Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, genomweite Karten von Protein-DNA-Wechselwirkungen in situ mit hoher Auflösung und geringem Hintergrund zu erstellen, ohne dass Formaldehydvernetzung, Chromatinsolubilisierung oder Antikörper erforderlich sind. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Transkription zu beantworten, z. B. wo verschiedene regulatorische Faktoren mit Chromatin im Verhältnis zu genregulatorischen Regionen assoziiert sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie hochauflösende genomische Bindungskarten mit vernachlässigbarem Hintergrund liefert und Einschränkungen vermeidet, die mit Standard-ChEC-seq-Protokollen verbunden sind.

Verfahren wird von Sebastian Grünberg, meinem Kollegen vom Fred Hutchinson Cancer Research Center, vorgeführt. Beginnen Sie am Nachmittag oder Abend des Tages vor dem Experiment mit einer Vorkultur des Versuchsstammes. Beimpfen Sie drei Milliliter gebrauchte Pepton-Dextrose oder ein geeignetes Selektivmedium mit einer einzelnen Kolonie des Stammes, die den MNase-markierten Faktor trägt.

Inkubieren Sie diese Kultur über Nacht in einem 30 Grad Celsius heißen Shaker-Inkubator. Am nächsten Morgen verdünnen Sie die Übernachtkultur in 50 Milliliter Medium auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,2 bis 0,3. Inkubieren Sie die Kultur im Schüttler-Inkubator, bis sie eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,5 bis 0,7 erreicht.

Bereiten Sie die benötigte Menge an Puffer A plus Additiven vor und halten Sie sie während des Eingriffs bei Raumtemperatur. Bereiten Sie die Mikrofugenröhrchen für die Probenentnahme vor. Entnehmen Sie für jeden neu analysierten Faktor Proben ohne Kalziumzugabe und fügen Sie 30 Sekunden, eine Minute, 2,5 Minuten, 5 Minuten und 10 Minuten nach der Kalziumzugabe hinzu.

Geben Sie zu jedem Röhrchen 90 Mikroliter Stopplösung und 10 Mikroliter 10%iges SDS. Wenn die Kultur eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,5 bis 0,7 erreicht hat, wird die Kultur in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen umgefüllt und eine Minute lang bei Raumtemperatur bei 1.500 g zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen gründlich in einem Milliliter Puffer A und übertragen Sie die resuspendierten Zellen in ein Mikrofuruge-Röhrchen.

Die resuspendierten Zellen werden in einer Mikrofuge bei 1.500 mal g für 30 Sekunden bei Raumtemperatur pelletiert. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen gründlich in einem Milliliter Puffer A, indem Sie auf und ab pipettieren. Pelletieren Sie die resuspendierten Zellen bei 1.500 mal g für 30 Sekunden bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Puffer A und zentrifugieren Sie erneut. Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, resuspendieren Sie die Zellen gründlich in 570 Mikrolitern Puffer A. Fügen Sie 30 Mikroliter 2% Digitonin hinzu, um die Permeabilisierung der Zellen zu erleichtern, und invertieren Sie sie, um sich zu mischen. Permeabilisieren Sie die Zellen in einem Wärmeblock bei 30 Grad Celsius für fünf Minuten.

Pipettieren Sie die Reaktion auf und ab, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Als Negativkontrolle werden 100 Mikroliter aliquot permeabilisierter Zellen in ein Mikrofurge-Röhrchen mit Stopplösung und SDS überführt und kurz zum Mischen vortexen. Vor Beginn des Zeitverlaufs ist es wichtig, die Röhrchen mit der Stopplösung, die Pipette, die Pipettenspitzen und einen Timer neben den Heizblöcken zu haben, damit die frühen Zeitpunkte effizient erfasst werden können.

Zu Beginn des Zeitverlaufs fügen Sie den permeabilisierten Zellen 1,1 Mikroliter einmolares Calciumchlorid hinzu, um MNase zu aktivieren, und invertieren Sie mehrmals schnell, um sich zu mischen. Stellen Sie die gemischte Reaktion sofort auf 30 Grad Celsius zurück und starten Sie einen Timer. Zu jedem Zeitpunkt, zu dem entnommen werden soll, pipettieren Sie die Reaktion auf und ab, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten, und entfernen Sie dann ein 100-Mikroliter-Aliquot permeabilisierter Zellen in ein Mikrofuge-Röhrchen, das Stopplösung und SDS enthält.

Zum Mischen kurz vorziehen. Sobald alle Zeitpunkte gesammelt wurden, fügen Sie jeder Probe vier Mikroliter mit 20 Milligramm Proteinase K pro Milliliter hinzu. Zum Mischen kurz vortexen und 30 Minuten bei 55 Grad Celsius inkubieren.

Geben Sie 200 Mikroliter Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol zu jeder Probe, wirbeln Sie sie kräftig zum Mischen durch und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei maximaler Geschwindigkeit. Entfernen Sie die wässrige Phase in ein neues Röhrchen. Fügen Sie 30 Mikrogramm Glykogen und 500 Milliliter 100% Ethanol hinzu.

Mischen kräftig vortexen und 10 Minuten lang auf Trockeneis ausfällen lassen oder bis die Lösung zähflüssig ist. Pelletieren Sie die gefällte DNA, indem Sie 10 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit und vier Grad Celsius zentrifugieren. Dekantieren Sie den Überstand und waschen Sie jedes Pellet mit einem Milliliter 70%igem Ethanol bei Raumtemperatur.

