Name: Subkutane Neurotrophin-4-Infusion unter Verwendung von Osmotik-Pumpen oder direkter Muskel-Injektion verbessert die Ratten-Larynx-Muskeln (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 50 s
Description: Erfahren Sie die Infusion von Neurotrophin 4 in Rattenlarynxmuskeln mittels osmotischer Pumpen oder direkter Injektion. Diese Methode ermöglicht Muskelremodellierung und verbessert die Stimmfunktion im Alter.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Stipendien des Nationalen Instituts für Taubheit und andere Kommunikationsstörungen (R21DC010806 bis CAM und JCS und R01DC011285 bis CAM).

Verwenden Sie männliche Fischer 344-Brown Norwegen Ratten in 6 und 30 Monate alt für dieses Protokoll. Ratten wurden von der National Institute of Aging Nagetier Kolonie erhalten. Wir haben Ratten für diese Studie verwendet, weil die Struktur des Rattenkehlkopfes ähnlich der des Menschen ist, funktionell für den Atemwegsschutz und Spezies-spezifische Vokalisationen dient Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit der PHS-Politik auf humane Pflege und Verwendung von Labor-Tiere durchgeführt, Der NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und das Tierschutzgesetz (7 USC ff.); Wurde das Tiernutzungsprotokoll vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Kentucky genehmigt. 1. Anästhesie der Ratten <ol><li> Bereiten Sie die Anästhetika vor, indem Sie Ketaminhydrochlorid (dissoziatives Anästhetikum) und Xylazinhydrochlorid (Beruhigungsmittel und Analgetikum) in gepufferter Kochsalzlösung mischen. Die Konzentrationen von Ketamin und Xylazin in der Endlösung betragen 100 mg / 8 mg pro kgKörpergewicht. </li><li> Injektion der Anästhetika in die Ratte durch intraperitoneale Verabreichung unter Verwendung einer Spritze mit einer 25 G-Nadel. </li><li> Bestimmen Sie, dass die Ratte genügend betäubt ist, indem Sie den Zeh oder den Fuß mit einer Pinzette einklemmen. Wenn die Ratte nicht auf die Prise reagiert, dann kann die Operation beginnen. Wenn die Ratte auf die Zehen-Prise mit Reflex- oder Muskelkontraktionen reagiert, dann warten Sie 1-2 min und wiederholen Sie den Prise Test. Wenn die Ratte wieder reagiert, ersetzen Sie die Ratte durch ein neues Tier und wiederholen Sie das Verfahren ab Schritt 1.2. </li><li> Tragen Sie ophthalmische Salbe auf die Augen der Ratte, nachdem die Ratte unbeweglich ist, um zu verhindern, dass die Hornhäute austrocknen. </li></ol> 2. Osmotische Pumpenimplantation <ol><li> Lege die Ratte ventral auf den aseptischen chirurgischen Bereich. Meloxicam als präanästhetische Medikamente verabreichen. Intraperitoneal in einer Dosierung von 1-4 mg / kg Körpergewicht unter Verwendung einer Spritze mit einer 25 G-Nadel verabreichen. </li><li> Verwenden Sie Clippers, um eine approxima zu entfernen1 &quot;x 1&quot; Quadrat des Pelzes von der Rückseite des Halses, und ungefähr 1 &quot;kaudal des Raumes zwischen den Schultern. Rasieren Sie so nah an der Haut wie möglich. </li><li> Den Rücken und den Nacken mit deminfizierendem Ethanol (70%) benetzen. </li><li> Nach der Rasur, schrubben die dorsalen Aspekt des Halses mit 3 Scrubs in Folge von Jod-Alkohol Finishing mit Alkohol. </li><li> Halten Sie die Körpertemperatur der Ratte, indem Sie sie auf einen Heizkissen legen, der auf 34 ° C eingestellt ist. </li><li> Füllen Sie aseptisch hergestellte osmotische Pumpen mit entweder 50 μl NTF4 oder Kochsalzlösung für die systemische NTF4-Behandlung (Abbildung 1 ). <ol><li> Benutzen Sie ein Skalpell, um einen horizontalen Schnitt ungefähr 2 cm breit durch die Haut zu bilden, gerade kranial zum Raum zwischen den scapulae. Heben Sie die hintere Kante des Schnittes mit einer Pinzette mit einer Hand an, während Sie die Spitze der Hämostaten einsetzen und vorsichtig nach hinten in den Einschnitt schieben. </li><li> Nach der Spitze der Hämostaten ist ca. 2 cm cRanial zum Einschnitt, öffnen Sie die Griffe auf den Hämostaten, erweitern die Spitzen, um eine hohle &quot;Tasche&quot; subkutan zu der Inzisionsstelle zu bilden. Dies ist die Platzierungsstelle für die Pumpe. </li></ol></li><li> Richten Sie das Pumpenförderportal zuerst nach der Einfügung aus, um jegliche Wechselwirkung des NTF4 und die Heilung der Pocket Inzisionsstelle zu minimieren. </li><li> 50 μl NTF4 Kochsalzlösung für 7 14 Tage geben. Die 7-tägige Gruppe erhielt 6,72 mg / Tag NTF4 für eine Gesamtdosis von 47,04 mg. Die 14-tägige Gruppe erhielt 6,72 mg / Tag für eine Gesamtdosis von 94,08 mg NTF4 25 . </li><li> Verwenden Sie 5-0 Nylon Naht Faden, Hämostaten und Pinzette, um den Einschnitt für Pumpe Platzierung zu schließen. </li><li> Beobachten Sie die Ratten für mindestens 30 min, wie sie sich von der Anästhesie erholen. Kriterien für die Vollendung der Überwachung gehören das Tier aktiv, bewegt sich über den Käfig, Trinkwasser, und beginnen andere normale Aktivitäten wie Pflege. </li><li> Tiere täglich überwachenFür die erste Woche durch Beobachtung der Heilung der chirurgischen Stelle, normale Futtermittel und Wasserverbrauch und Verabschiedung von Urin / Kot und irgendwelche abnorme Verhaltenszeichen von Stress, Schmerzen oder anderen postoperativen Komplikationen. </li><li> Wenn die Ratte in Schmerzen oder Not zu sein scheint, versorgen Sie die Ratte mit einer 5 mg / kg subkutanen Injektion von Carprofen einmal alle 24 Stunden für bis zu 5 Tage, um Schmerzen zu lindern. </li><li> Wenn es scheint, eine Infektion zu sein, konsultieren Sie einen Tierarzt, um zu folgen, dass die Wunde richtig heilt. </li><li> Je nachdem, welche experimentelle Gruppe die Ratte in innen, entfernen Sie die 5-0 Nylon Naht 7-10 Tage nach der Operation, um Reizungen aus dem Faden zu verhindern. </li></ol> 3. Anästhesie der Ratten für die direkte Injektion <ol><li> Verzehr von den Ratten in der Nacht vor dem Eingriff. Dadurch wird sichergestellt, dass es keine Nahrung gibt, um das Endoskop oder die Injektionsnadel zu blockieren. </li><li> Wiegen Sie Ratten und bereiten Sie Acepromazin 1-2 mg / kg Körpergewicht vor. Inaktiv intramuskulär (der IM - Standort ist derLinks thyroarytenoid muskel). </li><li> Legen Sie die Ratte in die Induktionsbox. Anästhesie im Induktionskasten mit 5% Isofluran und 1 LO 2 induzieren. </li><li> Bewegen Sie die Ratte auf einen Nasenkonus mit 2% Isofluran und 600 ml O 2 . </li><li> Bestimmen Sie, dass die Ratte genügend betäubt ist, indem Sie den Zeh oder den Fuß mit einer Pinzette einklemmen. Wenn die Ratte nicht auf die Prise reagiert, kann das Injektions-Protokoll beginnen. Wenn die Ratte auf die Zehen-Prise mit Reflex- oder Muskelkontraktionen reagiert, dann warten Sie 1-2 min und wiederholen Sie den Prise Test. Wenn die Ratte wieder reagiert, ersetzen Sie die Ratte durch ein neues Tier und wiederholen Sie das Verfahren ab Schritt 3.4. </li></ol> 4. Direkteinspritzung und Visualisierung <ol><li> Platzieren Sie aseptisch hergestellte 50-μL-Dosierungen, die NTF4 oder Kochsalzlösung