Name: Anreicherung von Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Lernen Sie eine Fraktionierungsmethode zur Anreicherung von waschmittel-unlöslichen Proteinaggregaten aus postmortem menschlichem Gehirngewebe. Diese Technik ermöglicht die effiziente Isolierung fehlgefalteter Proteine für die Neurodegenerationsforschung.

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Die Autoren danken Dr. Jim Lah und Allan Levey, Emory Universitätsklinik für Neurologie, für die hilfreichen Kommentare und Anregungen. Diese Arbeit wurde teilweise finanziert durch die Beschleunigung der Medizin Partnerschaft Grant (U01AG046161-02), die Emory Alzheimer Disease Research Center (P50AG025688) und eine National Institute on Aging gewähren (R01AG053960-01) N.T.S. Diese Forschung wurde auch teilweise durch die Neuropathologie Kern von Emory Neurowissenschaften NINDS Core Facilities Grant, P30NS055077 unterstützt.

Ethik-Erklärung: alle Hirngewebe stammen aus der Emory Alzheimer &#39; s Disease Research Center (ADRC) Brain Bank. Post-mortem Gewebe unter richtigen institutionellen Review Board (IRB) Protokolle erworben wurden.
 1. Homogenisierung und Fraktionierung <ol><li>Gewebe Auswahl Hinweis: Frozen Post-mortem frontalen Kortex Gewebe aus gesunden Kontrolle (Ctl) und pathologisch bestätigten AD-Fälle wurden ausgewählt von der Emory ADRC Gehirn Bank (n = 2). Post-Mortem neuropathologische Auswertung der Amyloid-Plaques Verteilung wurde entsprechend des Konsortiums, eine Registrierung für Alzheimer zu etablieren durchgeführt &#39; s Krankheit semi-quantitativen Kriterien 24, scoring, obwohl neurofibrillären Gewirr Pathologie wurde gemäß der Braak-staging-System bewertet. 16 <ol><li>erhalten Post-mortem Hirngewebe von gesunden Kontrolle (Ctl) und pathologisch eingefroren bestätigt AD-Fälle. Verwendung von Containern von Trockeneis, Zange und einer Rasierklinge, Verbrauchsteuern ~ 250 mg Teile der grauen Substanz aus jede Gewebeprobe auf tarierten Einweg wiegen Boote, kümmert sich um Auftauen des Gewebes zu verhindern. Nehmen Sie das Gewicht jedes Stückes, homogenisiert werden.</li>
		<li>Verbrauchsteuern ~ 250 mg der grauen Zellen mit Zange und gestochen von visuell inspizieren, um die Schnittstelle zwischen der äußeren graue Substanz und inneren weißen Substanz zu finden. Vermeiden Sie weiße Substanz und was noch wichtiger ist, alle großen Blutgefäße oder blutigen Regionen, Hirnhäute oder Arachnoidea Mater. Halten Sie das Gewebe eingefroren während des Schneidprozesses indem arbeiten schnell und häufig mit einem Gewicht von Boot mit Hirngewebe in Polystyrol-Behälter mit trocken Ice</li>
		<li>Datensatz das exakte Gewicht der grauen Substanz, die aus jedem gefrorenen Stück mit Hilfe einer Analysenwaage herausgeschnitten. Berechnen Sie das Volumen des wenig Salz (LS) Puffer für Dounce Homogenisierung (5 mL/g oder 20 % w/V) benötigt (siehe Tabelle 1).</li>
		<li>Vorbereitung 10 mL LS Puffer mit 1 x Protease und Phosphatase-Inhibitor cocktail und chill auf Eis.</li>
		<li>Entfernen Sie wog Gewebe und mit einem Gewicht von Boot aus Trockeneis und Würfel in etwa 2 x 2 mm Stücke wie es taut. Transfer zu einem 2 mL vorgekühlt Dounce Homogenisator Schlauch auf Ice</li>
		<li>5 mL/g (20 % w/V) der eiskalten wenig Salz (LS) Puffer mit 1 X Protease und Phosphatase-Inhibitor cocktail hinzufügen.</li>
		<li>Homogenize das Hirngewebe auf Eis mit etwa 10 Schläge von hoher Bodenfreiheit Stößel A und 15 Hübe der niedrige Clearance Stößel B.</li>
		<li>Alle Homogenat auf ein 2 mL Polypropylen-Rohr mit einem Glas Pasteurpipette übertragen. Beschriften der Röhrchen mit &#8220; TH &#8221; (insgesamt Homogenat), das Gewebe Fall Nummer und homogenisierte Volumen. aliquoten 0,8 mL in einem beschrifteten 1,5 mL-Tube. Jede überschüssige Homogenat kann ähnlich sein, regelmÄÑig und gespeicherte bei-80 ° c</li>
		<li>Zu je 0,8 mL Aliquoten, bzw. 100 µL 5 M NaCl und 10 % (w/V) Sarkosyl zu Konzentrationen von 0,5 M und 1 % w/V, hinzufügen. Mischen Sie Rohre gut durch Umkehrung und inkubieren Sie auf Eis für 15 min. Label Rohre mit &#34; TH-S &#34; (insgesamt Homogenat-Sarkosyl) darauf hin, dass die Homogenates in Sarkosyl-Puffer (Tabelle 1).</li>
		<li>Beschallen jedes Rohr für drei 5 s-Pulse bei 30 % Amplitude auf Eis (maximale Intensität = 40 %) mit einer Sonde Microtip.</li> <li>bestimmen die Proteinkonzentrationen von der Homogenates mit der Bicinchoninic Säure (BCA) assay 25 Methode. 
		Hinweis: Die durchschnittliche Proteinkonzentration von TH-S Homogenates in 5 mL LS pro Gramm Gewebe vorbereitet ist 15-20 mg/mL. Die Homogenates fraktioniert sofort oder bis zur Verwendung bei-80 ° C gelagert werden kann.</li>
		<li>Verdünnen TH-S Homogenates bis 10 mg/mL mit eiskalten Sark Puffer (Tabelle 1) mit 1 x Phosphatase, Protease-Inhibitoren.</li>
