Name: Mikrofluidische Imaging-Durchflusszytometrie durch asymmetrische Detektion Zeitstreck-Optische Mikroskopie (ATOM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Lernen Sie die asymmetrische Detektion Zeitstreck-Optische Mikroskopie (ATOM) für hochkontrastreiche, markierungsfreie Einzelzellbildgebung in ultrafastem mikrofluidischem Fluss. Diese Methode ermöglicht die Analyse von bis zu 100.000 Zellen pro Sekunde.

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Wir danken Herrn P. Yeung für die Vorbereitung der MCF-7 für uns. Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse des Forschungsstipendienrats der Sonderverwaltungsregion Hongkong, China (Projekt Nr. 17259316, 17207715, 17207714, 17205215 und HKU 720112E), dem Programm für Innovation und Technologie (ITS / 090/14 ) Und dem Universitätsentwicklungsfonds der HKU.

1. Probenvorbereitung <ol><li> Probenvorbereitung (adhärente Zellen, MCF-7-Zellen) <ol><li> Nehmen Sie die Zellkulturschale aus dem Inkubator heraus und entleeren Sie das Kulturmedium. </li><li> Spülen Sie die Zellen auf einer Schale mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um überschüssiges Kulturmedium zu entfernen. </li><li> Füge 3 ml einer Lösung von 0,25% Trypsin zur Kulturschale (Durchmesser von 100 mm) hinzu und lege sie in einen 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator für 4 min. HINWEIS: Das Trypsin löst das adhäsive Protein der Zellen auf, so dass sie sich von der Kulturschale lösen. </li><li> Überprüfen Sie, ob sich alle Zellen mit einem Lichtmikroskop (10X-Objektiv) von der Kulturschale gelöst haben. Wenn nicht, schütteln Sie die Zellkulturschale vorsichtig. </li><li> Fügen Sie 4 ml des Standardkulturmediums hinzu (formuliert mit 89% Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin (PS)), um die Wirkung des Trypsins zu stoppen. </li><li> TRunden die gesamte Mischung (Zellen in Trypsinlösung und Kulturmedium) zu einem Zentrifugenröhrchen ab und zentrifugieren für 5 min bei 200 x g. </li><li> Entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit und setzen Sie die Zellen in 1 ml 1x PBS (pH-Wert: 7,4, vorgewärmt auf 37 ° C) wieder auf. </li></ol></li><li> Probenvorbereitung (kultivierte Mikroalgen) <ol><li> Übertragen Sie die kultivierten Mikroalgen und das Kulturmedium ( zB Meerwasser, Agar oder Süßwasser) auf neue Glaskulturröhrchen (~ 15 ml) in einem Volumenverhältnis (Mikroalgen zu Kulturmedium) von 1: 5 Ein neues Subkulturmedium. </li><li> Legen Sie die Glaskulturrohre in eine staubdichte Kammer unter ständiger Beleuchtung durch künstliche Beleuchtung von Leuchtstofflampen nach einem Licht / Dunkel (LD) Zyklus (meist LD 16: 8) für 72 - 120 h vor dem Experiment. </li><li> Die subkultivierten Proben in ein Zentrifugenröhrchen überführen und gut vermischen. </li></ol></li></ol> 2. ATOM System Setup Abbildung 1: Schema eines ATOM-Systems. Ein breitbandiger gepulster Laser wird verwendet, um ultraschnelle Impulse an ( a ) ein Zeitstreckmodul und ( b ) ein optisches Inline-Verstärkermodul zu liefern. Das Zeitstreckmodul erzeugt eine Folge von zeitlichen Wellenformen, von denen jede die Replik des Wellenlängenspektrums der Laserquelle ist ( dh eine Wellenlängen-zu-Zeit-Abbildung). Das Verstärkermodul dient zur Pulsstreckung (dispersive) Verlustkompensation. Der gestreckte Puls wird dann ( c ) räumlich durch ein Beugungsgitter dispergiert, wobei eine 1D-Spektralduschenbeleuchtung gebildet wird, bei der einzelne Wellenlängenkomponenten durch ein Relaislinsenpaar weitergeleitet und durch die Objektivlinse auf unterschiedliche Positionen auf der fließenden Zelle innerhalb des ( d ) Mikrofluidischen Chip. Dies ist der Prozess der spektralen Kodierung. DasSpektral codiertes Licht wird die Zelle wieder durch eine andere Objektivlinse und einen Spiegel passieren, kehrt zum Beugungsgitter zurück und rekombiniert als räumlich undispergierter Pulsstrahl. Dieser bildkodierte gepulste Strahl ist dann ( E ) in zwei Pfade aufgeteilt sind, so dass beide Strahlen teilweise mit ( f ) der Messerkante, aber aus entgegengesetzten Richtungen blockiert werden, bevor sie in die Fasern eingekoppelt werden. Diese beiden Strahlen repräsentieren die beiden (entgegengesetzten) codierten Phasen-Gradienten-Kontraste des endgültigen Bildes. Für die gleichzeitige Erfassung beider Signalkontraste erfährt eines der Signale ( g ) eine Zeitverzögerungsleitung, so dass die beiden Signale zeitlich gemultiplext (verschachtelt) werden. Für die Datenerfassung werden ein Hochgeschwindigkeits-Photodetektor und ein Echtzeit-Oszilloskop verwendet. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55840/55840fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol><li> Zeit st<html> Retch-Modul <ol><li> Verwenden Sie eine breitbandige Femtosekunden- (psose-) oder pikosekunden- (ps) gepulste Laserquelle mit einer empfohlenen Mittenwellenlänge im nahen Infrarotbereich (NIR), 800-1500 nm. HINWEIS: Die typische erforderliche Pulsbreite kann von Sub-100 fs bis zu einigen ps reichen. Detaillierte Anforderungen der gepulsten Laserquellen sind in den Verweisen 4 und 5 zu sehen. Wichtige Kennzahlen sind in Tabelle 1 hervorgehoben . <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die Laserquelle eine hohe Wiederholrate hat, die im Megahertz-Regime ( z. B. Dutzende MHz) liegen sollte, um eine ultraschnelle Bildgebung in ATOM zu gewährleisten. Stellen Sie auch die Spitzenleistung der Laserleistung weit unter die Schadensschwelle des Faserhohlraums, ca. 1 kW. </li><li> Sicherstellung einer guten Schuss-zu-Schuss-Zeit- und Spektralstabilität der gepulsten Laserquelle. HINWEIS: Typische Toleranz bei der spektralen Amplitudenschwankung sollte innerhalb von 1,2% gehalten werden 19 , 20 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 21, wie es der Faser-Modus-verriegelte Laser in diesem Setup erreicht hat. HINWEIS: Die optische Bandbreite der Laserquelle wird voraussichtlich 10-100 nm betragen, was für eine ausreichende Bildgebung (FOV) in der Einzelzell-Bildgebung wesentlich ist. </li></ol></li><li> Durch einen Faserkollimator koppeln Sie den lasergepulsten Strahl zu einer einmodendispersiven optischen Faser, in der die Impulse über die Gruppengeschwindigkeitsdispersion (GVD) gestreckt werden ( Abbildung 1a ). HINWEIS: Dies ist der Prozess, nach dem das Spektrum jedes Pulses auf die Zeit als eine wellenlängengespannte Wellenform ( dh eine Wellenlängen-zu-Zeit-Abbildung) abgebildet wird. HINWEIS: Die gesamte erforderliche GVD sollte ausreichen, um sicherzustellen, dass die gesamte ATOM-Bildauflösung nicht durch den Wellenlängen-zu-Zeit-Mapping-Prozess beeinflusst wird (siehe Diskussion). Typischerweise sollte die GVD im NIR-Bereich weit über 0,1 ns / nm liegen. Zum Beispiel ist eine Einmodenfaser, die in thi verwendet wirdS Stromaufbau liefert eine Gesamt-GVD von 0,38 ns / nm um die Wellenlänge von 1.060 nm (eine Gesamtfaserlänge von 10 km). </li></ol></li><li> Spektralkodierungsmodul <ol><li> Konstruieren Sie ein optisches Mikroskopsystem, um die spektral codierte Abbildung der Zellen, die entlang des mikrofluidischen Kanals fließen, durchzuführen, wie in 1 dargestellt . HINWEIS: Die Schlüsselkomponenten dieses optischen Mikroskops sind: (1) ein Beugungsgitter, ein teleskopisches Relaislinsenmodul (RL1 und RL2 in Abbildung 1 ) und zwei Objektivlinsen (Obj1 und Obj2 in Abbildung 1 ). <ol><li> Zuerst beleuchten Sie den zeitgesteuerten und kollimierten Strahl auf ein Beugungsgitter (Transmissionstyp-Gitter wird in diesem Aufbau verwendet), um eine spektrale Dusche zu erzeugen ( Abbildung 1c ). HINWEIS: Die Leistung des gebeugten Strahls ( dh die Beugungseffizienz) kann durch Einstellen von t maximiert werdenEr Rasterorientierung für die Littrow-Konfiguration geschlossen. </li><li> Konfigurieren Sie die beiden Relaislinsen (RL1 und RL2) in einem 4-f-Bildsystem ( dh legen Sie das Beugungsgitter auf die Brennebene von RL1 und trennen Sie RL1 und RL2 um einen Abstand, der der Summe ihrer Brennweiten entspricht Wird dann auf die hintere Brennebene der Objektivlinse Obj1 abgebildet). </li><li> Die Spektraldusche sorgfältig ausrichten, um die hintere Blende des Obj1 zu füllen, so dass die spektrale Dusche projiziert und auf die Bildebene des Mikroskops fokussiert werden kann. HINWEIS: Hier ist die NA der Objektivlinse (Obj1 in Abbildung 1 ) 0,75. </li><li> Legen Sie eine weitere Objektivlinse (Obj2 in Abbildung 1 ) mit einem ähnlichen NA und einem Planspiegel an der hinteren Blende dieser Objektivlinse (Obj2), so dass der spektrale Duschstrahl so ausgerichtet werden kann, dass er die Bildebene verdoppelt und zurückkehrt Beugungsgitter. </li><li> EinstellenDas Objektivobjektiv (Obj1 und Obj2), so dass sich ihre Fokalebenen einander überlappen. Überprüfen Sie, ob die spektrale Dusche die Bildebene am selben Ort verdoppelt und kehrt nach demselben Weg zum Gitter zurück. Wenn nicht, führen Sie eine weitere Ausrichtung und Abstimmung des optischen Systems durch. HINWEIS: Das zurückgeführte Licht sollte durch einen zusätzlichen Strahlteiler gehen, so dass das Licht auf ein asymmetrisches Detektionsmodul übertragen werden kann. </li><li> Die Verstärkung des optischen Verstärkers auf einen geeigneten Pegel einstellen, so dass das resultierende Signal vom Photodetektor mit einem guten SNR detektiert werden kann, das typischerweise bei&gt; 10 dB liegt. </li><li> Legen Sie die Position des mikrofluidischen Chips auf die Probenplattform und stellen Sie sicher, dass die spektrale Dusche und damit der Abbildungsbereich über dem mikrofluidischen Kanal platziert ist ( Abbildung 1d ). HINWEIS: Die spektrale Dusche wird orthogonal zur Strömungsrichtung der Fluidik im Inneren des m beleuchtetMikrofluidischen Chip, so dass die fließende Bewegung automatisch zweidimensionale (2D) Scans durchführt. </li></ol></li></ol></li><li> Asymmetrisches Detektionsmodul <ol><li> Legen Sie einen zusätzlichen Strahlteiler, um den abgebildeten Strahl in zwei zu trennen ( Abbildung 1e ). HINWEIS: Jede Balkenreplik ist teilweise durch eine Messerkante blockiert. </li><li> Messen und Aufzeichnen der optischen Leistung des Strahls vor dem Strahlblock. Dann die Messerkanten manuell positionieren (auf einer linearen Translationsstufe montiert), so dass sie die Hälfte des Strahls grob blockieren (durch visuelle Inspektion). Danach verwenden Sie das optische Leistungsmessgerät, um die Strahlleistung zu überwachen, während Sie die Position der Messerkanten fein abgestimmt haben, indem Sie sie über den Strahl übersetzen. HINWEIS: Es wird vorgeschlagen, dass die optimale Position dort ist, wo die Leistung um ~ 50% des ursprünglichen Wertes verringert wird ( dh der unblockierte Fall). Dies ist die Bedingung, die die beste Kombination von Bildsignal liefertKraft- und Bildkontrastverstärkung. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.3.2 für eine andere Strahlreplik. Beachten Sie, dass die Orientierung des Teilstrahlblocks für einen Strahl gegenüber dem anderen Strahl entgegengesetzt sein sollte ( Abbildung 1f ). </li><li> Die beiden teilweise blockierten Strahlen in zwei getrennte Einmoden-Faserarme durch Zweifaser-Kollimatoren vermengen. HINWEIS: Einer der Arme hat eine zusätzliche Faserlänge, die als faserbasierte Verzögerungslinie dient, um eine zeitliche Verzögerung in Bezug auf die andere Replik (ohne die Verzögerungslinie) einzuführen ( Abbildung 1g ). Beide werden vor der Photodetektion auf eine einzige Faser durch einen Faserkoppler gerichtet. Die Zeitverzögerung sollte lang genug sein, um die beiden Repliken zeitweise zu trennen und kurz genug zu sein, um eine zeitliche Überlappung mit der nächsten Wellenform zu vermeiden ( dh die beiden Repliken sind immer zeitverschachtelt und zeitmultiplexiert in einer einzigen Faser vor der Detektion ( Abbildung 2a )). </li><li> KappeTrennen und digitalisieren die detektierten optischen Signale mit dem Echtzeit-Oszilloskop. Beachten Sie, dass die Bandbreite und damit die Abtastrate des Oszilloskops ausreichend hoch sein sollte, um sicherzustellen, dass sie die endgültige Bildauflösung nicht beeinflussen (siehe Diskussion). HINWEIS: Hier ist bei der GVD von 0,38 ns / nm eine Backend-Erfassungsbandbreite und eine Abtastrate von&gt; 20 GHz bzw.&gt; 40 GSa / s erforderlich. </li></ol></li></ol> 3. Experimentelle Verfahren <ol><li> Probenbeladung <ol><li> Führen Sie die Zellzählung unter einem herkömmlichen Phasenkontrastmikroskop in einem Standard-Hämocytometer durch. </li><li> Die Zelldichte durch Verdünnen mit 1x PBS (mit Quellwasser für Mikroalgen) anpassen und gut mit einer Pipette vermischen. HINWEIS: Die vorgeschlagene Konzentration beträgt 10 5 bis 10 6 Zellen / ml. </li><li> Montieren Sie den mikrofluidischen Chip auf die Probenplattform des optischen Abbildungssystems. HINWEIS: Die mikrofluidischeChip besteht hauptsächlich aus Polydimethylsiloxan (PDMS) und wird nach dem Standard-Replik-Formverfahren hergestellt. Der mikrofluidische Kanal ist mit einem asymmetrisch gekrümmten Kanal ausgelegt, um den inertialen Strömungsfokussierungseffekt zu erzeugen, so dass die Zellen in einer Einzeldatei im Abbildungsabschnitt (mit einer Abmessung von 80 μm x 80 μm (Höhe x Breite)) mit hoher Geschwindigkeit fließen können . </li><li> Übertragen Sie die Dichte-fixierte Zelllösung auf eine 10-ml-Spritze. </li><li> Verbinden Sie die Spritze mit dem Einlass des mikrofluidischen Chips und einem Zentrifugalrohr zum Auslass des mikrofluidischen Chips für die Entsorgung. </li><li> Montieren Sie die Spritze auf eine Spritzenpumpe und stellen Sie eine geeignete Durchflussrate ein, um einen wünschenswerten Durchsatz zu erzielen und um eine übermäßige Scherkraft zwischen den Zellen und dem Kanal zu vermeiden. HINWEIS: Die lineare Geschwindigkeit der Proben sollte innerhalb von 0,5 und 10 m / s liegen. Beachten Sie, dass vor der eigentlichen Bildaufzeichnung oftmals eine Feinabstimmung des Systems erforderlich istBildsignalstärke und Optimierung der Bildfokussierung durch Wiederholen der Schritte 2.2.1.4-2.2.1.6. </li></ol></li></ol> 4. Datenerfassung <ol><li> Legen Sie für jedes Experiment eine geeignete Anzahl von Datenpunkten fest. Die Anzahl der zu speichernden Datenpunkte hängt von der Größe und dem Durchfluss der Proben ab. HINWEIS: In der Regel ist es auf 8-16 Millionen Probenpunkte unter einer Abtastrate von 80 GSa / s eingestellt. </li><li> Erfassen und Speichern der Daten im Batch-Modus mit dem Oszilloskop. </li></ol> 5. Backend-Verarbeitung <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55840/55840fig2.jpg" /> Abbildung 2: Rekonstruktion von ATOM-Bildern aus der Line-Scan-Zeitspur. Zur Rekonstruktion der ATOM-Bilder mit dem Absorptionskontrast und dem differenziellen (verstärkten) Phasenkontrast werden zwei Sätze von zeitgesteuerten Impulsen (siehe die violetten und grünen Impulse) extrahiert( A ) die zeitmultiplexierte zeitliche Wellenform-Spur und werden dann digital segmentiert und gestapelt, um ( b ) zwei 2D-Bilder zu bilden, die die beiden entgegengesetzten Phasen-Gradienten-Kontraste zeigen. Beachten Sie, dass ein Schervorgang erforderlich ist, um ( c ) die verzerrungsfreien Bilder zu bilden, indem die Subindexverschiebung aufgrund des Rundungsfehlers in der Laserwiederholungsratenschätzung kompensiert wird. Durch Subtrahieren der ( d ) Rohlinienabtastung von der spektralen Intensitätshüllkurve der Laserquelle kann der Hintergrund der Bilder entfernt werden. ( G ) Ein Absorptionskontrastbild kann durch eine Pixel-für-Pixel-Intensitätssummierung der Bilder ( e ) und ( f ) erhalten werden, während ( h ) ein Differenzphasen-Gradienten-Kontrastbild aus der Subtraktion von Bildern (z.B. ) Und (f). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55840/55840fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen</a>Dieser Figur. <ol><li> Übertragen Sie die Daten vom Oszilloskop auf die Computer für die Offline-Bildrekonstruktion. HINWEIS: Hier werden die Daten auf einer tragbaren Festplatte gespeichert und manuell zwischen dem Oszilloskop und den Verarbeitungscomputern übertragen. Die Kapazität der Festplatte sollte für jedes Experiment mehr als 500 GB betragen. <ol><li> Verwenden Sie die Schlüsselbild-Rekonstruktionsroutine, um die Zeilen-Scans digital zu digitalisieren, um ein 2D-Bild zu bilden ( Abbildung 2 ). HINWEIS: Das benutzerdefinierte Programm (in MATLAB) erzeugt dann zwei asymmetrische Erfassungsbilder, indem die beiden zeitmultiplexten Datensätze (violette und grüne Wellenformen in Abbildung 2 ) getrennt werden. <ol><li> Erhalten eines Differenzphasen-Gradienten-Kontrastbildes durch Subtrahieren der Intensitäten der beiden asymmetrischen Erfassungsbilder; Kann ein Absorptionskontrastbild durch Addition der beiden asymmetrischen Erfassungsbilder erhalten werden. Sehen Sie ausgewählte Bilder von MCF-7 und Mikroalgen inAbbildung 3 Beachten Sie, dass die Hintergrundprofile einzelner Bilder zunächst eliminiert und ihre Intensitäten vor der Bildsummierung und Subtraktionsoperationen normalisiert werden sollten. </li></ol></li><li> Generieren Sie eine Bibliothek von Parametern, die aus den Bildern abgeleitet sind, wie z. B. Zellvolumen, Kreisförmigkeit und Absorptionsdichte, etc. für die weitere Analyse. </li></ol></li><li> Geben Sie die Datenbibliothek in die Datenvisualisierungsplattform ein ( Abbildung 4 ). <ol><li> Laden Sie die Bibliothek der Parameter und die entsprechenden rekonstruierten Bilder auf die Visualisierungsschnittstellenplattform. </li><li> Setzen Sie die Achsen auf die Parameter von Interesse. HINWEIS: Die Parameter sind problemspezifisch und werden vom Benutzer definiert. Sie werden aus den ATOM-Bildern vom MATLAB-Programm abgeleitet. Hier ist die optische Absorptionsdichte der Zelle, des Zellbereichs, des Zellvolumens und der Zellkreisförmigkeit zur Auswahl verfügbar. </lI&gt; <li> Wählen Sie den anzuzeigenden Datensatz aus, damit jedes Zellbild als unterschiedlicher Datenpunkt auf dem Streudiagramm visualisiert werden kann. </li><li> Bewegen Sie den Mauszeiger auf jeden Punkt, so dass das entsprechende Bild und andere Parameter in einem schwebenden Unterfenster angezeigt werden. HINWEIS: Die Achsen können zwischen den linearen und logarithmischen Skalen interaktiv geändert werden. </li><li> Führen Sie eine weitere Analyse einer beliebigen Teilmenge des Datensatzes durch manuelles Verschieben auf dem Streudiagramm durch. HINWEIS: Das Histogramm in jedem Parameter der gated Teilmenge kann gegen die der gesamten Bibliothek aufgetragen werden. Die separaten Histogramme werden in einem anderen schwimmenden Unterfenster angezeigt. </li></ol></li></ol>

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<li>Hodgkinson, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenicity+and+genetic+profiling+of+circulating+tumor+cells+in+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer.</a> Nat Med. 20 (8), 897-903 (2014).</li>
<li>Ozkumur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+focusing+for+tumor+antigen-dependent+and+-independent+sorting+of+rare+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells.</a> Sci Transl Med. 5 (179), (2013).</li>
<li>Hou, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+retrieval+of+circulating+tumor+cells+using+centrifugal+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces.</a> Scientific Reports. 3, 1259(2013).</li>
<li>Karabacak, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marker-free+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples.</a> Nat. Protocols. 9 (3), 694-710 (2014).</li>
<li>Krebs, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+circulating+tumour+cells-biology+and+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of circulating tumour cells-biology and biomarkers.</a> Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 129-144 (2014).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Es gibt mehrere technische Details, die während des ATOM-Systemaufbaus besondere Aufmerksamkeit erfordern. Zunächst ist zu beachten, dass asymmetrische / schräge spektral-kodierte Beleuchtungen im Absorptionskontrast Restphasen-Gradienten-Komponenten ( dh die Shadowing-Wirkung) einführen und die Verstärkung des Phasenkontrastes in ATOM beeinflussen können. Daher sollte dieser Effekt der Schrägbeleuchtung minimiert werden. Zweitens sollte betont werden, dass das Zeitmultiplex- oder Zeitverschachtelungsschema, da...