enthalten, in einem H 2 O-Bad, das auf 25 ° C für 30 min vor der Injektion eingestellt wurde. </li><li> Legen Sie die Ratte in eine Rückenlage und verstellbare Position auf einer Plexiglas-Plattform (Abbildung 2 ). SusHängen Sie die Ratte in die zurückgelehnte Haltung von ihren vorderen oberen Schneidezähnen über einen Führungsdraht, der über die Oberseite der Plattform geschleudert wird. </li><li> Befestigen Sie eine 50 mm, 30 gauge, 100 μl Spritze auf ein 1,9 mm, 30 ° Sinus Endoskop (Abbildung 3 ). HINWEIS: Die Spritzenanordnung wird über eine Lehre befestigt, die die Kanüle fest an der Außenwand des Endoskops hält. Das Endoskop ermöglicht die Visualisierung der Stimmlippen und die Injektion der Spritze. Die Position der Kanülenspitze wird vor jedem Tier eingestellt, um sicherzustellen, dass die Spitze über die endoskopische Ansicht vollständig sichtbar ist (Abbildung 4 ). </li><li> Verwenden Sie eine gummi-pippige Pinzette, um die Zunge zu verlängern und verschieben Sie sie seitlich. Danach legen Sie ein Plastikspekulum ein, um die mündliche Durchgängigkeit zu bewahren. Machen Sie das Spekulum aus einem 5 ml Plastikspritzenfaß, der auf eine Länge von 1,5 bis 2 cm geschnitten ist, wobei die Schnittkanten entgratet und poliert sind. </li><li> Schalte die Lichter ausM und befestige eine Halogen-Lichtquelle zum Endoskop. Schalten Sie den Videorecorder ein, um die Prozedur zu erfassen. </li><li> Tauchen Sie das distale Ende des Endoskops für einige Sekunden in warmes Wasser ein, um die Entwicklung der Kondensation auf der Glasspitze zu minimieren, wenn sie in den Mund der Ratte eingeführt wird. </li><li> Mit der visuellen Rückmeldung vom Monitor führen Sie die Nadel sorgfältig in den Bereich der linken Stimmlippe. </li><li> Zeit die Injektion der Lösung mit der Inspirationsphase des Atmungszyklus der Tiere, um vollständig auf die Stimmfalte zuzugreifen. Während der inspiratorischen Phase der Atmung ist die Stimmfalte vollständig ausgesetzt. <ol><li> Sobald die Stimmfalte vollständig sichtbar ist, stecke die Nadel in das linke Thyreoheldoid ein, das seitlich zur weißen medialen Kante der Stimmlippe gefunden wird. Mit der Nadel an Ort und Stelle, liefern die Injektion durch Depression der Spritze. </li></ol></li><li> Schalten Sie die Halogen-Lichtquelle auf dem Endoskop und dem Videoplayer aus und drehen Sie den Rack wieder anOm leuchtet </li><li> Bringt die Ratte in den Hauskäfig zurück und platziere auf einem Heizkissen. </li><li> Lassen Sie die Ratte vor dem Entfernen aus dem Heizkissen zurückgewinnen. Ersetzen Sie Nahrung und Wasser im Käfig. </li><li> Überwachen Sie Ratten für 7 Tage nach der Injektion und dann euthanisieren. Entfernen Sie die Larynges für die Kryoschaltung 24 . </li></ol> 5. Euthanisierung von Ratten <ol><li> Anästhesieren von Ratten mit Ketaminhydrochlorid und Xylazinhydrochlorid (100 mg / 8 mg pro kg Körpergewicht injiziert intraperitoneale Injektion). </li><li> Euthanisieren durch Exsanguination nach einer medialen Thorakotomie. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Larynxmuskulatur ist anfällig für die ungünstigen Auswirkungen des Alterns. Frühere Studien haben Veränderungen in der Alterung der Kehlkopfmuskulatur gezeigt, die Veränderungen in der Fasergröße, die Gesamtzahl der Fasern, die Regenerationsfähigkeit, die NMJ-Größe und die Mengenänderungen zusätzlich zu den Variationen der kontraktilen Funktion und der Myosin-Isoformverschiebungen 4 , 11 , 27 , 30</...

