Mikrofluidische Imaging-Durchflusszytometrie durch asymmetrische Detektion Zeitstreck-Optische Mikroskopie (ATOM)

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Vorbereitung und Verwendung eines asymmetrischen optischen Mikroskopiesystems mit Detektionszeit und -dehnung für die markierungsfreie, kontrastreiche Einzelzellbildgebung in ultraschneller mikrofluidischer Strömung. Der Hauptvorteil von ATOM besteht darin, dass es eine ultraschnelle Bilderfassung mit Zeilenscanraten von bis zu mehreren zehn Megahertz ermöglicht und gleichzeitig den Bildkontrast auf den unmarkierten Zellen verbessert. ATOM ermöglicht die komplexe morphologische Analyse zellulärer und subzellulärer Strukturen mit einem unzentrierten zellbasierten Assay bei bis zu 100.000 Zellen pro Sekunde, was mit der Standard-Durchflusszytometrie nicht möglich ist.

Um mit der Einrichtung des Systems zu beginnen, verwenden Sie einen Faserkollimator, um einen breitbandigen Femto- oder Pico-Sekundenlaser im nahen IR-Bereich an eine dispersive Singlemode-Glasfaser zu koppeln, die mit einem optischen Verstärker verbunden ist. Beleuchten Sie eine Transmissionsbeugungsabstufung mit dem Laser, um einen Spektralschauer zu erzeugen. Richten Sie die Gradierung nahe an der Spaltkonfiguration aus, um die Beugungseffizienz zu maximieren.

Konfigurieren Sie eine Teleskoprelais-Linsenanordnung in einem 4f-Bildgebungssystem, um den Spektralschauer auf die hintere Brennebene einer Objektivlinse unterhalb einer Probenplattform zu richten. Stellen Sie sicher, dass die Spektraldusche die hintere Blende der Objektivlinse ausfüllt. Platzieren Sie ein weiteres Objektiv mit einem Planspiegel an der hinteren Blende über der Probenplattform.

Stellen Sie die Objektive so ein, dass sich ihre Brennebenen überlappen. Stellen Sie sicher, dass der Spektralschauer die Bildebene doppelt durchläuft und demselben Pfad zurück zur Abstufung folgt. Platzieren Sie einen mikrofluidischen Chip auf der Probenplattform und stellen Sie sicher, dass die Spektraldusche über den mikrofluidischen Kanal fällt.

Lenken Sie das zurückgegebene Licht mit einem Strahlteiler um, nachdem es die Verschneidung durchlaufen hat. Trennen Sie das zurückgeworfene Licht mit einem weiteren Strahlteiler in zwei Strahlen. Verwenden Sie Faserkollimatoren, um die Strahlen mit Singlemode-Fasern unterschiedlicher Länge zu koppeln, um eine Zeitverzögerung zwischen den Strahlen einzuführen.

Verbinden Sie die Fasern über einen Faserkoppler und einen Fotodetektor mit einem Echtzeit-Oszilloskop. Stimmen Sie die Verstärkung des optischen Verstärkers ab, bis das Signal-Rausch-Verhältnis des optischen Signals größer als 10 Dezibel ist. Blockieren Sie dann etwa die Hälfte jedes zurückgegebenen Balkens mit Messerkanten-Balkenblöcken.

Passen Sie die Strahlblöcke an, bis die gemessene optische Leistung in jeder Faser etwa die Hälfte der Leistung vor dem Block beträgt. Stellen Sie sicher, dass sowohl die Oszilloskopbandbreite als auch die Abtastrate hoch genug sind, um die Bildauflösung nicht zu beeinflussen. Zu Beginn des Experiments verdünnen Sie Zellproben auf 10 bis 5. und 10 bis 6. Zellen pro Milliliter mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder Quellwasser.

Laden Sie dann die Zelllösung in eine 10-Milliliter-Spritze. Verbinden Sie die Spritze mit dem mikrofluidischen Kanaleinlass. Richten Sie den mikrofluidischen Kanalauslass auf ein Zentrifugenröhrchen.

Befestigen Sie die Spritze in einer Spritzenpumpe und stellen Sie die Durchflussmenge entsprechend der Kanalbreite ein. Wählen Sie die Anzahl der Datenpunkte aus, die für das Experiment gespeichert werden sollen. Erfassen und speichern Sie dann die optischen Signaldaten.

Digitalisieren Sie die Daten und exportieren Sie sie vom Oszilloskop auf einen Computer. Verarbeiten Sie die Daten in 2D-Bilder und extrahieren Sie eine Bibliothek mit Parametern aus den Bildern. Importieren Sie die Bilder in der Parameterbibliothek in ein Visualisierungsprogramm.

Weisen Sie jeder Achse einen relevanten Parameter zu, und wählen Sie den Datensatz aus, der als Streudiagramm angezeigt werden soll. Überprüfen Sie die Zellenbilder, die den einzelnen Gruppen im Diagramm zugeordnet sind, um Trends zu erkennen. Verwenden Sie manuelles Gating, oder zeigen Sie bei Bedarf zusätzliche Datasets für weitere Analysen an.

ATOM wurde verwendet, um kontrastreiche Einzelzellbilder von menschlichen Zellen und Phytoplankton aufzunehmen. Charakteristische Zellstrukturen wie Vakuolen, Pyrenoide und Geißeln sind auf den Phytoplanktonbildern zu sehen. Aus den ATOM-Bildern wurden Parameter wie Zellgröße und Zirkularität bestimmt, um Zellen für die zytometrische Analyse zu klassifizieren.

Die Klassifikationsergebnisse können als 2D-Streudiagramme dargestellt werden. Hier wurde das Volumen im Verhältnis zur Zirkularität für einen MCF7 in gelb und einen PBMC in rot dargestellt dargestellt. Für MCF7 wurden zwei Cluster beobachtet.

Durch die Identifizierung der kontrastreichen Bilder, die einzelnen Datenpunkten entsprechen, wurde festgestellt, dass der untere Cluster mit Zellfragmenten und Trümmern übereinstimmt. Einmal beherrscht, kann das Bildgebungssystem in zwei bis drei Stunden eingerichtet werden, wenn es richtig ausgeführt wird. Die bildgebenden Verfahren können innerhalb einer Stunde durchgeführt werden.

Vergessen Sie nicht, bei der Arbeit mit der Laserquelle und der Ausrichtung des Laserstrahls besonders auf die Augensicherheit zu achten. Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen einer Schutzbrille sollten bei der Durchführung dieser Verfahren immer getroffen werden. Denken Sie beim Versuch dieses Verfahrens daran, die Ausrichtung des optischen Strahls während des gesamten Einrichtungsprozesses des Bildgebungssystems zu überwachen, um eine optimale Bildqualität zu gewährleisten.

Während diese Technik Einblicke in die Erkennung und Quantifizierung seltener oder scheinbarer Zellen während des Krankheitsprozesses geben kann, kann sie auch auf die Zelltypklassifizierung innerhalb großer und heterogener Zellpopulationen angewendet werden. Diese Technik ist besonders vorteilhaft, wenn es darum geht, die Durchsatzbeschränkung der bildgebenden Zytometrie zu überwinden und gleichzeitig die Bildqualität zu erhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ATOM von der Systemeinrichtung bis zu den Bildgebungsverfahren implementieren.