Die optische Bildgebung stellt ein leistungsstarkes Werkzeug und zellbasiertes Assay dar, um die detaillierte räumliche Verteilung vieler zellulärer / subzellulärer Komponenten (fast) nicht-invasiv zu visualisieren und so eine Vielzahl von morphologischen, biophysikalischen und biomolekularen Signaturen von Zellen aufzudecken. Allerdings wurde diese Fähigkeit, hochinhaltswerte Informationen aus einzelnen Zellen zu extrahieren, im Allgemeinen beeinträchtigt, als eine enorme und heterogene Population von Zellen untersucht werden musste. Dies markiert einen gemeinsamen Kompromiss in zellbasierten Assays zwischen Messdurchsatz und Inhalt. Ein bemerkenswertes Beispiel ist, dass das Hinzufügen von bildgebenden Fähigkeiten zur Durchflusszytometrie zu einer Abwärtsskalierung des Durchsatzes um mindestens 1-2 Größenordnungen im Vergleich zu dem der klassischen nicht-bildgebenden Durchflusszytometer geführt hat. Obwohl es eine komplexe morphologische Einzelzellanalyse anbieten könnte, die bei Standard-Durchflusszytometern 1 nicht möglich ist, fehlt der Imaging-Durchflusszytometrie im Allgemeinen ein ausreichender Durchsatz an idVermitteln zelluläre Heterogenität mit hohem statistischem Vertrauen. Dies ist notwendig für neue Entdeckungen in der Biologie und für ein Verständnis der Pathogenese von Krankheiten. Die zentrale technische Herausforderung liegt in der inhärenten Geschwindigkeitsbegrenzung, die durch die üblichen optischen Abbildungsstrategien auferlegt wird: Laserstrahlabtastung ( z. B. durch galvanometrische Spiegel) und / oder Bildsensoren ( z. B. ladungsgekoppelte Vorrichtung (CCD) und komplementäre Metall- Oxid-Halbleiter (CMOS)). Die Laserscangeschwindigkeit wird durch die mechanische Trägheit der Abtastspiegel intrinsisch eingeschränkt, während die Bildrate von CCD oder CMOS durch den grundsätzlichen Kompromiß zwischen Abbildungsgeschwindigkeit und Empfindlichkeit begrenzt wird ( dh die Erhöhung der Bildrate führt zu einer reduzierten Signaldetektionsempfindlichkeit , und umgekehrt). Basierend auf einem all-optischen, ultraschnellen Bildkodierungsmechanismus wurde die optische Zeitstreck-Bildgebung als eine attraktive Plattform für den Hochdurchsatz-Durchflusszyklus gezeigtOmeter ohne Notwendigkeit der herkömmlichen Bildsensoren oder mechanischen Laserscans 2 , 3 . Ausführliche Beschreibungen des Arbeitsprinzips der Zeit-Streck-Bildgebung finden sich in den Referenzen 4 , 5 , 6 , 7 . Kurz gesagt besteht sie aus zwei austauschbaren Abbildungsschritten: (i) spektrale Kodierung (Wellenlängen-Raum-Abbildung), bei der die räumlichen Koordinaten der abgebildeten Probe auf unterschiedliche Wellenlängen über das Spektrum des lichtgepulsten Strahls 8 , 9 abgebildet werden, Und (ii) eine dispersive Fourier-Transformation (Wellenlängen-Zeit-Abbildung) 9 , bei der die Wellenlängenkomponenten einzelner Laserpulse über Gruppengeschwindigkeitsdispersion (GVD) in zeitliche (wellenlängengespannte) Wellenformen transformiert (gestreckt) werden ( Abbildung 1 ). Ein wichtigerMerkmal der Zeitstreck-Bildgebung ist die optische Verstärkung, die bei der Bekämpfung des Verlustes der Empfindlichkeit durch ultraschnelle Photodetektion und GVD-Verlust eine entscheidende Rolle spielt, wodurch das Bildsignal-Rausch-Verhältnis (SNR) verbessert wird, ohne dass es durch das Photodetektorrauschen 9 verunreinigt wird . Da jeder Laserpuls eine Zeilenabtastung der abgebildeten Probe kodiert, die orthogonal zum unidirektionalen Fluss der Zellen ist, wird eine effektive Zeilenabtastrate durch die Laserwiederholrate bestimmt, die typischerweise über 10 MHz hinausgeht. Diese ultraschnelle Operation ermöglicht eine unscharfe, einzellige Bildaufnahme bei einem Durchsatz von 10.000-100.000 Zellen / s ( dh 10-100 mal höher als herkömmliche Bildgebungsdurchflusszytometrie). Infolgedessen konnte die Zeitstreckungsdarstellung im Hochdurchsatz-, Einzelzell- und bildbasierten Screening einzigartige Anwendungen finden, insbesondere wenn es notwendig ist, unbekannte Heterogenität oder seltene / aberrante Zellen innerhalb einer beträchtlichen Population zu identifizieren (Tausende bis Millionen von Cel<html> Ls), wie seltene Krebszellen-Screening 10 oder Mikro-Algen-Klassifizierung 11 . Die Time-Stretch-Bildgebung beruht vorwiegend auf einer Hellfeld-Feldaufnahme (BF), aus der der Bildkontrast durch Lichtstreuung und Absorption aus den Zellen 2 , 3 , 9 , 10 , 11 erzeugt wird . Solche etikettfreien, einzelligen Bildgebungsfähigkeiten könnten die nachteiligen Effekte, die mit den fluoreszierenden Markierungen verbunden