Neurobehavioral Bewertungen in einem Mausmodell der Neugeborenen hypoxisch-ischämische Hirnschädigung

Das übergeordnete Ziel der hypoxisch-ischämischen Operation bei Hirnverletzungen bei Neugeborenen, gefolgt von kognitiven und motorischen Tests, ist es, ein Mausmodell zur Untersuchung solcher Verletzungen und damit verbundener Hirnschäden zu haben. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zu hypoxisch-ischämischen Hirnverletzungen bei Neugeborenen zu beantworten, z. B. wie sich solche Verletzungen auf motorische und kognitive Funktionen auswirken. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie bekannt ist und häufig verwendet wird.

Es ist auch ein präklinisches Modell für Zerebralparese und Schlaganfälle bei Neugeborenen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die einseitige rechte Halsschlagader schwer zu identifizieren ist. Das Verfahren wird zusammen mit mir von Yoon-Kyum Shin, einem Doktoranden aus unserem Labor, demonstriert.

Nachdem Sie mindestens fünf P-Sieben-Mauswelpen betäubt haben, positionieren Sie ein Junges mit dem Bauch nach oben unter einem Seziermikroskop. Reinigen Sie dann den Hals mit Alkohol. Um die Operation zu beginnen, verwenden Sie eine Schere, um einen 0,7-Millimeter-Schnitt in den Hals zu machen.

Entfernen Sie dann vorsichtig das Fettgewebe mit einer Pinzette, bis die einseitige rechte Halsschlagader freiliegt. Anschließend wird mit einer 5-0-Naht die einseitige rechte Halsschlagader ligiert. Nähen Sie nun den Schnitt im Hals mit 5-0 Nylon und sterilisieren Sie den Schnitt.

Lassen Sie den Welpen dann etwa eine Stunde lang in einer 37 Grad Celsius warmen hypoxischen Kammer bei geöffnetem Deckel erholen. Setzen Sie eine weitere chirurgisch manipulierte Maus in die hypoxische Kammer ein, um sich zu erholen. Sobald die Welpen vollständig wach sind, schließen Sie den Kammerdeckel und verringern Sie den Gasgehalt, um hypoxische Bedingungen zu schaffen.

Nach 90 Minuten Hypoxie bringen Sie die hirnverletzten Welpen in ihre Käfige zurück. Bereiten Sie die Welpen eine Woche später wie zuvor auf die Operation vor, um nach Anzeichen für die Verletzung zu suchen. Machen Sie einen Schnitt in der Kopfhaut, um die Hirnläsion im posterolateralen Bereich der rechten Hemisphäre zu identifizieren.

Schauen Sie durch den halbtransparenten Schädel nach Hinweisen auf eine kortikale Verletzung und eine Hippocampus-Verletzung. Kategorisieren Sie die Welpen daher als verletzte oder unverletzte Kontrollen. Nach der Überprüfung die Kopfhaut mit einer Naht verschließen und den Schnitt sterilisieren.

Wenn die Mäuse sechs Wochen alt sind, bewerten Sie ihr Gedächtnis auf der Grundlage des Lernens und der Vermeidung eines adversiven Stimulus. Verwenden Sie für diese Aufgabe ein handelsübliches passives Vermeidungsgerät mit zwei Kammern. Platzieren Sie zunächst eine Maus für 30 Sekunden in das helle Fach der Box.

Öffnen Sie dann die Tür zwischen den Fächern und notieren Sie die Latenz des Tieres, um in das dunkle Fach zu gelangen. Es kann bis zu 300 Sekunden dauern, bis die Aufgabe ausgeführt ist. Wenn sich alle vier Gliedmaßen der Maus vollständig im dunklen Fach befinden, schließen Sie die Tür.

Verabreichen Sie dann zwei Sekunden lang einen elektrischen Fußschock von 1/2 Milliampere und setzen Sie die Maus wieder in ihren Käfig ein. Wiederholen Sie den Test 24 Stunden später. Lassen Sie der Maus dieses Mal volle 300 Sekunden Zeit, um in die dunkle Kammer zu fahren, und schocken Sie die Maus nicht.

Führen Sie den Leiterlauftest an den sechs Wochen alten Mäusen durch, um sowohl qualitative als auch quantitative Analysen zwischen subtilen Störungen der Motorik zu unterscheiden. Richten Sie zuerst das Leitergerät ein und dann eine Videokamera, um die Bewegungen einer Maus auf dem Gerät aufzuzeichnen. Platzieren Sie als Nächstes eine Maus auf dem Startfeld und beginnen Sie mit der Aufnahme mit der Videokamera.