		<li>Transfer 5 mg Protein (0,5 mL) von jeder TH-S Homogenat in 500 µL Polycarbonat Ultrazentrifugen Tuben und paar-Balance mit Sark-Puffer. Laden Sie Rohre in einem vorgekühlt Rotor und Ultrazentrifugen 180.000 x g für 30 min bei 4 ° c Übertragung Sarkosyl lösliche Überstände (S1) auf 1,5 mL Röhrchen und Lagern bei-80 ° c 
		Hinweis: (Optional-Waschanlagen) fügen Sie 200 µL Sark-Puffer, der Ultrazentrifuge Rohre mit Waschmittel-unlösliche Fraktionen (P1) und verdrängen die Pellets (P1) von der Unterseite der Ultrazentrifuge Rohre mit einer Pipettenspitze 200 µL.</li>
		<li>Kurz Puls-Spin die invertierten Rohre für 2-3 s (&#8804; 2.500 X g) auf einem Microcentrifuge der Pellets (P1) und Puffer auf die 1,5 mL Röhrchen unten übertragen. Aufschwemmen der unlöslichen Pellets (P1) im Sark-Puffer durch Pipettieren rauf und runter um sicherzustellen das Pellet wird gestört,.</li>
		<li>Paar-Balance und Zentrifuge bei 180.000 x g für eine zusätzliche 30 min bei 4 ° c</li>
		<li>Verwerfen den optionalen waschen überstand (S2) und inkubieren Sie die Sarkosyl-unlösliche Pellets (P2) in 50-75 µL Harnstoff Puffer (Tabelle 1) mit 1 x PIC (Protease und Phosphatase-Inhibitor cocktail) für 30 min bei Raumtemperatur zu solubilisieren die Pellet. 
		Hinweis: Warme Harnstoff Puffer auf Raumtemperatur vor Gebrauch SDS Niederschlag zu vermeiden. Für Waschmittel-Sensitive Anwendungen weglassen SDS aus Harnstoff Puffer und in niedrigen Salz Puffer betrachten waschen das unlösliche Pellet (P2), bevor in Harnstoff Puffer resuspending.</li>
		<li>Übertragen die resuspendierte Pellets (P2) auf 0,5 mL Röhrchen und verwenden Sie kurze (1 s) Microtip Beschallung bei 20 % Amplitude (maximale Intensität = 40 %), voll die Pellets solubilisieren.</li>
		<li>Bestimmen die Proteinkonzentrationen von Sarkosyl löslich (S1) und unlösliche (P2) Brüche mit der BCA assay Methode. Diese Fraktionen sofort verwenden oder bei-80 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunoblotting <ol><li>Western Blot Hinweis: Western blotting nach zuvor gemeldeten Verfahren mit leichten Modifikationen durchgeführt wurde. 5 , 10 <ol><li>bereiten 40 µg Proben von insgesamt Homogenates (TH-S), Sark-löslich (S1) und Sark-unlösliche (P2) Brüche in 1 X Laemmli SDS-Page-Probenpuffer mit 5 mM DÄMMUND pH 7. Inkubieren Sie Proben bei 95 ° C für 5 min.</li>
		<li>Last Proben auf ein Fertigteil 10-Brunnen 4-12 % Bis-Tris SDS-PAGE gel. Bei 80 V für die ersten Zentimeter (10 min) und 120 V für den Rest (60 min) oder bis die Tracking-Farbstoff den Boden des Gels erreicht electrophorese.</li>
		<li>Verwenden Sie frischen Rasierklinge und Gel Messer auf Split-die vorgegossenen Gel-Kassette offen. Sanft die Kämme und ganz unten das Gel mit einer frischen Rasierklinge wegschneiden.</li>
		<li>Aufschwemmen der unlöslichen Pellets (P1) in 200 µl Sark-Puffer mit 1 X PIC durch Pipettieren rauf und runter.</li>
		<li>Übertragung an eine 0,2 µm Nitrozellulose-Membran mit einer trockenen Übertragungsmethode auf ein Blot Maschine (siehe der Materialtabelle).</li>
		<li>Blockieren die Membran in blockierende Puffer (BB) ohne Tween 20 für 30 min, gefolgt mit BB mit 0,05 % Tween 20 (BB/T) für 30 min. Nach der Blockierung, spülen Sie die Membran in TBS/T (0,1 % Tween 20) für 5 min um überschüssige blockierende Puffer entfernen.</li>
		<li>Bereiten 1:1,000 Verdünnungen der primären Antikörper pT231, Tau-2 (Pan Tau), AT8 und EEA1 in BB/T (0,05 % Tween 20).</li>
		<li>Brüten die Membranen in Primärantikörper Lösung über Nacht bei 4 ° C mit kreisförmigen Bewegung. Spülen Sie die Membran in TBS/T für 3 x 15 min.</li>
		<li>Sonde die Membran mit einer Verdünnung 1: 20.000 Eindringmittel beschriftet in der Nähe von IR Sekundärantikörper in BB/T für 60 min bei Raumtemperatur in Dunkelheit auf Shaker. Spülen Sie die Membran für 3 x 10 min in TBS/T und 2 x 5 min in El</li>
		<li>Scannen die Membran, die über eine Infrarot imaging-System bei der entsprechenden Erregung Wellenlänge (z.B. 700 nm (Rot-Kanal) für Infrarot-Farbstoff 680 Ziege Anti-Maus IgG (H + L) sekundär- und 800 nm (Grün-Kanal) für Infrarot-Farbstoff 790 Esel Anti-Kaninchen IgG (H + L (sekundäre)).</li>
		<li>Verwenden die Software zur Abbilderstellung Signalintensitäten zu quantifizieren und Densitometrie Messungen gemäß den Hersteller &#39; Anweisungen, Auto-Hintergrund zu gewährleisten wird voraussichtlich den gesamten Hintergrund durchschnittliche.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier wir vorstellen und diskutieren eine abgekürzte Einzelschritt Waschmittel-Fraktionierung-Protokoll, die für eine Vielzahl von experimentellen Anwendungen von Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analysen bis hin zu funktionellen Protein misfolding assays und westliche Beflecken. 5 , 6 , 7 , 10 dieser Methodik ist vielleicht die meisten wirksam, wenn Sie zur Untersuchung neurodegenerative...

Neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Chorea Huntington (HD), Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und die eng verwandten Prion-Krankheiten sind gekennzeichnet durch die allmähliche Anhäufung von proteinopathies Waschmittel-unlösliche Aggregate im Gehirn mit begleitenden kognitiven ablehnen. 1 , 2 diese gemeinsame pathologische Funktion wird gedacht, um eine zentrale Rolle in der Ätiologie und Pathophysiologie dieser neurodegenerativen Krankheiten. 2 diese Aggregate bestehen typischerweise aus Polymeren Amyloid Fasern, die zusammengesetzt sind, sich wiederholender Einheiten der fehlgefaltete Protein ausstellenden Kreuz β-Struktur. 1 , 2 , 3 , 4 biochemisch, Amyloid Aggregate sind sehr widerstandsfähig gegen chemische oder thermische Denaturierung und Solubilisierung,3 stellt besondere Herausforderungen an ihre Reinigung, Analyse und über traditionelle biochemischen Techniken zu studieren. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 es überrascht nicht, wurde die Waschmittel-unlösliche Proteinfraktion viel Forschungsschwerpunkt in der Pathophysiologie der neurodegenerativen Erkrankungen mit der Anhäufung von fehlgefaltete Proteine. 6 , 12 , 13 , 14
Biochemische Fraktionierung Techniken wurden oft genutzt, um die Reinigungsmittel-unlösliche Fraktion aus Post-mortem Gehirn Homogenates bereichern. 6 , 12 , 13 , 14 eine der am häufigsten verwendeten Methoden beinhaltet die sequentielle Extraktion von Gewebe Homogenates mit Puffern und Reinigungsmittel erhöhen Stringenz, gefolgt von Ultrazentrifugation, die löslichen und unlöslichen Anteile zu partitionieren. Eine häufig verwendete sequentielle Fraktionierung Protokoll6,14 beinhaltet die Homogenisierung der gefrorene Gewebeproben in einem Waschmittel-freie wenig Salz (LS)-Puffer und die daraus resultierende unlösliche Pellets werden dann nacheinander mit extrahiert Puffer mit hohen Salz, nichtionischen Detergentien, hohen Saccharose, wie Ionischen Detergentien und schließlich Chaotropes Harnstoff. 6 , 14 eine offensichtliche Nachteil solch eine sequentielle Fraktionierung Protokolle ist die beträchtliche Zeit und Arbeit Engagement erforderlich, um sie abzuschließen. Einschließlich der Homogenisierung und Ultrazentrifugation, eine typische 5-stufige Fraktionierung Protokoll dauert mehrere Stunden oder sogar Tage dauern. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 darüber hinaus möglichst viele pathologische Proteinaggregaten unlöslich in allen außer den härtesten Bedingungen19,20 bleiben die meisten der erzeugten Brüche sind nur von begrenztem Wert. Somit sind die weniger strengen Fraktionierung Schritte nutzen hohe Salzkonzentrationen und nichtionische Detergentien weitgehend überflüssig.
Frühere Studien haben gezeigt, dass die ionische Waschmittel N-Natriumlaurylsulfat-Sarkosin (Sarkosyl) ein ausgezeichneter Kandidat für einen vereinfachten einstufigen Waschmittel Fraktionierung Protokoll ist. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 als denaturierenden Waschmittel, Sarkosyl ist streng genug, um die überwiegende Mehrheit der nativ gefaltete Proteine im Gehirn anderweitig ohne Gefäss-fehlgefaltete Protein-Aggregate bestehend aus Beta-Amyloid (Aβ),6,11 phosphorylierten Tau (pTau),6 TAR DNA-bindendes Protein 43 (TDP-43),14 Alpha-Synuclein,12,13 Scrapie,23 oder U1 small nuclear Ribonucleoproteins (U1 SnRNPs) wie U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 Da Sarkosyl weniger streng als die allgegenwärtigen anionische Detergenzien Dodecyl Natriumsulfat (SDS) ist, bewahrt es weniger robuste Oligomere Formen von fehlgefaltete Protein-Aggregate, die SDS-Behandlung nicht standhalten können. 9
Zuvor beschrieben wir eine abgekürzte Waschmittel-Fraktionierung-Protokoll, das vergleichbar mit aufwendiger sequentielle Fraktionierung Methoden Ergebnisse erzielt. 5 durch die weniger strenge Fraktionierung Schritte auslassen, konnten wir ein facile Einzelschritt Fraktionierung-Protokoll für die Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn zu entwickeln. 5 dieses ausführliche Protokoll beschriebenen eignet sich gut für eine Vielzahl von experimentellen Anwendungen reichen von Western blotting und Massenspektrometrie-basierte Proteomics, funktionsfähiges Protein misfolding und Aggregation seeding assays. 5 , 6 , 21

