Eine neue klinische Grade Isolationsmethode für menschliche Niere perivaskuläre Stromazellen Zellen

Das übergeordnete Ziel dieser klinischen Isolationsmethode besteht darin, humane perivaskuläre Nierenstromazellen, oder kPSCs, für die zelltherapeutische Behandlung verschiedener Nierenerkrankungen zu isolieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der regenerativen Medizin zu beantworten, beispielsweise ob humane kPSCs für die zelluläre Therapie von Nierenerkrankungen und Transplantationen geeignet sind. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik liegen in ihrer klinischen Anwendbarkeit und der Möglichkeit, eine ausreichende Anzahl an kPSCs für zelltherapeutische Zwecke zu gewinnen.

Ellen Lievers, eine Technikerin in unserem Labor, wird die funktionelle Testung von kPSCs demonstrieren. Vor Beginn des Verfahrens zur Nierenzellisolierung verbinden Sie eine sterilisierte Perfusionswanne in vertikaler Position mit einem Wasserbad. Sobald die Perfusionswanne durch das Wasser erwärmt wurde, wechseln Sie die Wanne in die horizontale Position, wobei sie weiterhin mit dem Wasserbad verbunden bleibt, und platzieren dann ein L/S 25-Röhrchen in die Pumpe.

Platzieren Sie die Kulturpinzette an einem Ende des Schlauchs und lassen Sie den Schlauch auf dem Boden des Tabletts ruhen. Legen Sie steriles Mulltuch auf den Schlauch, um eine Verstopfung zu verhindern, und befestigen Sie einen Luer-Verbinder am anderen Ende des Schlauchs. Geben Sie anschließend etwa 100 Milliliter Medium in das Tablett und beginnen Sie, den L/S-25-Schlauch mit einer Pumpgeschwindigkeit von 100 Milliliter pro Minute zu spülen. Um die Nierenzellen zu isolieren, überführen Sie die Niere aus den doppelt sterilen Beuteln auf das sterile PerfusionsTablett und entfernen Sie mit einer Schere und vorsichtigem Zerreißen das perirenale Fettgewebe und die Nierenkapsel.

Nachdem die Niere an der Aortenpflaster lokalisiert wurde, verwenden Sie die zusätzliche Spitze, um die Nierenarterie zu kanülieren, und sichern Sie die Spitze mit einem sterilisierten Kabelbinder. Schließen Sie bei laufender Pumpe das Pumpe-Schlauchende an den Luer-Verbinder an. Spülen Sie die Niere dann mit dem Medium in der Schale mit einer Flussrate von 100 Milliliter pro Minute aus.

Fügen Sie als Nächstes 20 Milliliter Kollagenase und 2,5 Milliliter DNAse in die Perfusionswanne hinzu und lassen Sie die Enzyme die Niere verdauen, wobei Sie das Organ von Zeit zu Zeit vorsichtig von Hand umdrehen, bis es weich wird und die Perfusionsflüssigkeit trüb zu werden beginnt. Die Dauer der Kollagenase-Verdauung ist entscheidend; zu kurz führt zu Zellklumpen, zu lang hingegen zu Zelltod. Am Ende der enzymatischen Perfusion massieren Sie die Niere vorsichtig, bis eine Zellsuspension erhalten ist, und entfernen Sie das undigestierte Material sowie die Spitze.

Geben Sie 50 Milliliter normales humanes Serum zur Zellsuspension hinzu und platzieren Sie dann bei niedriger Fließgeschwindigkeit der Pumpe das mit der Niere verbundene Rohr über mehrere 50-Milliliter-Sammelröhrchen, um die Zellsuspension aus der Perfusionswanne in die Sammelröhrchen ablaufen zu lassen. Sobald alle Zellen gesammelt wurden, zentrifugieren Sie die Zellsuspensionen und waschen die Pellets zweimal mit Waschmedium, das mit 10 % normalem humanem Serum ergänzt ist. Nach dem zweiten Waschschritt resuspendieren Sie die Pellets in einem Volumen Zellkulturmedium, das dem Volumen der Zellpellets entspricht.

Um die rohen Nierenzellen zu kultivieren, geben Sie etwa ein Milliliter Zellsuspension pro T175-Zellkulturschale zu 24 Millilitern alpha-MEM mit 5 % Thrombozytenlysat-Zellkulturmedium hinzu und inkubieren Sie die Schalen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Entfernen Sie nach zwei Tagen das Überstand und die Zelltrümmer und versorgen Sie die Zellen mit 25 Millilitern frischem Zellkulturmedium. Wenn die Zellen konfluent sind, isolieren Sie den NG2-positiven Anteil mittels magnetischer Zellseparation gemäß Standardprotokollen.

