Eine neue klinische Grade Isolationsmethode für menschliche Niere perivaskuläre Stromazellen Zellen

Das übergeordnete Ziel dieser klinischen Isolierungsmethode ist die Isolierung von perivaskulären Stromazellen (kPSC) der menschlichen Niere für die zelltherapeutische Behandlung verschiedener Nierenerkrankungen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der regenerativen Medizin zu beantworten, wie z.B. ein humanes kPS-Zentrum, das für die Therapie von Nierenerkrankungen und Transplantationen geeignet ist. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie klinisch ist und zur Erzeugung einer ausreichenden Anzahl von kPSCs für Zelltherapiezwecke verwendet werden kann.

Ellen Lievers, Technikerin in unserem Labor, wird die Funktionsprüfung von kPSCs demonstrieren. Bevor Sie mit der Isolierung von Nierenzellen beginnen, schließen Sie ein sterilisiertes Perfusionstablett in vertikaler Position an ein Wasserbad an. Wenn die Perfusionswanne durch das Wasser erwärmt wurde, stellen Sie die Schale in die waagerechte, aber noch mit dem Wasserbad verbundene Schale und setzen Sie dann einen L/S 25-Schlauch in die Pumpe ein.

Platzieren Sie die Kulturzange an einem Ende des Röhrchens und lassen Sie das Röhrchen auf dem Boden des Tabletts ruhen. Legen Sie sterile Gaze auf das Röhrchen, um eine Verstopfung zu vermeiden, und befestigen Sie einen Luer-Anschluss am anderen Ende des Röhrchens, geben Sie dann etwa 100 Milliliter Medium in das Tablett und beginnen Sie, das L/S 25-Röhrchen mit einer Pumpgeschwindigkeit von 100 Millilitern pro Minute zu spülen. Um die Nierenzellen zu isolieren, übertragen Sie die Niere aus den doppelt sterilen Beuteln auf die sterile Perfusionsschale und entfernen Sie mit einer Schere und leichtem Reißen das perirenale Fettgewebe und die Nierenkapsel.

An der Stelle der Nierenarterie auf dem Aortenpflaster verwenden Sie den akzessorischen Spike, um die Nierenarterie zu kanülieren, und sichern Sie den Dorn mit einer sterilisierten Krawattenbinde. Befestigen Sie bei eingeschalteter Pumpe das Pumpenrohrende am Luer-Anschluss. Und spülen Sie die Niere mit dem Medium in der Wanne mit einer Durchflussrate von 100 Millilitern pro Minute.

Geben Sie dann 20 Milliliter Kollagenase und 2,5 Milliliter DNAse in die Perfusionsschale und lassen Sie die Enzyme die Niere verdauen, indem Sie das Organ von Zeit zu Zeit vorsichtig mit der Hand drehen, bis es weich wird und die Perfusionsflüssigkeit anfängt, undurchsichtig zu werden. Die Dauer der Kollagenaseverdauung ist kritisch, eine zu kurze Dauer führt zu Zellverklumpungen, während eine zu lange Dauer zum Zelltod führt. Am Ende der enzymatischen Perfusion massieren Sie die Niere sanft, bis eine Zellsuspension erhalten wird, und entfernen Sie das unverdaute Material und den Spike.

Geben Sie 50 Milliliter normales Humanserum in die Zellsuspension und platzieren Sie dann mit der Pumpe bei niedriger Durchflussrate den mit der Niere verbundenen Schlauch über mehreren 50-Milliliter-Entnahmeröhrchen, damit die Zellsuspension aus der Perfusionsschale in die Sammelröhrchen abfließen kann. Wenn alle Zellen gesammelt wurden, zentrifugieren Sie die Zellsuspensionen und waschen Sie die Pellets zweimal mit Waschmedium, ergänzt mit 10 % normalem Humanserum. Nach dem zweiten Waschen resuspendieren Sie die Pellets in einem Volumen, das dem der Zellpellets entspricht.

Um die rohen Nierenzellen zu kultivieren, geben Sie etwa einen Milliliter Zellsuspension zu 24 Millilitern alpha-MEM 5 %-Thrombozytenlysat-Zellkulturmedium pro T 175-Zellkulturkolben und inkubieren Sie die Kolben bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Entfernen Sie nach zwei Tagen den Überstand und die Zelltrümmer und füttern Sie die Zellen mit 25 Millilitern frischem Zellkulturmedium. Wenn die Zellen konfluent sind, isolieren Sie die positive NG2-Fraktion durch magnetische Zelltrennung gemäß den Standardprotokollen.