Larynx Muskeln kontrahieren schnell und konsequent und sind anfällig für die nachteiligen Auswirkungen des Alterns. Diese ständige Aktivität wird dazu gedacht, zu Stimmproblemen oder Dysphagie bei Personen über 65 Jahre im Alter von 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 zu helfen. Mehrere molekulare und pathophysiologische Mechanismen tragen zu dieser altersbedingten Dysfunktion bei. Diese Mechanismen können die Umgestaltung von Kehlkopfschleimhaut, Muskelfaseratrophie oder -verlust, Mangel an Muskelfaser-Regeneration oder Atrophie, die eine Verbeugung der Stimmlippen und Unfähigkeit des Glottis-Verschlusses 8 , 9 , 10 , 11 bewirken , umfassen . Es gibt keine bewährte medizinische Therapie zu diesem Zeitpunkt, die comDiese altersbedingten Veränderungen in diesen Muskeln zu verhindern oder zu rehabilitieren. Die Modulation der Wirksamkeit der neuromuskulären Transmission kann die Neuromotorleistung stark beeinflussen. Die Familie der Neurotrophine umfasst den Nervenwachstumsfaktor (NGF), den Gehirn-abgeleiteten Nervenwachstumsfaktor (BDNF), Neurotrophin 3 (NTF3) und NTF4 12 , 13 . Es wurde gezeigt, dass Neurotrophine die synaptische Wirksamkeit 1 , 4 modulieren. Hepatocytenwachstumsfaktor, transformierende Wachstumsfaktor Beta und Fibroblastenwachstumsfaktor wurden vor kurzem beim Menschen für die Behandlung von Stimmfalten Narben 15 - 17 verwendet. NTF4 reguliert auch die NMJ-Wirksamkeit; Mäuse ohne NTF4 zeigen zerlegt NMJs 11 , 18 , 19 . Diese Studien führen zu vielversprechenden Wirkungen von BehandlungenT der alternden Larynxmuskelstörungen und der Denervation mit Wachstumsfaktoren. Direkte Injektionstherapeutika zu den Geweben der Stimmlippen sind beim Menschen nicht beispiellos. Zum Beispiel werden lokale Injektionen von Botulinumtoxin derzeit als wirksame Behandlung für neurologische Bewegungsstörungen verwendet, die die Muskeln im Kehlkopf beeinflussen, wie krampfhafte Dysphonie und bilaterale rezidivierende Larynxnervenlähmung 20 , 21 . Hyaluronsäure-Hydrogel ist eine weitere injizierbare, die verwendet wird, um Stimmfalten Angst und Glottal Insuffizienz 22 , 23 zu behandeln. Injektion Laryngoplastie kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Kommunikationsstörungen zu behandeln 24 . Diese Direktinjektionsmethoden versprechen, die Stimmfunktion und das Schlucken in alternden Populationen zu verbessern.