Seihe dann vier mal 10 hoch drei NG2-positive Zellen pro Quadratzentimeter in eine Zellkulturflasche geeigneter Größe aus und stellen Sie die Flasche in den Zellkulturinkubator. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 90 bis 100 % erreicht haben, gewinnen Sie das Überstandmedium und waschen die anhaftenden Zellen zwei Mal mit PBS. Lösen Sie die Zellen mit dem entsprechenden Volumen an Trypsin gemäß der Flaschengröße ab und beenden Sie die Reaktion nach fünf Minuten mit dem aufbewahrten Überstandmedium.

Suspenderen Sie die Zellen vorsichtig und überführen Sie die Zellsuspension in ein passend dimensioniertes kegelförmiges Reagenzglas zur Zentrifugation. Impfen Sie die Zellen anschließend mit einer Dichte von vier mal 10 hoch drei Zellen pro Quadratzentimeter erneut aus. Manchmal stellen die Zellen nach der NG2-Anreicherung die Proliferation ein oder beginnen, in dreidimensionalen Strukturen zu wachsen. Dies kann behoben werden, indem die Zellen mit Trypsin behandelt und erneut ausgesät werden.

Nach vier bis fünf Passagen die kPSCs in einer 6-Loch-Platte mit jeweils zwei mal 10 hoch 5 Zellen pro zwei Milliliter Medium pro Loch ausplattieren und fünf mal 10 hoch 5 proximale tubuläre Epithelzellen in zwei Milliliter proximalen tubulären Epithelzellmedium pro Loch in einer separaten 6-Loch-Platte aussäen. Beide Platten 48 Stunden im Zellkulturinkubator inkubieren, anschließend das Überstandmedium der kPSCs am Ende der Inkubation gewinnen, den Überstand der proximalen tubulären Epithelzellen entfernen und mit einer gelben Pipettenspitze einen Strich in die Zellmonoschicht am Boden jedes Lochs ziehen. Die angeritzten Zellen mit PBS waschen und das konditionierte Medium aus den Nieren-vaskulären stromalen Zellkulturen hinzufügen.

Danach die Verletzung nach vier, acht, 12 und 24 Stunden an derselben markierten Position auf einem umgekehrten Hellfeldmikroskop aufnehmen, um den Prozentsatz der Schließung über die Zeit zu bewerten. Nierenperivaskuläre Stromazellen sind plastikadhärente, spindelförmige Zellen, die positiv für Stromazell- und perivaskuläre Markermoleküle sind und negativ für die Marker CD31, CD34, CD45 und HLA-DR. Typischerweise kann eine homogene Population von Nierenperivaskulärstromazellen im vierten Durchgang erreicht werden, wobei die Zellen im neunten bis zehnten Durchgang in Seneszenz eintreten.

Bei diesem repräsentativen Wund-Scratch-Assay zur Beurteilung der funktionellen Kapazität der kPSCs schloss sich die Wunde signifikant schneller, nachdem konditioniertes Medium aus einer Nieren-perivaskulären Stromazellkultur hinzugefügt worden war, im Vergleich zu Vertiefungen, die mit Kontrollmedium kultiviert wurden. Sobald die primäre Isolationsmethode beherrscht ist, dauert diese etwa zwei Stunden; für die Erzeugung einer homogenen kPSC-Population benötigen Sie ein bis zwei Monate. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die Kollagenase-Behandlung sofort zu beenden, sobald die Niere weich wird und die Flüssigkeiten weniger transparent erscheinen.

Neben den hier gezeigten Verfahren könnten diese Techniken auch zur Isolierung perivaskulärer Stromazellen aus anderen soliden Organen verwendet werden. Die mit dieser Methode isolierten kPSCs können genutzt werden, um das regenerative Potenzial dieser Zellen in verschiedenen Modellen von Nierenerkrankungen und Transplantationen zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie in der Lage sein, kPSCs auf klinischem Standard zu isolieren und zu kultivieren.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Material das Risiko einer Virusübertragung birgt; treffen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie Tests auf HIV, Hepatitis B und Hepatitis C, wenn Sie dieses Verfahren durchführen.