozyten, um falsch-negative oder falsch-positive Hämaggliutinationsbefunde zu vermeiden.
- Ist auf die Messung funktioneller Antikörperaktivität beschränkt; ermöglicht keine Quantifizierung nicht-neutralisierender oder nicht-funktionaler Immunglobulinklassen ohne zusätzliche komplementäre Assays (z. B. ELISA).