<table><tbody><tr><td>Neurotrophin 4</td><td>Pepro Tech</td><td>450-04</td><td>200 ng in 50 μ; L</td></tr><tr><td>Alzet Osmotische Pumpe</td><td>DURECT Corporation</td><td>2001D</td><td></td></tr><tr><td>30 > Endoskop</td><td>Stoltz</td><td>61029D</td><td></td></tr><tr><td>50 mm 30 Gauge 100-&mu; L Spritze</td><td>Hamilton</td><td>84850 und 201812</td><td></td></tr><tr><td>Kochsalzlösung (Natriumchloridlösung)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8776</td><td></td></tr><tr><td>Ketaminhydrochlorid</td><td>Henry Schein</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Xylazinhydrochlorid</td><td>Henry Schein</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>25 G 5/8 Nadel</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305901</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Spritze</td><td>Becton-Dickinson</td><td></td><td></td>309659</tr><tr><td>Augensalbe</td><td>Henry Schein</td><td>8897</td><td></td></tr><tr><td>Haarschneidemaschine</td><td>Oster</td><td>44-018</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Jod (Betadin)</td><td>Purdue Pharma L.P.</td><td></td><td></td>606404</tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Sunbeam</td><td>731-5</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Nylon Nahtfaden</td><td>AD Surgical</td><td>PMN-518R6</td><td></td></tr><tr><td>Crile Hämostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13005-14</td><td></td></tr><tr><td>zarte Nahtbindezange</td><td>Fine Science Tools</td><td>11063-07</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Henry Schein</td><td>49756</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Merritt Veterinary Supplies</td><td>148700</td><td></td></tr><tr><td>antibiotische Salbe</td><td>Henry Schein</td><td>57110</td><td></td></tr><tr><td>Acepromizin Aceproject</td><td>Henry Schein</td><td>3845</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran Isothesie</td><td>Henry Schein</td><td>50033</td><td></td></tr><tr><td>Induktionsbox (Anästhesiebox)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>50-0116</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstoff-Drucktank</td><td>Scott Gross</td><td>UN1072</td><td></td></tr><tr><td>Plattform aus Plexiglas</td><td>Small Parts Inc (Amazon)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette mit Gummispitze</td><td>Fine Science Tools Gummi</td><td>11075-00</td><td></td></tr><tr><td>Flüssiggummi für Pinzetten über</td><td>Lowe's</td><td>42518</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffspekula (BD-Spritze auf Länge geschnitten)</td><td>Becton-Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Halogenlichtquelle Nashorn-Kehlkopf Stroboskop</td><td>Kay-Pentax</td><td>RLS 9100 B</td><td></td></tr><tr><td>Videorekorder</td><td>Kay-Pentax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat Mictotom HM525</td><td>Thermo Scientific</td><td>HM 525</td><td></td></tr><tr><td>Kieme 1 Hämatoxylin</td><td>VWR</td><td>10143-142</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Eosin-Y alkoholischer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6766007</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Natrium-Kanal Nav1.5 Antikörper, hergestellt in Kaninchen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0819</td><td></td></tr><tr><td>Texas red-X Phalloidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7471</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-Bungarotoxin Alexa Fluor 488 Konjugat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B-13422</td><td></td></tr><tr><td>Anästhesie für Kleintiere </td><td>Maschine Smiths Medical</td><td>CDS 9000</td><td></td></tr></tbody></table>

