Eine optimierte Hämagglutination Inhibition (HI) Assay, Influenza-spezifischen Antikörper-Titer zu quantifizieren

Das übergeordnete Ziel dieses Hämagglutinationshemmungsassays ist es, die Antikörpertiter gegen bestimmte Viren von Interesse zu messen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Vakzinologie über die impfstoffvermittelte Immunität und den Schutz in verschiedenen Bevölkerungsgruppen und über verschiedene Alters- und Patientengruppen hinweg zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie genau ist und dass sie eine schnelle Titerbestimmung des Vorhandenseins von neutralisierenden Antikörpern ermöglicht.

Obwohl diese Methode einen Einblick in die Titer menschlicher Antikörper geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf Antikörpertiter für Mausserum und Kulturüberstände. Beginnen Sie mit der Beschriftung von 96-Well-Mikrotiterplatten mit den entsprechenden experimentellen Informationen. Drehen Sie dann die Platte in die vertikale Ausrichtung und fügen Sie mit einer Mehrkanalpipette 25 Mikroliter PBS in jede Vertiefung hinzu, mit Ausnahme der ersten Vertiefung der unteren hinteren Titrationsreihe.

Geben Sie 50 Mikroliter der frisch zubereiteten Antigenlösung von Interesse in die erste Vertiefung der Rücktitrationsreihe, gefolgt von der Zugabe von 25 Mikrolitern RDE-behandelter Serumproben in die ersten Vertiefungen der oberen zehn Reihen. Geben Sie als Positivkontrolle 25 Mikroliter des entsprechenden Antiserums in die erste Vertiefung der 11. Reihe. Sie übertragen 25 Mikroliter aus der ersten Vertiefung jeder Reihe in ihre aufeinanderfolgenden Vertiefungen, um serielle, zweifache Verdünnungen durchzuführen.

Pipettieren Sie für jeden Verdünnungsschritt 10 bis 15 Mal auf und ab und verwerfen Sie die letzten 25 Mikroliter aus den letzten Vertiefungen. Als nächstes fügen Sie 25 Mikroliter der Antigenlösung in jede Vertiefung der Reihen eins bis 11 und 25 Mikroliter PBS nur in jede Vertiefung der hinteren Titrationsreihe hinzu. Klopfen Sie zum Mischen vorsichtig 10 Mal auf alle vier Seiten auf die Platte.

Anschließend den Teller 30 Minuten bei Raumtemperatur abdecken. Geben Sie am Ende der Inkubation 50 Mikroliter Lösung roter Blutkörperchen in jede Vertiefung und mischen Sie die Platte mit weiterem Klopfen. Decken Sie dann die Platte wieder ab und inkubieren Sie die roten Blutkörperchen entsprechend der verwendeten Spezies, wie in der Tabelle dargestellt.

Halten Sie nach dem Hinzufügen der roten Blutkörperchen zur Platte die entsprechende Inkubationszeit für die im Assay verwendete Blutgruppe ein. Eine zu kurze oder zu lange Inkubation führt zu einer falschen Interpretation der Ergebnisse. Beurteilen Sie am Ende der Inkubation die Hämagglutination, indem Sie die Platte 25 Sekunden lang um 90 Grad neigen, und markieren Sie die Ergebnisse für jede Vertiefung, während die Platte noch gekippt ist, auf einem gedruckten Schema der 96-Vertiefungsplatte.

In diesem Experiment wurde die impfstoffinduzierte Antikörperantwort bei 26 gesunden Probanden untersucht, die vor der Grippesaison am 24. 2015 einen inaktivierten, trivalenten Grippeimpfstoff mit Influenza A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 und B/Massachusetts/O2/2012 erhielten. Es wurde eine kreuzreaktive Immunantwort für die Virusstämme A/H3N2/Switzerland/2013 und A/H3N2/Texas/2012 beobachtet, mit signifikant niedrigeren geometrischen mittleren Hämagglutinationshemmungstitern und induzierter Seroprotektion gegen Influenza A/H3N2/Schweiz/2013 im Vergleich zur Influenza A/H3N2/Texas/2012. Nach der Impfung stiegen die Antikörpertiter gegen beide Stämme an, obwohl der Stamm A/H3N2/Schweiz/2013 nicht im Impfstoff vorhanden war.

Virales Hämagglutinin weist ein speziesabhängiges Potenzial für die Hämagglutination von Erythrozyten auf. Interessant ist, dass Meerschweinchenblut bei Influenza B nicht richtig hämagglutiniert und Putenblut das Potenzial für Hämagglutination mit hohen Titern und geringer Kreuzreaktivität aufweist. Einmal gemeistert, kann diese Technik in den drei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, ein Serum mit RDE zu verwenden, um unspezifische Inhibitoren und unspezifische Bindungen während der Hämagglutination des Virus zu inaktivieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie ELISA durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Rolle einzelner erregerspezifischer Immunglobuline zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der viralen Immunologie, um unser Verständnis der impfstoffbedingten Immunität bei gesunden und immunsupprimierten Patienten verschiedener Altersgruppen zu erweitern.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen Hämagglutinationshemmungsassay durchführen, um Influenzastamm-spezifische Antikörpertiter in großem Maßstab zu quantifizieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit viralen Antigenen, tierischem Blut und menschlichen Serumproben äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit in einem BSL2-Labor getroffen werden sollten.