<table><tbody><tr><td>Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail, EDTA-frei (100X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>78441</td><td>Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail</td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator System (Ultraschallgerät)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB505110</td><td>Mikrospitzen-Ultraschallgerät</td></tr><tr><td>Optimax TLX Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>361545</td><td>gekühlte Ultrazentrifuge</td></tr><tr><td>TLA120.1 Rotor</td><td>Beckman</td><td>Coulter 362224</td><td>Ultrazentrifugenrotor</td></tr><tr><td>500 ul (8 x 34 mm) Polycarbonat-Röhrchen, dickwandig</td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td>Ultrazentrifugenröhrchen für TLA120.1 Rotor</td></tr><tr><td>4X SDS Probenpuffer</td><td>Hausgemachte</td><td>N/A</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TCEP-Lösung, pH-neutral</td><td>Thermo Fisher</td><td>77720</td><td>Reduktionsmittel</td></tr> <tr><td>(TBS) Blockierungspuffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>37542</td><td>Blockierungspuffer</td></tr> <tr><td>(TBS) Blockierungspuffer + 0,05 % Tween 20</td><td>Thermo Fisher</td><td>37543</td><td>Blockierungspuffer und Antikörperverdünnungsmittel</td></tr><tr><td>4-12 % Bolt Bis-Tris Plus Gele, 10 Well</td><td>Thermo Fisher</td><td>NW04120BOX</td><td>vorgefertigte SDS-PAGE-Gele</td></tr><tr><td>MES SDS Laufpuffer (20X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>B0002</td><td>SDS-PAGE Laufpuffer</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosin-Natriumsalz (Sarkosyl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5777-50G</td><td>Reinigungsmittel</td></tr><tr><td>Anti-Tau-2 (pan tau) Antikörper</td><td>Chemicon</td><td>MAB375</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Antiphospho-Threonin 231 Tau Antikörper</td><td>Millipore</td><td>MAB5450</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Antiphospho-seroin 202 und Threonin 205 Tau Antikörper (AT8)</td><td>Thermo Fisher</td><td>MN1020</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-frühes Endosomen-Antigen 1 (EEA1) Antikörper</td><td>abcam</td><td>ab2900</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Sekundärantikörper</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21058</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 790 Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Sekundärantikörper</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11374</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>iBlot2 Dry Blotting System</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB21001</td><td>Geltransfer</td></tr><tr><td>iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB23002</td><td>Gel-Transfer</td></tr></tbody></table>