subkutane neurotrophin-4-infusion unter verwendung von osmotik-pumpen oder direkter muskel-injektion verbessert die ratten-larynx-muskeln

Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles

Kehlkopfdysfunktion bei älteren Menschen ist eine Hauptursache für Behinderung, von Stimmungsstörungen bis hin zu Dysphagie und Verlust von Atemwegsschutzreflexen. Nur wenige, wenn überhaupt, gibt es Therapien, die eine altersbedingte Larynxmuskel-Dysfunktion erreichen. Neurotrophine sind an der Muskelinnervation und Differenzierung von neuromuskulären Übergängen (NMJs) beteiligt. Es wird angenommen, dass Neurotrophine die neuromuskuläre Transmission durch Erhöhung der Neurotransmitterfreisetzung verstärken. Die neuromuskulären Kreuzungen (NMJs) werden kleiner und weniger reich an alternden Ratten-Larynxmuskeln, mit Anzeichen einer funktionalen Denervation. Wir untersuchten die Auswirkungen von NTF4 auf zukünftige klinische Anwendung als Therapeutikum zur Verbesserung der Funktion bei der Alterung menschlicher Larynxmuskulatur. Hier stellen wir das detaillierte Protokoll für die systemische Anwendung und die direkte Injektion von NTF4 zur Verfügung, um die Fähigkeit des alternden Ratten-Larynxmuskels zu untersuchen, um in Reaktion auf NTF4-Applikation umzuwandeln. Bei dieser Methode erhielten Ratten entweder NTF4 entweder systemisch über oSmotische Pumpe oder durch direkte Injektion durch die Stimmlippen. Larynxmuskeln wurden dann seziert und für die histologische Untersuchung der Morphologie und der altersbedingten Denervation verwendet.

