Eine optimierte Hämagglutination Inhibition (HI) Assay, Influenza-spezifischen Antikörper-Titer zu quantifizieren
1. Dezember 2017
Die vorgestellten Protokolle wird beschrieben, wie einen Hämagglutination Inhibition Assay Quantifizierung des Influenza-spezifischen Antikörper-Titer von Serumproben von Grippe-Impfstoff Empfängern durchführen. Der erste Test bestimmt optimale virale Antigen-Konzentrationen durch Hämagglutination. Die zweite Probe quantifiziert Influenza-spezifischen Antikörper-Titer Hämagglutination Inhibition.
Das übergeordnete Ziel dieses Hämagglutinationshemmungsassays ist es, die Antikörpertiter gegen bestimmte Viren von Interesse zu messen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Vakzinologie über die impfstoffvermittelte Immunität und den Schutz in verschiedenen Bevölkerungsgruppen und über verschiedene Alters- und Patientengruppen hinweg zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie genau ist und dass sie eine schnelle Titerbestimmung des Vorhandenseins von neutralisierenden Antikörpern ermöglicht.
Obwohl diese Methode einen Einblick in die Titer menschlicher Antikörper geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf Antikörpertiter für Mausserum und Kulturüberstände. Beginnen Sie mit der Beschriftung von 96-Well-Mikrotiterplatten mit den entsprechenden experimentellen Informationen. Drehen Sie dann die Platte in die vertikale Ausrichtung und fügen Sie mit einer Mehrkanalpipette 25 Mikroliter PBS in jede Vertiefung hinzu, mit Ausnahme der ersten Vertiefung der unteren hinteren Titrationsreihe.
Geben Sie 50 Mikroliter der frisch zubereiteten Antigenlösung von Interesse in die erste Vertiefung der Rücktitrationsreihe, gefolgt von der Zugabe von 25 Mikrolitern RDE-behandelter Serumproben in die ersten Vertiefungen der oberen zehn Reihen. Geben Sie als Positivkontrolle 25 Mikroliter des entsprechenden Antiserums in die erste Vertiefung der 11. Reihe. Sie übertragen 25 Mikroliter aus der ersten Vertiefung jeder Reihe in ihre aufeinanderfolgenden Vertiefungen, um serielle, zweifache Verdünnungen durchzuführen.
Pipettieren Sie für jeden Verdünnungsschritt 10 bis 15 Mal auf und ab und verwerfen Sie die letzten 25 Mikroliter aus den letzten Vertiefungen. Als nächstes fügen Sie 25 Mikroliter der Antigenlösung in jede Vertiefung der Reihen eins bis 11 und 25 Mikroliter PBS nur in jede Vertiefung der hinteren Titrationsreihe hinzu. Klopfen Sie zum Mischen vorsichtig 10 Mal auf alle vier Seiten auf die Platte.
Anschließend den Teller 30 Minuten bei Raumtemperatur abdecken. Geben Sie am Ende der Inkubation 50 Mikroliter Lösung roter Blutkörperchen in jede Vertiefung und mischen Sie die Platte mit weiterem Klopfen. Decken Sie dann die Platte wieder ab und inkubieren Sie die roten Blutkörperchen entsprechend der verwendeten Spezies, wie in der Tabelle dargestellt.
Halten Sie nach dem Hinzufügen der roten Blutkörperchen zur Platte die entsprechende Inkubationszeit für die im Assay verwendete Blutgruppe ein. Eine zu kurze oder zu lange Inkubation führt zu einer falschen Interpretation der Ergebnisse. Beurteilen Sie am Ende der Inkubation die Hämagglutination, indem Sie die Platte 25 Sekunden lang um 90 Grad neigen, und markieren Sie die Ergebnisse für jede Vertiefung, während die Platte noch gekippt ist, auf einem gedruckten Schema der 96-Vertiefungsplatte.
In diesem Experiment wurde die impfstoffinduzierte Antikörperantwort bei 26 gesunden Probanden untersucht, die vor der Grippesaison am 24. 2015 einen inaktivierten, trivalenten Grippeimpfstoff mit Influenza A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 und B/Massachusetts/O2/2012 erhielten. Es wurde eine kreuzreaktive Immunantwort für die Virusstämme A/H3N2/Switzerland/2013 und A/H3N2/Texas/2012 beobachtet, mit signifikant niedrigeren geometrischen mittleren Hämagglutinationshemmungstitern und induzierter Seroprotektion gegen Influenza A/H3N2/Schweiz/2013 im Vergleich zur Influenza A/H3N2/Texas/2012. Nach der Impfung stiegen die Antikörpertiter gegen beide Stämme an, obwohl der Stamm A/H3N2/Schweiz/2013 nicht im Impfstoff vorhanden war.