anreicherung von waschmittel-unlösliche aggregate von post-mortem gehirn

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

In dieser Studie beschreiben wir eine abgekürzte Einzelschritt Fraktionierung-Protokoll für die Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn. Das Ionische Waschmittel N-Natriumlaurylsulfat-Sarkosin (Sarkosyl) solubilisiert effektiv nativ gefaltete Proteine im Gehirngewebe, so dass die Anreicherung von Waschmittel-unlösliche Aggregate aus einer breiten Palette von neurodegenerativen Proteinopathies, wie Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson und Amyotrophe Lateralsklerose und Prion-Krankheiten. Menschlichen Kontrolle und Post-mortem Hirngewebe AD wurden homogenisiert und sedimentierte durch Ultrazentrifugation in Anwesenheit von Sarkosyl Waschmittel-unlösliche Aggregate einschließlich pathologischer phosphorylierten Tau, das Herzstück der neurofibrillären bereichern Verwicklungen in AD. Westliche Beflecken, demonstriert die differenzielle Löslichkeit der aggregierten phosphoryliert-Tau und die Waschmittel-lösliche Protein, frühen Endosom Antigen 1 (EEA1) in Steuerung und AD Gehirn. Proteomic Analysen ergaben auch Bereicherung der β-Amyloid (Aβ), Tau, snRNP70 (U1 - 70 K), und Apolipoprotein E (APOE) in die Sarkosyl-unlösliche Bruchteilen von AD Gehirn im Vergleich zu denen der Kontrolle, konsistent mit früheren Gewebe Fraktionierung Strategien . Somit eignet sich dieses einfache Bereicherung-Protokoll für eine Vielzahl von experimentellen Anwendungen reichen von Western blotting und funktionsfähiges Protein Co Aggregation Assays, Massenspektrometrie-basierte Proteomics.

Das abgekürzte einstufigen Sarkosyl-Fraktionierung-Protokoll wurde verwendet, um Waschmittel-unlösliche Aggregate aus Kontrolle und AD Post-mortem Gehirn (Abbildung 1) zu bereichern. Proteine aus TH-S, S1, S2 und P2 Fraktionen wurden gelöst durch SDS-PAGE, für 15 min in Coomassie Blau Fixativ Puffer gefolgt von schonende Färbung mit Coomassie Brilliant Blue G-250 Färbung Puffer fest. Die Wiederfreisetzung Schritt ist optional, da gab es nicht nachweisbare Niv...

Eine abgekürzte Fraktionierung-Protokoll für die Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn wird beschrieben.