Die Ratten wurden nach 2 Wochen osmotischer Pumpeninfusion oder 1 Woche nach Direkteinspritzung von NTF4 euthanasiert. Larynge wurden geerntet, in Kryoschutzmittel (30% Saccharose und 70% phosphatgepufferte Kochsalzlösung) gegeben und dann seriell in 10 &amp; mgr; m Breite mit einem Kryostat geschnitten. Alterung der Larynxmuskulatur wird durch die Verabreichung von NTF4 25 beeinflusst. Neben der jungen und alten Ratte verglichen wir die injizierte und nicht injiz...

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Verwendung von Neurotrophin 4 (NTF4) systemisch und direkt zu modulieren Rattenalterung Larynx Muskeln zu beschreiben.

Subkutane Neurotrophin-4-Infusion unter Verwendung von Osmotik-Pumpen oder direkter Muskel-Injektion verbessert die Ratten-Larynx-Muskeln

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Neurotrophin 4 zur Induktion der Umstrukturierung des Kehlkopfmuskels bei alternden Ratten zu verabreichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Funktion des Kehlkopfmuskels zu beantworten. Zum Beispiel: Kann eine altersbedingte Muskelatrophie umgekehrt werden, um die Stimmfunktion zu verbessern?Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie leicht auf menschliche Modelle der Stimmalterung übertragen werden kann. Wir können Injektionsmethoden anwenden, die typischerweise von HNO-Ärzten beim Menschen verwendet werden, um die zur Verbesserung der Stimmfunktion notwendigen Lösungen zu verabreichen. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten aufgrund der Delikatesse der Implantations- und Injektionsverfahren.Den Vorgang werden Tanya Seward, eine Technikerin aus der Abteilung für Physiologie, und Richard Andreatta, ein außerordentlicher Professor für Kommunikationswissenschaften und -störungen, beide von der University of Kentucky, demonstrieren. Um die Pumpe zu implantieren, platzieren Sie zunächst die Ratte in Rückenlagerung in einem aseptischen Operationsbereich. Benetzen Sie den Rücken und den Nacken mit Jod. Danach die dorsale Halsregion mit 70 % Ethanol abreiben. Anschließend das Tier auf eine Heizplatte mit 34 Grad Celsius bringen und eine präanästhetische Medikation verabreichen. Die aseptisch vorbereiteten osmotischen Pumpen mit 50 Mikrolitern Neurotrophin 4 füllen.Und verwenden Sie ein Skalpell, um einen zwei Zentimeter breiten, horizontalen Schnitt durch die Haut direkt hinter dem Zwischenraum zwischen den Schulterblättern anzulegen. Heben Sie den hinteren Rand des Schnitts mit einer Pinzette an und schieben Sie vorsichtig die Spitzen der Hämstoplatten hinter den Schnitt. Wenn sich die Spitze etwa zwei Zentimeter hinter dem Schnitt befindet, öffnen Sie die Griffe der Hämstoplatte, um eine hohle Tasche subkutan an der Schnittstelle zu bilden.Setzen Sie die Pumpe in die Tasche ein, wobei das Ende des Abgabeportals so ausgerichtet wird, dass jegliche zusätzliche Wechselwirkung zwischen der Behandlung und der Heilung der Tascheninzision minimiert wird. Anschließend schließen Sie die Inzision zur Platzierung der Pumpe mit einem 5-0-Nylon-Nahtfaden, einer Pinzette und einer Hämostaseklemme und überwachen das Tier, bis es vollständig wach und mobil ist. 30 Minuten vor der Injektion erwärmen Sie aseptisch vorbereitete Dosen von 50 µL Neurotrophin oder Kochsalzlösung in einem Wasserbad mit 25 °C. Wenn die Behandlungen vorbereitet sind, legen Sie eine anästhesierte Ratte in Rückenlage auf eine Plexiglasplatte und befestigen Sie das Tier mithilfe eines Führungsdrahts an den oberen Schneidezähnen. Danach befestigen Sie eine 30-Gauge-, 50-Millimeter-, 100-Mikroliter-Spritze an einem 1,9-Millimeter-30-Grad-Nasennebenhöhlen-Endoskop. Verbinden Sie die Spritzenanordnung anschließend mit einer Halterung an der Außenwand des Endoskops.Wenn die Spritze sicher befestigt ist, das Behandlungspräparat einfüllen und die Endoskopieeinheit an die Kamera anschließen. Anschließend mit gummierten Pinzetten die Zunge zur Seite ziehen und einen Kunststoffspatel einsetzen, um die Mundöffnung aufrechtzuerhalten. Danach die Halogenlichtquelle für das Endoskop einschalten.Während die Videoaufzeichnung läuft, tauchen Sie das distale Ende des Endoskops für einige Sekunden in warmes Wasser, um die Bildung von Kondensat auf der Glasoberfläche zu minimieren. Führen Sie die Nadel vorsichtig in den Bereich der linken Stimmlippe ein, wobei Sie die visuelle Rückmeldung vom Monitor als Orientierungshilfe nutzen. Sobald die Stimmlippe vollständig sichtbar ist, injizieren Sie die Nadel in den linken Schilddrüsen-Aryknorpel, seitlich neben dem weißen, medialen Rand der Stimmlippe.Und drücken Sie den Kolben, um die Behandlung zu verabreichen. Falls der Kehldeckel fest verschlossen ist und eine klare Sicht auf den Kehlkopf verhindert, verwenden Sie eine aufwärts gerichtete, schwungvolle Bewegung mit der Kanülenspitze, um das Gewebe vorsichtig zu lösen. Ziehen Sie anschließend die Nadel heraus und stellen Sie das Tier in seinen Heimkäfig auf eine Heizplatte, bis es vollständig wieder liegend ist.In der Regel wird bei mit Neurotrophin 4 behandelten Tieren im Alter eine Veränderung der Fasermorphologie beobachtet. Bei alten, mit Neurotrophin behandelten Tieren wird außerdem ein geringeres Maß an Fibrose und Faserneubildung festgestellt. Gleichzeitig ist die Anzahl der neuromuskulären Verbindungen erhöht.Wenn einmal beherrscht, kann die Osmosepumpe sowie das Injektionsverfahren jeweils in einer Stunde abgeschlossen werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt werden. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, langsam und schonend mit der Nadel vorzugehen, um Kratzer und Verletzungen im Kehlkopfbereich zu vermeiden. Obwohl diese Methode Einblicke in die Mechanismen der Stimmfaltenfunktion während des Alterungsprozesses liefern kann, ist sie auch auf andere Systeme wie den Pharynx und schluckbezogene Störungen übertragbar.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieser Artikel zeigt zwei sehr unterschiedliche Methoden der Injektion: 1) in das Gehirn (intracerebroventrikuläre) und 2) systemischen (intravenösen), um die therapeutischen Wirkstoffe in das zentrale Nervensystem von neugeborenen Mäusen einzuführen.