sind, wie z. B. Zytotoxizität und Photobleichung, umgehen und dennoch wertvolle Informationen für die Einzelzellanalyse basierend auf der zellulären und subzellulären Textur und Morphologie liefern. Diese etikettfreien Parameter erwiesen sich als wirksam für die Tiefenbildklassifizierung von Zellen, besonders wenn eine enorme Zellpopulation verfügbar ist 11 ,&quot;Xref&quot;&gt; 12 Allerdings stellt die BF-Bildgebung in vielen Fällen keinen ausreichenden Kontrast dar, um die detaillierte Morphologie der etikettfreien transparenten Zellen zu zeigen. Für die Verbesserung des bildgebenden Kontrastes bei ultraschnellen Bildraten 13 , 14 , 15 wurden verschiedene etikettfreie, phasenkontrast- und zeitstreckenbildende Modalitäten entwickelt. Unter diesen Techniken wurde eine asymmetrische Erkennungszeit-Streck-Optikmikroskopie (ATOM) entwickelt, um den Phasendifferenz- (Differential-Interferenz-Kontrast- (DIC) -ähnlichen) Kontrast auf der Grundlage eines Konzepts ähnlich der Schlieren-Fotografie zu zeigen, Freie, kontrastreiche Bildgebung einzelner Zellen mit einer ultrahohen mikrofluidischen Geschwindigkeit (bis zu 10 m / s) 16 . Dieser Effekt kann leicht durch eine schräge Erfassung oder Beleuchtung durch teilweises Blockieren des bildkodierten Strahlengangs oder Kippen des Strahls vor der Photodetektion erzeugt werden. Ein weiterer Vorteil von ATOM ist seinUm gleichzeitig zwei Phasen-Gradienten-Kontraste entlang entgegengesetzter Orientierungen zu erwerben. Intensitäts-Subtraktion und Summierung von zwei entgegengesetzten Kontrastbildern ergeben den differenziellen Phasenkontrast bzw. den Absorptionskontrast aus dem gleichen Zeilen-Scan. Diese Arbeit stellt ein detailliertes Protokoll dar, das die Implementierung von ATOM beschreibt, einschließlich der Einrichtung des optischen Aufbaus, der Probenvorbereitung und der Datenerfassung und Visualisierung. Speziell zeigt diese Arbeit die ATOM-Operation mit der einzelligen Bildgebung von menschlichen Blutzellen, Krebszellen und Phytoplankton (Mikroalgen). Dies unterstreicht die Anwendbarkeit von ATOM auf die bildgebende Durchflusszytometrie nicht nur im biomedizinischen Bereich, sondern auch in der Meeres- und Biokraftstoffforschung 17 , 18 .

<table><tbody><tr><td>Nikon Plan Fluorit Physiologie Objektive 40X</td><td>Nikon</td><td>MRF07420</td><td>Objektiv (Obj2)</td></tr><tr><td>Olympus Plan Fluorit Objektiv, 0,75 NA, 0,51 mm WD, 40X</td><td>Olympus</td><td>RMS40X-PF</td><td>Objektiv (Obj1)</td></tr><tr><td>N-BK7 Plankonvexe Objektive</td><td>Thorlabs</td><td>LA1145-C</td><td>Zum Weiterleiten von Spektralduschen</td></tr><tr><td>FC/APC Faserkollimationspaket</td><td>Thorlabs</td><td>F220APC-1064</td><td>Zum Ausgeben und Sammeln von Laserpulsen</td></tr><tr><td>Pellicle Strahlteiler</td><td>Thorlabs</td><td>BP145B3</td><td>Zur Herstellung von Strahlrepliken</td></tr><tr><td>Geschützter Silberspiegel</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>Zur Reflexion von Licht</td></tr><tr><td>800-1650nm 12GHz Singlemode DC-gekoppelter NIR-Fotoempfänger</td><td>Newport</td><td>1544-B</td><td>Zur Umwandlung von Licht in elektrisches</td></tr><tr><td>Signal Infiniium Hochleistungsoszilloskop</td><td>Agilent</td><td>DSOX91604A</td><td>Zur Speicherung der lichtkonvertierten elektrischen Signale</td></tr><tr><td>HI1060 Glasfaser</td><td>Corning</td><td>HI1060</td><td>Glasfaser für Time-Stretch</td></tr><tr><td>YTTERBIUM DOTIERTER FASERVERSTÄRKER</td><td>Keopsys</td><td>KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA</td><td>Optischer Inline-Verstärker</td></tr><tr><td>Holographisches Gitter</td><td>Wasatch Photonics</td><td>020305-6</td><td>Gitter</td></tr><tr><td>Infusions-/Entnahmespritze Pumpen</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD 2000</td><td>Spritzenpumpe für die Probenbeladung in mikrofluidischen Kanälen</td></tr></tbody></table>

mikrofluidische imaging-durchflusszytometrie durch asymmetrische detektion zeitstreck-optische mikroskopie (atom)