Anreicherung von Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Das übergeordnete Ziel dieses Fraktionierungsprotokolls besteht darin, detergentiunlösliche Proteinaggregate aus menschlichem postmortalen Hirngewebe anzureichern. Diese Methode kann daher dabei helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Neurodegeneration zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung und Charakterisierung fehlgefalteter Proteinaggregate bei Erkrankungen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der schnellen und effizienten Anreicherung sowie Isolierung detergentiunlöslicher Proteinaggregate aus Hirngewebe innerhalb kurzer Zeit. Tram Nguyen, eine Technikerin aus meinem Labor, wird dieses Verfahren demonstrieren. Gewinnen Sie gefrorenes postmortales Gehirngewebe von gesunden Kontrollpersonen und pathologisch bestätigten Alzheimer-Patienten. Entfernen Sie mit einer Pinzette und einer Rasierklinge jeweils etwa 250 Milligramm graue Substanz aus jeder Gewebeprobe. Lassen Sie das Gehirnsegment eine Minute lang antauen.Würfeln Sie nun ein Gewebestück während des Auftauens in etwa zwei Millimeter große Stücke. Überführen Sie es in ein zwei Milliliter fassendes, vorab gekühltes Dounce-Homogenisierergefäß auf Eis. Achten Sie darauf, weiße Substanz und größere Blutgefäße zu vermeiden.Arbeiten Sie schnell und legen Sie das Gewebe auf TARE Einweg-Wiegeschälchen. Achten Sie darauf, das Gewebe daran zu hindern, indem Sie das Wiegeschälchen mit dem Gehirngewebe regelmäßig in Polystyrolbehälter mit Trockeneis stellen. Nachdem alle erforderlichen Gewebestücke präpariert und gewogen wurden, nehmen Sie ein Wiegeschälchen mit einem Gewebestück vom Trockeneis.Fügen Sie anschließend fünf Milliliter eiskalten Puffer mit niedrigem Salzgehalt, Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail pro Gramm Gewebe hinzu und homogenisieren Sie auf Eis mit etwa 10 Hubbewegungen des Stößels A mit großem Spalt und 15 Hubbewegungen des Stößels B mit kleinem Spalt. Überführen Sie anschließend jeden Homogenatansatz mit einer neun Zoll langen Glas-Pasteur-Pipette in ein beschriftetes zweimilliliter-Polypropylenröhrchen. Portionieren Sie das verbleibende Homogenat in ähnlicher Weise in zusätzliche beschriftete 1,5-Milliliter-Röhrchen zur Lagerung bei minus 80 Grad Celsius. Um mit der Fraktionierung fortzufahren, geben Sie 100 Mikroliter fünfmolares Natriumchlorid und 100 Mikroliter 10-prozentiges Sarkosyl zu jedem 0,8-Milliliter-Aliquot hinzu.Sorgf&auml;ltig durch Umst&uuml;rzen mischen. Anschlie&szlig;end 15 Minuten auf Eis inkubieren. Nach der Inkubation einen Beschallungsger&auml;t mit Mikrotip-Probe verwenden, um drei f&uuml;nfsek&uuml;ndige Impulse bei 30 Prozent Amplitude abzugeben.Nach der Bestimmung der Protein-Konzentrationen der Homogenate mittels der Bicinchoninsäure-Methode, kaltes Sarkosyl-Puffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren zu jeder Probe hinzufügen, um eine Endkonzentration von 10 Milligramm pro Milliliter zu erreichen. Anschließend 500 Mikroliter jeder Probe in 500-Mikroliter-Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen überführen. Die Röhrchen in einen vorab gekühlten Rotor geben und 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit 180.000 × g ultrazentrifugieren.Nach der Zentrifugation die sarkosyl-löslichen Überstände in 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen und bei minus 80 Grad Celsius lagern. 200 Mikroliter Sark-Puffer zu den Ultrazentrifugenröhrchen hinzufügen, die die detergent-unlöslichen P1-Fraktionen enthalten, und mit der Pipettenspitze die Pellets vom Boden der Ultrazentrifugenröhrchen lösen. Anschließend die resuspendierten P1-Pellets in neue 500-Mikroliter-Ultrazentrifugenröhrchen überführen, paarweise ausbalancieren und bei vier Grad Celsius weitere 30 Minuten bei 180.000 × g zentrifugieren.Entsorgen Sie das Überstand-S2. Geben Sie anschließend 50 bis 75 Mikroliter Harnstoffpuffer mit Protease- und Phosphatasehemmcocktail zu den Sarkosyl-unlöslichen Pellets hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur, um das P2-Pellet aufzulösen. Nach der Inkubation überführen Sie die wiederaufgeschwemmten P2-Pellets in beschriftete 0,5-Milliliter-Röhrchen und lösen die Pellets vollständig auf, indem Sie eine kurze einsekündige Mikrotip-Sonikation mit 20 Prozent Amplitude