Abgabe therapeutischer Wirkstoffe durch intracerebroventrikuläre (ICV) und intravenöse (IV) Injektion in Mäuse

Wir beschreiben Verfahren für die wiederholte Gabe von Inhibitoren der Muskarin-Signalisierung an die levator auris longus (LAL) Muskel junger erwachsener Mäuse und für die anschließende Immunfärbung der neuromuskulären Synapsen (NMJs) in wholemounts. Der LAL-Muskel hat einzigartige Vorteile für die...

Subkutane Verabreichung von Muscarinic Antagonisten und Triple-Immunfärbung der Levator Auris longus in Mäuse

Quelle: Andreatta, R. D. et. al., Subkutane Neurotrophin 4-Infusion mit osmotischen Pumpen oder direkter Muskelinjektion verbessert die alternden Kehlkopfmuskulatur von Ratten. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Infusion von Neurotrophin 4 (NTF4) in einem gealterten Rattenmodell zur Wiederherstellung der Kehlkopfmuskelfunktion, die von altersbedingter Denervierung und reduzierten neuromuskulären Verbindungen betroffen ist. NTF4 löst die Nervenregeneration aus und fördert die Bildung...

Neurotrophin 4 Infusion zur Regeneration des Kehlkopfnervs bei einer gealterten Ratte

Riech ensheathing Zellen (OECs) sind Neuralleistenzellen, die das Wachstum der primären Riechzellen zu ermöglichen. Diese spezielle Eigenschaft kann für die zelluläre Transplantation verwendet werden. Wir stellen hier ein Modell der zellulären Transplantation basierend auf der Verwendung von OECs in einer Kehlkopfnervenschädigung-Modell.

Transplantation von olfaktorischen Zellen ensheathing zu Funktionswiederherstellung nach peripheren Nervenschäden Bewerten

Die Wirksamkeit der intramuskulären Aufnahme und des retrograden Transports von Molekülen zu den entsprechenden Motoneuronen hängt von der Lage der Injektionsstellen in Bezug auf die motorischen Endplatten (MEPs) ab. Hier beschreiben wir, wie MEPs auf der Skelettmuskulatur lokalisiert werden können, um den retrograden Transport von Tracern in die Motoneuronen zu optimieren.

Intramuskuläre Injektionen Entlang der motorischen Endplatten: eine minimal-invasive Ansatz zur Shuttle Tracers Direkt in Motoneuronen

Subkutane Implantation von osmotischen Pumpen bietet eine praktische Vorgehensweise für eine längere und konsistente Bereitstellung von Verbindungen. Dieser Ansatz wurde ausgiebig verwendet, um sowohl in Bauch- und Brust Aortenaneurysmen in Mäusen untersucht werden.

Subkutane Angiotensin-II-Infusion mit osmotischen Pumpen induziert Aortenaneurysmen bei Mäusen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur autologen Muskel-Stammzellen in der Nähe zu den wiederkehrenden laryngeal Nerv mit Hilfe eines elektrischen Nervenstimulator zu injizieren. Diese neuartige Technik kann nützlich für die Behandlung von equine rezidivierende Kehlkopf Neuropathie werden.

Nerv Stimulator-gesteuerte Injektion von autologen Stammzellen in der Nähe der Pferde Links wiederkehrende Laryngeal Nerv

Hier wird ein Protokoll zur Herstellung eines implantierbaren Systems zur in vivo-chronologischen Aufzeichnung evozierter und spontaner elektromyographischer Potentiale vorgestellt. Das System wird auf die Untersuchung der Reinnervation der Kehlkopfmuskulatur nach Einer Nervenverletzung angewendet.

Ein implantierbares System für die chronische In-Vivo-Elektromyographie

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Vorbereitung von Rattengespinkeln für histochemische neuromuskuläre Studien.

Vorbereitung der Stimmlippe der Ratte für neuromuskuläre Analysen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das in vivo Elektroporation und Denervierung des kranialen Musculus levator auris longus (LAL) kombiniert. Dieses Verfahren ermöglicht es, die mögliche Rolle von Muskelproteinen bei der Regeneration der neuromuskulären Synapse zu untersuchen.

Kombinierte In vivo Elektroporation und kurzfristige Reinnervation des kranialen Levator Auris Longus Skelettmuskel

Wir stellen ein Protokoll für die direkte Injektion des Vagusnervs bei Ratten vor, das die direkte Verabreichung von Medikamenten in den Nerv ohne Komplikationen nach der Injektion ermöglicht. Diese Methode gilt für präklinische neurologische Studien, bei denen das autonome Nervensystem manipuliert wird. Es kann für die direkte Nerveninjektion für andere Nerven bei Ratten und anderen Spezies verwendet werden, mit den notwendigen Modifikationen.

Direktes Vagusnerv-Injektionsprotokoll für Ratten

Erfahren Sie die Infusion von Neurotrophin 4 in Rattenlarynxmuskeln mittels osmotischer Pumpen oder direkter Injektion. Diese Methode ermöglicht Muskelremodellierung und verbessert die Stimmfunktion im Alter.

Subkutane Neurotrophin-4-Infusion unter Verwendung von Osmotik-Pumpen oder direkter Muskel-Injektion verbessert die Ratten-Larynx-Muskeln (Video) | JoVE Journal

Subkutane Neurotrophin-4-Infusion unter Verwendung von Osmotik-Pumpen oder direkter Muskel-Injektion verbessert die Ratten-Larynx-Muskeln

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