Virales Hämagglutinin weist ein speziesabhängiges Potenzial für die Hämagglutination von Erythrozyten auf. Interessant ist, dass Meerschweinchenblut bei Influenza B nicht richtig hämagglutiniert und Putenblut das Potenzial für Hämagglutination mit hohen Titern und geringer Kreuzreaktivität aufweist. Einmal gemeistert, kann diese Technik in den drei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, ein Serum mit RDE zu verwenden, um unspezifische Inhibitoren und unspezifische Bindungen während der Hämagglutination des Virus zu inaktivieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie ELISA durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Rolle einzelner erregerspezifischer Immunglobuline zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der viralen Immunologie, um unser Verständnis der impfstoffbedingten Immunität bei gesunden und immunsupprimierten Patienten verschiedener Altersgruppen zu erweitern.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen Hämagglutinationshemmungsassay durchführen, um Influenzastamm-spezifische Antikörpertiter in großem Maßstab zu quantifizieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit viralen Antigenen, tierischem Blut und menschlichen Serumproben äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit in einem BSL2-Labor getroffen werden sollten.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt Protokolle zur Durchführung eines Hämagglutinationshemmungstests zur Quantifizierung influenza-spezifischer Antikörpertiter aus Serumproben vor. Die Methode ist entscheidend für das Verständnis der impfvermittelten Immunität in verschiedenen Populationen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Impfstoffkunde
- Immunologie
- Serologie
Hintergrund
- Der Hämagglutinationshemmtest misst die Antikörperantwort gegen Influenza.
- Er liefert Erkenntnisse zur Impfstoffwirksamkeit und Bevölkerungsimmunität.
- Diese Methode kann auf verschiedene Probenarten angewandt werden, einschließlich humanem und murinem Serum.
- Das Verständnis der Antikörpertiter ist entscheidend zur Bewertung der Impfstoffleistung.
Zweck der Studie
- Quantifizierung von influenzaspezifischen Antikörpertitern bei Impfstoffempfängern.
- Beurteilung der immunologischen Reaktion in verschiedenen Bevölkerungsgruppen.
- Bereitstellung einer schnellen und genauen Methode zur Bestimmung der Titer.
Verwendete Methoden
- Beschriftung von 96-Well-Mikrotiterplatten mit experimentellen Angaben.
- Verwendung einer Mehrkanalpipette, um PBS zu den Vertiefungen hinzuzufügen.
- Durchführung der Hämaggglutination zur Bestimmung optimaler viraler Antigenkonzentrationen.
- Durchführung der Hämaggglutinationshemmung zur Quantifizierung von Antikörpertitern.
Hauptergebnisse
- Der Test quantifiziert Antikörpertiter gegen Influenza genau.
- Er weist die Anwesenheit neutralisierender Antikörper in Serumproben nach.
- Die Ergebnisse können die Entwicklung von Impfstoffen und Strategien im Bereich der öffentlichen Gesundheit unterstützen.
- Die Methode ist an verschiedene Probenarten und Populationen anpassbar.
Schlussfolgerungen
- Der Hämagglutinationshemmtest ist ein zuverlässiges Verfahren zur Messung von Immunantworten.
- Diese Technik verbessert das Verständnis der durch Impfstoffe induzierten Immunität.
- Zukünftige Anwendungen könnten sich auf andere Virusinfektionen und Bevölkerungsgruppen erstrecken.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Eine genaue Quantifizierung von influenzaspezifischen Antikörpertitern ist entscheidend zur Bewertung der impfstoffinduzierten Immunität und zur Unterstützung immunologischer Beurteilungen in der präklinischen und klinischen Entwicklung. Der Hämagglutinationshemmtest (HI-Test) bietet ein standardisiertes, schnelles Verfahren zur Messung neutralisierender Antikörperantworten in unterschiedlichen Populationen und unterstützt datengestützte Go/No-Go-Entscheidungen beim Ausbau der Impfstoffentwicklung. Durch die Möglichkeit, kreuzstammreagierende Effekte zu analysieren und erythrozytäre Komponenten speziesabhängig zu optimieren, erhöht dieser Test die Vorhersagesicherheit in translationalen immunologischen Studien.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht vaccinevermittelte Immunantworten durch Quantifizierung strukturspezifischer Antikörpertiter und unterstützt die mechanistische Risikominimierung antigenetischer Zielstrukturen.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Hämagglutinin als einem zentralen Influenza-Antigen durch Hemmung der viralen Agglutination.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Standardisiert Antigenkonzentrationen mittels Hämagglutinations-(HA-)Titration und gewährleistet reproduzierbare Eingaben für nachgeschaltete HI-Screenings.