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Die Skalierung der Anzahl der messbaren Parameter, die eine multidimensionale Datenanalyse und damit höhere statistische Konsequenzen ermöglicht, war der Haupttrend in der fortgeschrittenen Entwicklung der Durchflusszytometrie. Besonders das Hinzufügen hochauflösender Imaging-Fähigkeiten ermöglicht die komplexe morphologische Analyse von zellulären / subzellulären Strukturen. Dies ist bei Standard-Durchflusszytometern nicht möglich. Allerdings ist es wertvoll, unser Wissen über zelluläre Funktionen voranzubringen und kann der Life Science Forschung, der klinischen Diagnostik und der Umweltüberwachung zugute kommen. Die Einbindung von bildgebenden Fähigkeiten in die Durchflusszytometrie beeinträchtigt den Assay-Durchsatz, vor allem aufgrund der Einschränkungen der Geschwindigkeit und der Empfindlichkeit in den Kameratechnologien. Um diese Geschwindigkeits- oder Durchsatz-Herausforderung zu überwinden, die der bildgebenden Durchflusszytometrie unter Beibehaltung der Bildqualität entgegensteht, wurde die asymmetrische Erkennungszeit-Streck-Optikmikroskopie (ATOM) gezeigt, um ein kontrastreiches, einzelliges Individuum zu ermöglichenMit subzellulärer Auflösung, bei einem Bilddurchsatz bis zu 100.000 Zellen / s. Basierend auf dem bildgebenden Konzept der konventionellen Zeitstreck-Bildgebung, das durch die Verwendung von ultraschnellen Breitband-Laserpulsen auf die gesamte optische Bildcodierung und -abfrage beruht, führt ATOM die Bildgebungsleistung weiter, indem der Bildkontrast von unmarkierten / ungefärbten Zellen verbessert wird. Dies geschieht durch den Zugriff auf die Phasengradienteninformation der Zellen, die spektral in Einzelschuss-Breitbandimpulse codiert wird. Daher ist ATOM besonders vorteilhaft bei Hochdurchsatzmessungen von Einzelzellmorphologie und Textur - Information, die auf Zelltypen, Zustände und sogar Funktionen hindeutet. Letztendlich könnte dies zu einer leistungsfähigen bildgebenden Durchflusszytometrieplattform für die biophysikalische Phänotypisierung von Zellen werden, die den derzeitigen, auf dem Stand der Technik basierenden zellulären Test auf biochemischem Marker ergänzt. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Erstellung der Schlüsselmodule eines ATOM-Systems (vom optischen Frontend bis hin zu Daten pRüstungs- und Visualisierungs-Backend) sowie der Workflow der bildgebenden Durchflusszytometrie auf Basis von ATOM unter Verwendung menschlicher Zellen und Mikroalgen als Beispiele.

<html> Diese Arbeit veranschaulicht zwei Einzelzell-Imaging-Demonstrationen von ATOM: eine mit Säugetierzellen (menschliche periphere Blutmononukleäre Zellen s (PBMC) und Brustkrebszellen (MCF-7)) und eine andere mit Phytoplankton s (Scenedesmus und Chlamydomonas). Das erste Experiment wurde durch das wachsende Interesse an der Flüssigbiopsie für die Detektion, Aufzählung und Charakterisierung von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) im Blut motiviert. Die F...

Dieses Protokoll beschreibt die Implementierung eines asymmetrischen Detektions-Zeitstreck-Optikmikroskopiesystems für die Einzelzell-Bildgebung in ultraschnellen mikrofluidischen Strömung und seine Anwendungen bei der Bildgebungsdurchflusszytometrie.

Mikrofluidische Imaging-Durchflusszytometrie durch asymmetrische Detektion Zeitstreck-Optische Mikroskopie (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, ein asymmetrisches Detektions-Time-Stretch-Optikmikroskop-System zur markierungsfreien, hochkontrastigen Einzelzell-Bildgebung in ultraschnellem mikrofluidischem Durchfluss vorzubereiten und anzuwenden. Der Hauptvorteil von ATOM liegt darin, dass es ultraschnelle Bildaufnahmen mit Zeilenscangeschwindigkeiten von bis zu mehreren Megahertz ermöglicht und gleichzeitig den Bildkontrast bei ungefärbten Zellen verbessert. ATOM erlaubt die komplexe morphologische Analyse zellulärer und subzellulärer Strukturen in zentrifugierten zellbasierten Assays mit bis zu 100.000 Zellen pro Sekunde, was mit herkömmlicher Durchflusszytometrie nicht möglich ist.Um das System einzurichten, verwenden Sie einen Faserkollimator, um einen breitbandigen femto- oder pikosekunden Nah-IR-Pulslaser mit einer einmodigen dispersiven Glasfaser zu koppeln, die mit einem optischen Verstärker verbunden ist. Belichten Sie ein Transmissionstrichgitter mit dem Laser, um eine Spektraldusche zu erzeugen. Richten Sie das Gitter nahe der Littrow-Konfiguration aus, um die Beugungseffizienz zu maximieren.Konfigurieren Sie eine teleskopische Relaislinsenanordnung in einem 4f-Abbildungs-system, um die Spektraldusche auf die hintere Brennebene einer Objektivlinse unterhalb einer Probenplattform zu lenken. Stellen Sie sicher, dass die Spektraldusche die hintere Apertur des Objektivs vollständig ausfüllt. Platzieren Sie eine weitere Objektivlinse mit einem Planspiegel an ihrer hinteren Apertur oberhalb der Probenplattform.Stellen Sie die Objektivlinsen so ein, bis ihre Fokusebenen übereinstimmen. Überprüfen Sie, ob der spektrale Strahl den Bildebene doppelt durchläuft und denselben Weg zur Bewertung zurückverfolgt. Platzieren