Stellen Sie sicher, dass das Video die Beine in gutem Fokus zeigt. Wenn die Maus die letzte Blende des Leitergeräts berührt, stoppen Sie die Aufnahme. Bewegen Sie dann die Maus zurück auf das Startfeld und nehmen Sie die Maus erneut auf, wenn sie das Gerät überquert.

Führen Sie dies insgesamt viermal pro Maus an jedem Testdatum aus. Zählen Sie später bei der Analyse des Videos manuell die Anzahl der Ausrutscher, die von jedem Glied gemacht wurden, während das Video mit einer Geschwindigkeit von 1/10 abgespielt wurde. Wenn ein Ast zwischen den Stangen hindurchrutscht, stellt dies einen Schlupf dar.

Wenn die Mäuse sechs Wochen alt sind, beurteilen Sie ihre Griffstärke. Verwenden Sie einen Schub-/Zug-Dehnungsmessstreifen, der an einem dreieckigen Draht mit einem Durchmesser von zwei Millimetern befestigt ist, der an einer Platte befestigt ist. Positionieren Sie die Maus auf dem Bedienfeld und halten Sie sie am Schwanz.

Lassen Sie die Maus dann mit ihren Vordergliedmaßen gerade noch den Metalldraht erreichen. Sobald Mäuse den Draht greifen, ziehen Sie vorsichtig an ihrem Schwanz, bis sie ihren Griff loslässt. Das Gerät registriert die Spitzenkraft auf dem Draht in Gramm.

Wiederholen Sie diesen Test fünfmal, bevor Sie der Maus eine Pause gönnen. Während des Grifffestigkeitstests gibt es spürbare Bewegungen mit präzisen Leistungen. Versuchen Sie, diese Bewegungen über fünf Anstrengungen zu finden, bevor Sie die Maus mindestens eine Minute lang ruhen lassen, um ihre Muskelermüdung zu reduzieren.

Nachdem die Maus mindestens eine Minute lang geruht hat, wiederholen Sie die Serie mit fünf Versuchen erneut. Gönnen Sie der Maus dann eine weitere Pause und führen Sie die Serie ein letztes Mal für diesen Testtag durch. Verwenden Sie aus den Daten den Durchschnitt der drei größten Werte für beide Vordergliedmaßen oder für beide Vordergliedmaßen für die Analyse.

Nach der Entnahme der Gehirne von 14 Wochen alten Tieren, die an Hypoxie und Ischämie verletzt waren, wurden die Gehirne morphologisch so bewertet, dass sie keine kortikale Verletzung, eine leichte oder eine schwere Verletzung aufwiesen. Die gleichen Tiere wurden eine Woche zuvor mit einem MRT untersucht, was ebenfalls sehr aufschlussreich war. Selbst das morphologisch normale Gehirn zeigte leichte Verletzungen im Hippocampus.

Im Alter von sechs Wochen, fünf Wochen nach der Verletzung, wurden die Mäuse mit verschiedenen Verhaltensaufgaben bewertet. Mäuse, die durch Hypoxie-Ischämie verletzt wurden, waren kognitiv beeinträchtigt bei der 24-Stunden-passiven Vermeidungsaufgabe. Da nur die rechte Hemisphäre geschädigt wurde, zeigten die Mäuse hemiplegische motorische Funktionen.

Dies zeigte sich an der Differenz im prozentualen Anteil der Rutschen auf den Quersprossen der Leiter für jede Vordergliedmaße. Da die Griffkraft den motorischen Kortex im Gehirn betrifft, zeigten die normale und die kortikale Verletzungsgruppe Unterschiede in der Griffkraft. Es wurde kein Unterschied zwischen den normalen Kontrollen und den kategorisch unverletzten Mäusen beobachtet, aber die verletzten Mäuse waren deutlich beeinträchtigt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die einseitige rechte Halsschlagader ligiert, um eine neonatale hypoxisch-ischämische Maus zu erzeugen, und wie man eine nachfolgende Verhaltensanalyse durchführt. Es ist wichtig zu beachten, dass selbst wenn sieben Tage nach der Verletzung keine sichtbaren Schäden am kortikalen Gehirn zu sehen sind, ein MRT eine Hippocampusverletzung aufdecken kann. Es ist auch wichtig, daran zu denken, die Welpen sanft zu behandeln und die Operation so schnell wie möglich abzuschließen.

Welpen haben eine sehr schwache und dünne Haut, seien Sie also sehr vorsichtig.