Dann säen Sie viermal 10 bis zur dritten NG2-positiven Zellen pro Quadratzentimeter in einem Zellkulturkolben geeigneter Größe aus und stellen Sie den Kolben in den Zellkulturinkubator. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 90 bis 100 % erreichen, ernten Sie den Überstand und waschen Sie die adhärenten Zellen zweimal in PBS. Die Zellen mit dem entsprechenden Trypsinvolumen entsprechend der Kolbengröße werden abgelöst und die Reaktion mit dem reservierten Überstand nach fünf Minuten gestoppt.

Suspendieren Sie die Zellen vorsichtig, übertragen Sie dann die Zellsuspension zur Zentrifugation in ein konisches Röhrchen geeigneter Größe und plattieren Sie die Zellen mit einer viermal 10 zu den dritten Zellen pro Quadratzentimeter Dichte. Manchmal hören die Zellen nach der NG2-Anreicherung auf, sich zu vermehren, oder beginnen in 3D-Strukturen zu wachsen. Dies kann behoben werden, indem die Zellen trypsinisiert und neu plattiert werden.

Nach vier bis fünf Durchgängen wird das Aussäen der kPS-Zellen in einer Sechs-Well-Platte mit zweimal 10 x 10 Zellen pro zwei Milliliter Medium pro Well-Konzentration und das Aussäen von fünf mal 10 bis zu den fünften proximalen tubulären Epithelzellen in zwei Millilitern proximalem tubulärem Epithelzellmedium pro Vertiefung in einer separaten Sechs-Well-Platte. Legen Sie beide Platten für 48 Stunden in den Zellkultur-Inkubator, ernten Sie den kPSC-Zellüberstand am Ende der Inkubation, entfernen Sie dann den proximalen tubulären Epithelzellüberstand und verwenden Sie eine gelbe Pipettenspitze, um einen Kratzer in der Zellmonoschicht am Boden jeder Vertiefung zu hinterlassen. Waschen Sie die zerkratzten Zellen mit PBS und geben Sie die Bedingung aus den gefäßförmigen Stromazellkulturen der Niere auf Medium.

Bilden Sie dann den Kratzer nach vier, acht, 12 und 24 Stunden an der gleichen markierten Position auf einem inversen Hellfeldmikroskop ab, um den Prozentsatz des Verschlusses im Laufe der Zeit zu beurteilen. Perivaskuläre Stromazellen der Niere sind plastisch adhärente, spindelförmige Zellen, die positiv für stromale und perivaskuläre Zellmarker und negativ für die Marker CD31, CD34, CD45 und HLA-DR sind. Typischerweise kann eine homogene Population von perivaskulären Stromazellen der Niere bei Passage vier erreicht werden, wobei die Zellen um Passage neun bis 10 ihre Seneszenz erreichen.

In diesem repräsentativen Wundkratztest zur Beurteilung der Funktionsfähigkeit der kPSCs schloss sich die Wunde bei Zugabe von konditioniertem Medium aus einer perivaskulären Stromazellkultur der Niere signifikant schneller als in Vertiefungen, die mit dem Kontrollmedium kultiviert wurden. Sobald Sie die Technik der primären Isolierung beherrschen, dauert es etwa zwei Stunden, es dauert ein bis zwei Monate, um eine homogene kPSC-Population zu erzeugen. Während Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, die Kollagenase-Behandlung zu beenden, sobald die Niere weich wird und die Flüssigkeit weniger transparent wird.

Neben den hier gezeigten Verfahren könnten diese Techniken auch für die Isolierung perivaskulärer Stromazellen aus anderen festen Organen eingesetzt werden. Die mit dieser Technik isolierten kPSCs können verwendet werden, um das regenerative Potenzial dieser Zellen in verschiedenen Modellen von Nierenerkrankungen und -transplantationen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, kPSCs in klinischer Qualität zu isolieren und zu kultivieren.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Material das Risiko einer Virusübertragung birgt, treffen Sie bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie Tests auf HIV, Hepatitis B, Hepatitis C.