- Operativer Wert: Unterstützt Hochdurchsatz-Serum-Screenings unter Verwendung serieller Verdünnungen in Zweifachschritten im 96-Loch-Format und verbessert so die Skalierbarkeit des Assays.
- Wissenschaftlicher Wert: Minimiert Kreuzreaktivitäten durch empirische Auswahl tierischer roter Blutkörperchen (z. B. Meerschweinchen, Truthahn) und erhöht dadurch die Spezifität des Assays für Influenza B und heterologe Stämme.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Misst die impfstoffinduzierte Seroprotektion und geometrische Mittelwerte der Titer (GMTs) in gesunden Kohorten und liefert damit translative Biomarker der Immunogenität.
- Operationaler Wert: Ermöglicht den funktionsübergreifenden Vergleich immunologischer Reaktionen zwischen Altersgruppen und Patientenpopulationen anhand standardisierter Titer-Schwellenwerte.
- Wissenschaftlicher Wert: Erfasst kreuzreagive Immunantworten gegen Nicht-Impfstoff-Stämme (z. B. A/H3N2/Schweiz/2013) und unterstützt so die Entwicklung von Impfstoffen mit breitem Wirkungsspektrum.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der HI-Assay ist in den Immunogenizitäts-Arbeitsablauf von der frühen Entdeckung bis zur präklinischen Validierung integriert und liefert quantitative Antikörpervorgaben, die die Antigenauswahl, die Optimierung von Adjuvantien und Dosis-Wirkungs-Studien unterstützen.
- Entdeckungsbioanalytik: Unterstützt die Hypothesenprüfung der Impfstoffwirksamkeit durch Messung der funktionellen Antikörperinhibition der Hämaggliutination.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Titerergebnisse aus seriellen Verdünnungen und ermöglicht die zuverlässige Bewertung von Wirkstoffen oder Impfstoffkandidaten.
- Analysen: Erstellt Endpunkttiter und geometrische Mittelwerte, die einen statistischen Vergleich der Immunantworten zwischen experimentellen Gruppen erlauben.
- Translationale Forschung: Schafft einen Bezug zur präklinischen Kontinuität, indem die Immunogenität in Tiermodellen (z. B. Mauserum) vor menschlichen Studien bewertet wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine standardisierte Serologieplattform, die auf mehrere Influenzastämme und Impfstoffformate anwendbar ist.
Operationelle und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine vorhersagbare Sicherheit hinsichtlich der durch Impfstoffe induzierten Immunität, indem neutralisierende Antikörpertiter als Korrelat des Schutzes gemessen werden.
- Operationaler Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit des Assays durch standardisierte Antigenpräparation, RDE-behandeltes Serum und artenspezifische Inkubationszeiten von Erythrozyten sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem unzureichende Immunogenität frühzeitig erkannt wird, wodurch das biologische Risiko in späteren Entwicklungsstadien verringert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Impfstoffkandidaten basierend auf der Breite der Querreaktivität der Titer und den Seroprotektionsraten.
Durchführungsaspekte
- Setzt Fachkenntnisse in der Virologie und Serologie voraus, um virale Antigene zu handhaben, RDE-behandeltes Serum herzustellen und die Hämaggliutinations-Endpunkte zu interpretieren.
- Benötigt Zugang zu BSL-2-konformen Einrichtungen für die sichere Handhabung von Influenzaviren und menschlichen/tierischen Blutprodukten.
- Erfordert die Standardisierung der Erythrozytenquellen (z. B. Meerschweinchen, Truthahn, menschliches Typ O), um Kreuzreaktivitäten zu minimieren und artenspezifische Agglutination sicherzustellen.
- Benötigt präzise Zeitkontrollen während der Inkubation der Erythrozyten, um falsch-negative oder falsch-positive Hämaggliutinationsbefunde zu vermeiden.
- Ist auf die Messung funktioneller Antikörperaktivität beschränkt; ermöglicht keine Quantifizierung nicht-neutralisierender oder nicht-funktionaler Immunglobulinklassen ohne zusätzliche komplementäre Assays (z. B. ELISA).