Dekantieren Sie das Ethanol und entfernen Sie den Rest, indem Sie es umdrehen und die Röhrchen vorsichtig auf ein Papiertuch klopfen. Schleudern Sie die Proben kurz mit einer Tischzentrifuge und entfernen Sie dann mit einer Pipette Ehtanolreste, wobei Sie darauf achten, das Pellet nicht zu stören. Trocknen Sie die Pellets fünf Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft.

Während die DNA-Pellets trocknen, stellen Sie einen Mastermix aus Tris-Puffer und RNase A her, um die Pellets nach dem Trocknen wieder zu resuspendieren, und vermischen Sie sie mit einem Vortex. Geben Sie 30 Mikroliter der RNase A-Lösung zu jedem getrockneten DNA-Pellet, wirbeln Sie es zum Mischen und inkubieren Sie es 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um RNa zu verdauen. Mischen Sie nach 20 Minuten einen Mikroliter 6X DNA-Ladefarbstoff mit fünf Mikrolitern jeder Probe und lassen Sie es 40 Minuten lang auf einem 1,5%igen Agarosegel bei 120 Volt laufen.

Beginnen Sie das Größenauswahlverfahren, indem Sie zu jeder Probe 75 Mikroliter SPRI-Kügelchen in einer Polyethylenglykollösung hinzufügen. Pipettieren Sie 10 Mal auf und ab, um die Kügelchen und die DNA-Mischung zu mischen, und inkubieren Sie dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Bereiten Sie während der SPRI-Kügelchen-Inkubation Mikrofuge-Röhrchen vor, die 96 Mikroliter 10 millimolare Tris pH 8,0 und vier Mikroliter fünf molare Natriumchlorid für jede Probe enthalten.

Legen Sie die Röhrchen mit den Kügelchen und der DNA-Mischung für zwei Minuten in ein Magnetgestell, um die Kügelchen an der Seite des Röhrchens zu sammeln, und geben Sie dann jeden Überstand in ein neues Röhrchen, das Tris und Natriumchlorid enthält. Geben Sie 200 Mikroliter Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol in jede Probe, mischen Sie sie mit einem Vortex und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit bei Raumtemperatur. Entfernen Sie jede wässrige Phase in ein neues Röhrchen, fügen Sie 30 Mikrogramm Glykogen und 500 Mikroliter 100%iges Ethanol hinzu.

Fältitieren Sie die DNA 10 Minuten lang auf Trockeneis oder bis die Lösung zähflüssig ist. Pelletieren Sie die ausgefällte DNA, indem Sie 10 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit und vier Grad Celsius zentrifugieren. Dekantieren Sie den Überstand und waschen Sie jedes Pellet mit einem Milliliter 70%igem Ethanol.

Dekantieren Sie das Ethanol und entfernen Sie den Rest, indem Sie die Röhrchen umdrehen und vorsichtig auf ein Papiertuch klopfen. Schleudern Sie die Proben kurz mit einer Tischzentrifuge und verwenden Sie eine Pipette, um Ethanolreste zu entfernen, wobei Sie darauf achten, das Pellet nicht zu stören. Trocknen Sie die Pellets fünf Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft.

Jedes getrocknete Pellet in 25 Mikrolitern Tris pH 8 resuspendieren. Bestimmen Sie die Konzentration jeder Probe mit einem hochempfindlichen Assay. Die Agarose-Gelelektrophorese von DNA aus einer Chromatin-endogenen Spaltungsanalyse von Reb1, einem allgemeinen regulatorischen Faktor, der Nukleosomen-depletierte Regionen bindet, zeigt eine kalziumabhängige Zunahme der DNA-Fragmentierung im Laufe der Zeit, was durch Verschmieren und schließlich durch vollständige Verdauung der genomischen DNA angezeigt wird.

Die Visualisierung von Fragmentenden aus einem Reb1-Chromatin-Sequenzierungsexperiment zeigt eine robuste Anreicherung von Reb1 über den Hintergrund, abgeleitet aus dem freien MNase-Stamm nach 30 Sekunden Calciumbehandlung. In ähnlicher Weise wurde eine signifikante DNA-Spaltung durch eine Fusion der Mediator-Untereinheit Med8 mit MNase beobachtet, aber nicht durch freie MNase, die eine Minute nach der Calciumzugabe durch den Med8-Promotor angetrieben wurde. Um die Daten der endogenen Spaltungssequenzierung des Reb1-Chromatins mit den Daten der Chromatin-Immunpräzipitation und der Hochdurchsatz-Sequenzierung zu vergleichen, wurden 1.992 Reb1-Peaks, die durch die organische Methode bestimmt wurden, motivzentriert und die durchschnittliche Fragmentendzahl an jeder Basenposition in einem 100-Basenpaar-Fenster um den Motivmittelpunkt bestimmt.

Es wurde eine auffällige Asymmetrie und Spaltung beobachtet, wobei die Mehrzahl der freigesetzten Reb1-MNase-Fragmentenden auf die stromaufwärts gerichtete Seite des Motivs abgebildet wurde. Einmal gemeistert, kann diese Technik an einem vollen Arbeitstag durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, die Anzahl der parallel untersuchten Proben zu begrenzen, um genaue Pipettier- und Handhabungszeiten zu gewährleisten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Transkription, um zum ersten Mal die genomische Assoziation eines nicht-DNA-bindenden, megadaltongroßen Proteinkomplexes in Hefe eindeutig zu charakterisieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie die ChEC-Seq-Methode zur genomweiten Kartierung von Proteinbindungsstellen im knospenden Hefegenom durchführen können.