anwenden.Bestimmen Sie die Protein-Konzentrationen der Sarkosyl-löslichen und Sarkosyl-unlöslichen Fraktionen mithilfe der BCA-Assay-Methode. Bereiten Sie 40-Mikrogramm-Proben der gesamten Homogenat-Sarkosyl-löslichen S1- und Sarkosyl-unlöslichen P2-Fraktionen in 1x Laemmli-SDS-PAGE-Probenpuffer mit fünf Millimolar TCEP bei pH sieben vor. Inkubieren Sie die Proben bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten.Die Proben auf vorgefertigte 10-Well-4- bis 12-Prozent-Bis-Tris-SDS-PAGE-Gele auftragen. Die Elektrophorese zunächst bei 80 Volt für den ersten Zentimeter und anschließend etwa eine Stunde lang bei 120 Volt durchführen oder bis der Lauffarbstoff das untere Ende des Gels erreicht hat. Die Kassetten der vorgefertigten Gele in destilliertes Wasser eintauchen und dann mit einer frischen Rasierklinge und einem Gelschaber öffnen.Schneiden Sie vorsichtig die Kämme und den unteren Rand jedes Gels mit einer frischen Rasierklinge ab. Übertragen Sie die Proben mithilfe einer Trockenübertragungsmethode auf einer Blotting-Maschine auf 0,2-Mikrometer-Nitrocellulosemembranen. Blockieren Sie die Membranen nach der Übertragung 30 Minuten lang in Blockpuffer ohne Tween-20, gefolgt von 30 Minuten in Blockpuffer mit 0,5 Prozent Tween-20.Nach der Blockierung spülen Sie die Membranen fünf Minuten lang mit TBS mit 0,1 Prozent Tween-20, um überschüssigen Blockierpuffer zu entfernen. Bereiten Sie 1:1.000-Verdünnungen der primären Antikörper im Blockierpuffer mit 0,5 Prozent Tween-20 vor. Hier werden Phospho-Tau pT231 und EEA1 verwendet.Die Membranen über Nacht bei vier Grad Celsius mit primärem Antikörper unter kreisförmiger Agitation inkubieren. Am nächsten Tag die Membranen dreimal für jeweils 15 Minuten mit TBS mit 0,1 Prozent Tween-20 spülen. Die Membranen mit einer 1:20.000-Verdünnung des fluoreszenzmarkierten nahinfraroten sekundären Antikörpers und Blockierpuffer mit 0,5 Prozent Tween-20 für 60 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln auf einem Schüttler behandeln.Nach der Inkubation die Membran dreimal für jeweils 10 Minuten in TBS mit 0,1 Prozent Tween-20 und anschließend zweimal für jeweils fünf Minuten in TBS spülen. Die Membran mit einem Infrarot-Imaging-System bei der geeigneten Anregungswellenlänge für den verwendeten sekundären Antikörper scannen. Dieses mit Coomassie gefärbte Gel zeigt 20 mcg Protein aus den Fraktionen TH-S, S1, S2 und P2.Die Western-Blot-Analyse zeigt eindeutig, dass im AD-Gehirn das pathologische phosphorylierte Tau mit hohem Molekulargewicht sarkosylunlösliche Aggregate bildet und nur sehr wenig phosphoryliertes Tau in den sarkosyllöslichen Fraktionen verbleibt. EEA1 wurde als allgemeiner Marker für die meisten nativen, nichtpathologischen Proteine verwendet, die von Natur aus sarkosyllöslich sind und sowohl im Kontroll- als auch im AD-Gehirn in die S1-Fraktion übergehen. Bemerkenswerterweise war das Signal für EEA1 in der löslichen Fraktion geringfügig schwächer als in der TH-S-Fraktion, was darauf hindeutet, dass ein kleiner Teil von EEA1 wahrscheinlich sarkosylunlöslich ist, jedoch unterhalb der Nachweisgrenze des Western Blots mit diesem spezifischen Antikörper liegt.Diese Abbildung zeigt die proteomische Analyse pathologischer Alzheimer-Demenz-Proteine mithilfe eines Einzelschritt- oder Mehrschritt-Fraktionierungsprotokolls. Die Fraktionierung in einem einzigen Schritt kann für Proteine mit geringer Häufigkeit vorteilhaft sein, da die gesamten Probenverluste deutlich reduziert werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, so viel weiße Substanz wie möglich aus dem Gehirngewebe herauszuschneiden.Mit dieser Methode können anschließend andere Verfahren wie die massenspektrometriebasierte Proteomik durchgeführt werden, um die kernbeständigen Proteinbestandteile pathologischer Aggregate in ihren degenerativen Erkrankungen zu identifizieren und zu charakterisieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Die zellulären Heterogenität von Hirngewebe stellt eine erhebliche Einschränkung für das Studium der epigenetischen Markierungen in Chromatin, da die meisten Assays einzelne Zelle Auflösung fehlt. Neuronen sind typischerweise mit Glia und andere nicht-neuronalen Zellen vermischt. Wir bieten ein Protokoll zu extrahieren und zu sammeln neuronale Kerne von menschlichen Gehirns.