Sie einen mikrofluidischen Chip auf der Probenplattform und stellen Sie sicher, dass der spektrale Strahl über den mikrofluidischen Kanal verläuft.Leiten Sie das reflektierte Licht mit einem Strahlteiler um, nachdem es durch die Beugungsgitterplatte gelaufen ist. Trennen Sie das reflektierte Licht mit einem weiteren Strahlteiler in zwei Strahlen auf. Koppeln Sie die Strahlen mithilfe von Faserkollimatoren in Einmodenfasern unterschiedlicher Länge, um eine Zeitverzögerung zwischen den Strahlen zu erzeugen.Verbinden Sie die Fasern über einen Faserkoppler und einen Photodetektor mit einem Echtzeit-Oszilloskop. Stimmen Sie den Verstärkungsfaktor des optischen Verstärkers ab, bis das Signal-Rausch-Verhältnis des optischen Signals größer als 10 Dezibel ist. Blockieren Sie anschließend jeweils etwa die Hälfte der rückgeführten Strahlen mit scharfen Kantenblenden.Stellen Sie die Strahlblenden so ein, dass die gemessene optische Leistung in jeder Faser etwa die Hälfte der Leistung vor der Blende beträgt. Überprüfen Sie, ob Bandbreite und Abtastrate des Oszilloskops ausreichend hoch sind, um die Bildauflösung nicht zu beeinträchtigen. Verdünnen Sie die Zellproben zur Versuchsbeginn auf eine Konzentration zwischen 10⁵ und 10⁶ Zellen pro Milliliter mit gepuffertem Phosphat-Salzlösung oder Quellwasser.Anschießend die Zelllösung in eine 10-Milliliter-Spritze geben. Die Spritze mit dem Inlet des mikrofluidischen Kanals verbinden. Den Outlet des mikrofluidischen Kanals in ein Zentrifugenröhrchen leiten.Befestigen Sie die Spritze in einer Spritzenpumpe und stellen Sie die Durchflussrate entsprechend der Kanalbreite ein. Wählen Sie die Anzahl der für das Experiment zu speichernden Datenpunkte. Erfassen und speichern Sie anschließend die optischen Signaldaten.Digitalisieren und exportieren Sie die Daten vom Oszilloskop auf einen Computer. Verarbeiten Sie die Daten in 2D-Bilder und extrahieren Sie eine Bibliothek von Parametern aus den Bildern. Importieren Sie die Bilder mit der Parameterbibliothek in ein Visualisierungsprogramm.Weisen Sie jedem Achsenabschnitt einen Parameter von Interesse zu und wählen Sie den anzuzeigenden Datensatz als Streudiagramm aus. Überprüfen Sie die Zellbilder, die jeder Gruppe im Diagramm zugeordnet sind, um Trends zu identifizieren. Verwenden Sie manuelle Gating-Methoden oder zeigen Sie zusätzliche Datensätze zur weiteren Analyse nach Bedarf an.ATOM wurde verwendet, um Einzelzellbilder von menschlichen Zellen und Phytoplankton mit hohem Kontrast aufzunehmen. Charakteristische Zellstrukturen wie Vakuolen, Pyrenoiden und Geißeln sind in den Phytoplankton-Bildern sichtbar. Parameter wie Zellgröße und Rundheit wurden anhand der ATOM-Bilder bestimmt, um Zellen für die zytometrische Analyse zu klassifizieren.Die Klassifizierungsergebnisse können als 2D-Streudiagramme dargestellt werden. Hier wurde das Volumen in Abhängigkeit von der Rundheit für eine in Gelb dargestellte MCF7-Zelle und eine in Rot dargestellte PBMC-Zelle aufgetragen. Für MCF7 wurden zwei Cluster beobachtet.Indem die Bilder mit hohem Kontrast, die einzelnen Datenpunkten entsprechen, identifiziert wurden, zeigte sich, dass der untere Cluster Zellfragmenten und Zelltrümmern entspricht. Sobald das System beherrscht ist, kann es bei ordnungsgemäßer Durchführung in zwei bis drei Stunden eingerichtet werden. Die Bildgebungsverfahren können innerhalb einer Stunde durchgeführt werden.Vergessen Sie nicht, während der Arbeit mit der Laserquelle und der Ausrichtung des Laserstrahls besonders auf die Augensicherheit zu achten. Es sollten stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzbrillen getroffen werden, wenn diese Verfahren durchgeführt werden. Denken Sie daran, während des gesamten Aufbaus des Abbildungssystems die Ausrichtung des optischen Strahls zu überwachen, um eine optimale Bildqualität sicherzustellen.Während diese Technik Einblicke in die Detektion und Quantifizierung seltener oder auffälliger Zellen während eines Krankheitsprozesses ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf die Klassifizierung von Zelltypen innerhalb großer und heterogener Zellpopulationen anwenden. Diese Technik ist besonders vorteilhaft, wenn man die Durchsatzbeschränkung der Bildgebungszytometrie überwinden möchte, gleichzeitig jedoch die Bildqualität bewahren will. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ATOM von der Systemeinrichtung bis hin zu den Bildgebungsverfahren umsetzt.

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Forschung

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