Neuronale Kerne Isolation von Human Postmortem Gehirngewebe

Wir beschreiben eine Technik für die Herstellung von geklärt menschlichen kortikalen Homogenate, Protein Trennung durch SDS-PAGE, Antigen-Retrieval und Immunoblot mit einem Antikörper gegen das Aß-Peptid. Mit diesem Protokoll, setzen wir konsequent erkennen monomeren und multimeren Aß in kortikalen Gewebe von Menschen mit Alzheimer-Pathologie.

SDS-PAGE/Immunoblot Detektion von Aß Multimere in Human Kortikale Gewebehomogenaten mit Antigen-Epitope Retrieval

Eine neue Art der zellulären Prion-Protein...

Isolierung von löslicher und unlöslicher PrP Oligomere in das normale menschliche Gehirn

Dieses Video zeigt das Protokoll zur Isolierung von Amyloidfibrillen aus Maushirngewebeextrakt mittels Dichtegradientenzentrifugation und Verdauung von Nicht-Amyloid-Proteinen.

Isolierung von Amyloid-Fibrillen aus Hirngewebeextrakt

Dieses Video erklärt den Prozess der Isolierung und Anreicherung von waschmittelunlöslichen Proteinaggregaten aus gefrorenem postmortalem menschlichem Hirngewebe. Es demonstriert die wichtigsten Schritte, einschließlich Homogenisierung, Waschmittelbehandlung, Beschallung und Ultrazentrifugation zur Trennung und Reinigung der unlöslichen Aggregate. Der letzte Schritt besteht darin, die Aggregate in Harnstoffpuffer für die weitere Analyse zu lösen.

Isolierung von detergenzien-unlöslichen Proteinaggregaten aus menschlichem postmortalem Hirngewebe

Eine gemeinsame Proteinextraktionsprotokoll unter Verwendung von Harnstoff / Thioharnstoff / SDS Puffer für Mensch und Maus Hirngewebe ermöglicht indentification von Proteinen mittels 2D-DIGE und ihre anschließende Charakterisierung von Mini 2DE Immunoblotting. Diese Methode ermöglicht es, mehr reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse aus menschlichen Biopsien und experimentellen Modellen zu erhalten.

Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung von zunehmend unlöslichem/aggregiertem alpha-Synuclein (α-syn) aus postmortalem menschlichem Hirngewebe. Durch die Verwendung von Puffern mit zunehmender Detergensfestigkeit und Hochgeschwindigkeits-Ultrazentrifugationstechniken können die variablen Eigenschaften der α-syn-Aggregation in erkranktem und nicht erkranktem Gewebe untersucht werden.

Sequentielle Extraktion von löslichen und unlöslichen Alpha-Synuclein von Parkinson-Brains

Wir berichten über einen einfachen, zeiteffizienten und auf Fluoreszenzspektroskopie basierenden Hochdurchsatz-Assay zur Quantifizierung von Aktinfilamenten in ex vivo biologischen Proben aus Hirngeweben von Nagetieren und menschlichen Probanden.

Ein zeiteffizienter Fluoreszenzspektroskopie-basierter Assay zur Bewertung des Actin-Polymerisationsstatus in Nagetier- und menschlichem Hirngewebe

Diese biochemische Reinigungsmethode mit massenspektrometriebasierter Proteomanalyse erleichtert die robuste Charakterisierung von Amyloidfibrillenkernen, was die Identifizierung von Zielen zur Vorbeugung der Alzheimer-Krankheit beschleunigen kann.

Biochemische Reinigung und proteomische Charakterisierung von Amyloid-Fibrillenkernen aus dem Gehirn

Diese Studie skizziert experimentelle Methoden zur biochemischen Charakterisierung von GFAP und seinen krankheitserregenden Mutationen, mit Fokus auf Filamentassemblierung, Aggregation und posttranslationale Modifikation. Hochreine GFAP-Proteine wurden analysiert, was Einblicke in die Mechanismen der Alexander-Krankheit liefert, die einen Rahmen für die Untersuchung potenzieller therapeutischer Ziele sowie das Verständnis von GFAP-Mutationen und verwandten Erkrankungen bieten könnten.

Experimentelle Ansätze zur biochemischen Analyse des glialen fibrillären sauren Proteins und seiner krankheitsassoziierten Varianten

Lernen Sie eine Fraktionierungsmethode zur Anreicherung von waschmittel-unlöslichen Proteinaggregaten aus postmortem menschlichem Gehirngewebe. Diese Technik ermöglicht die effiziente Isolierung fehlgefalteter Proteine für die Neurodegenerationsforschung.

Anreicherung von Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn

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